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UePep1对菰黑粉菌致病力的调控作用

农业生物技术学报 2024年第7期32卷 1614-1625页

作者：黄琳钰汤近天夏文强崔海峰叶子弘张雅芬中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)专性侵染菰(Zizania latifolia)后可诱导形成膨大肉质茎—茭白，且菰黑粉菌的致病力与茭白的表型、产量等密切相关。穿透过程必需蛋白1 (protein essential during penetration 1, Pep1)作为真菌效应因子... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)专性侵染菰(Zizania latifolia)后可诱导形成膨大肉质茎—茭白，且菰黑粉菌的致病力与茭白的表型、产量等密切相关。穿透过程必需蛋白1 (protein essential during penetration 1, Pep1)作为真菌效应因子，在黑粉菌属(Ustilago)真菌的致病力调控上起着重要作用。本研究先通过BLASTP定位及基因克隆分析，获得了菰黑粉菌中Pep1的同源蛋白编码基因UePep1 (GenBank No. OR088111)，其开放阅读框为528 bp，编码175个氨基酸，无内含子序列。进一步通过PEG介导的原生质体转化方法构建UePep1的敲除突变体，进行体外生长及侵染试验，发现该基因的缺失不影响菰黑粉菌单倍体形态与生长速率，也不影响体外菌丝形成与丝状生长能力，但显著减缓了菰黑粉菌入侵菌丝的增殖，无法诱导寄主形成膨大肉质茎。进一步将UePep1回补至玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)SG200ΔPep1菌株中，部分恢复了SG200ΔPep1菌株的侵染力，表明UePep1是玉米瘤黑粉菌Pep1的功能性互补蛋白。上述研究明确了UePep1在菰黑粉菌致病力调控中的作用，同时进一步证实了该效应因子在黑粉菌属真菌中功能的保守性，为研究菰黑粉菌与菰互作机制进而解析膨大肉质茎形成机理提供借鉴和理论支持。

关键词：菰黑粉菌穿透过程必需蛋白1(Pep1) 菰致病性

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菰黑粉菌T-DNA突变体库的构建及分析

菌物学报 2023年第2期42卷 495-506页

作者：汤近天杨芙容张雅芬夏文强崔海峰叶子弘中国计量大学生命科学学院、浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室浙江杭州310018

通过建立适用于菰黑粉菌Ustilago esculenta的农杆菌介导遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)体系,构建菰黑粉菌T-DNA插入突变体库。针对性地筛选双核菌丝形成缺陷型转化子,并对T-DNA插入位点进行分析,... 详细信息

通过建立适用于菰黑粉菌Ustilago esculenta的农杆菌介导遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)体系,构建菰黑粉菌T-DNA插入突变体库。针对性地筛选双核菌丝形成缺陷型转化子,并对T-DNA插入位点进行分析,为研究菰黑粉菌二态型转换的分子调控机理打下基础。以构建的菰黑粉菌自融合菌株TSP为出发菌株,以含有遗传霉素(G418)抗性基因(neo)的质粒为载体,通过ATMT构建菰黑粉菌T-DNA突变体库,并对诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度、转化的共培养时间、农杆菌浓度和菰黑粉菌芽孢子浓度等建库影响因素进行单因素条件试验,筛选最优条件;对继代培养的转化子基因组中的遗传霉素抗性基因进行PCR检测,验证转化子遗传稳定性;对突变体库中的转化子双核菌丝生长情况进行观察,测定其双核菌丝形成能力;对上述双核菌丝形成缺陷型转化子进行基因组重测序,分析其T-DNA插入位点。当遗传霉素浓度为75μg/mL时,菰黑粉菌的生长被完全抑制。当AS浓度为100μg/mL、共培养时间为24 h、孢子浓度为1×10^(5)个/mL、农杆菌浓度为OD600=0.3时,转化获得转化子的效率最高,为菰黑粉菌ATMT最优转化体系。在突变体库中随机选取7株转化子在YEPS固体平板上继代培养10代,仍然能够通过PCR的方法在基因组中检测到neo基因片段,说明T-DNA成功插入TSP菌株基因组且稳定遗传。针对部分转化子进行双核菌丝生长能力测定,有5株转化子的菌落边缘没有形成菌丝,而TSP菌株的边缘长出了明显的菌丝,说明这5株转化子双核菌丝形成的能力丧失。对上述双核菌丝形成缺陷型转化子中的其中2个(TSP-1、TSP-23)进行基因组重测序,比对结果显示,TSP-1插入位点位于其交配型基因a位点的(GenBank:MK097140.1)mfa2.1基因的外显子区域,TSP-23插入位点位于两个假定蛋白之间。本研究优化了菰黑粉菌ATMT遗传转化体系,构建了菰黑粉菌T-DNA插入突变体库;筛选到双核菌丝生长缺陷型突变体,并通过基因组重测序的手段明确了相关突变体的T-DNA插入位点,为后续菰黑粉菌二型态转换的调控机理研究奠定了一定的基础。

关键词：菰黑粉菌 T-DNA插入突变体双核菌丝二态型转换

菰黑粉菌的分离鉴定及其发酵液中植物激素的检测

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菌物学报 2010年第2期29卷 178-184页

作者：尤文雨邹克琴俞晓平刘倩安欣欣赵煦泓叶子弘中国计量学院生命科学学院杭州310018

在显微镜下观察孢子形态,并观察单菌落的形态和菌株的微观形态,PCR扩增其ITS-5.8S rDNA序列,测序并在NCBI中进行同源比较,确定其种属。液体培养该菌株,通过高效液相色谱法检测发酵液中植物激素。结果表明:用菌落形态与孢子形态鉴定和分... 详细信息

在显微镜下观察孢子形态,并观察单菌落的形态和菌株的微观形态,PCR扩增其ITS-5.8S rDNA序列,测序并在NCBI中进行同源比较,确定其种属。液体培养该菌株,通过高效液相色谱法检测发酵液中植物激素。结果表明:用菌落形态与孢子形态鉴定和分子生物学鉴定的方法,对茭白中分离的一个菌株鉴定为菰黑粉菌,且在其发酵液中检测到植物激素IAA、ABA和GA3,其中IAA含量为0.1306mg/L,ABA含量为0.01367mg/L。

关键词：菰黑粉菌形态分子鉴定 HPLC

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菰黑粉菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择及应用

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农业生物技术学报 2021年第2期29卷 402-412页

作者：葛鑫涛殷淯梅高丽丹胡映莉夏文强叶子弘汤近天张雅芬中国计量大学生命科学学院

茭白是禾本科植物菰(Zizania latifolia)受到菰黑粉菌(Ustilago esculenta)入侵后形成的膨大可食用肉质茎,选取适用于实时荧光定量PCR分析的内参基因,对于研究菰黑粉菌与菰互作过程中的基因表达变化十分重要。本研究选择8个候选基因,利... 详细信息

茭白是禾本科植物菰(Zizania latifolia)受到菰黑粉菌(Ustilago esculenta)入侵后形成的膨大可食用肉质茎,选取适用于实时荧光定量PCR分析的内参基因,对于研究菰黑粉菌与菰互作过程中的基因表达变化十分重要。本研究选择8个候选基因,利用qRT-PCR方法检测候选基因在菰黑粉菌侵染的5个不同时间点、体外培养的5个生活阶段、3种不同的碳源培养基和4个温度条件培养下的表达量,使用3个软件geNorm、NormFinder和BestKeeper对候选基因的表达稳定性进行分析,筛选适宜菰黑粉菌在不同生活阶段和不同生活环境下基因表达水平分析的内参基因,并用菰黑粉菌内切葡聚糖酶1 (U. esculenta endoglucanase 1, UeEgl1)作为测试基因进行验证。结果表明,3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)和α微管蛋白基因(α-tubulin)在所有条件样品中的表达均较稳定,是适宜菰黑粉菌基因表达分析的内参基因。本研究结果可为菰黑粉菌中基因差异表达分析提供有效的校正工具,确保基因表达结果的准确性和可靠性,为进一步分析菰黑粉菌与菰互作过程中相关基因的功能提供参考依据。

关键词：菰黑粉菌内参基因荧光定量PCR

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菰黑粉菌UePkaC基因的克隆及功能研究

农业生物技术学报 2020年第8期28卷 1477-1489页

作者：王培又张雅芬葛倩雯夏文强崔海峰俞晓平叶子弘中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种二态性真菌,具有侵染菰(Zizania latifolia)植株的能力,并可使植株茎部膨大形成茭白。二型态转换对菰黑粉菌的侵染能力及致病性至关重要。促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, M... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种二态性真菌,具有侵染菰(Zizania latifolia)植株的能力,并可使植株茎部膨大形成茭白。二型态转换对菰黑粉菌的侵染能力及致病性至关重要。促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号级联途径和环化腺苷酸介导的蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A, cAMP-PKA)信号转导途径是真菌二型态转换的核心。本研究发现,外源添加cAMP后单倍体出现多位点芽殖现象,且融合菌丝生长受到影响。进一步克隆得到了编码菰黑粉菌PKA催化亚基的基因UePkaC (PkaC like protein in Ustilago esculenta)基因(GenBank ***870334.1)。序列分析结果显示,该基因全长1 346 bp,有1个内含子,两个外显子构成大小为1 233 bp的开放阅读框,编码410个氨基酸。该氨基酸序列与其他物种中PKA催化亚基的氨基酸序列同源,如大麦坚黑粉菌(U. hordei)、玉米瘤黑粉菌(U. maydis)。表达模式分析发现:UePkaC在菌丝融合生长过程中上调表达;对UePkaC缺失突变体表型分析发现其变长且无融合生长能力和致病性。进一步研究发现,UePkaC突变后无法形成接合管,且信息素合成基因表达受到显著抑制,表明UePkaC基因通过调控a基因的表达从而影响接合管的形成与细胞融合。以上结果表明,UePkaC基因在菰黑粉菌单倍体生长及二型态转换中起着关键作用。该研究为探讨菰黑粉菌的致病机理提供了基础资料。

关键词：菰黑粉菌 UePkaC 融合 a基因 cAMP-PKA信号通路

菰黑粉菌MAPKK同源基因UeMkk1的全长克隆及表达

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农业生物技术学报 2016年第3期24卷 406-415页

作者：胡鹏张雅芬崔海峰应荣刘俊平叶子弘中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是菰(Zizania latifolia)植株体内的内生真菌,其二型态转换与茭白孕茭密切相关,而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途径在真菌二型态转换中具有重要调控作用。本研究利用酵母型... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是菰(Zizania latifolia)植株体内的内生真菌,其二型态转换与茭白孕茭密切相关,而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途径在真菌二型态转换中具有重要调控作用。本研究利用酵母型及菌丝型菰黑粉菌的差异蛋白表达及转录组分析数据,克隆了菰黑粉菌中一个丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase,MAPKK)基因Ue Mkk1(Gen Bank登录号:KR870332)。该基因c DNA序列全长2 204 bp,开放阅读框2 043 bp。与模式菌酵母的MAPK途径蛋白进行聚类分析表明,Ue Mkk1属于MAPKK蛋白,NCBI中Blast比对结果及进一步的系统发育分析表明,Ue Mkk1与黑粉菌属真菌的Mkk1同源性较高,其中与大麦坚黑穗病菌(Ustilago hordei)的MKK1一致性达到84%,其丝/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化结构域在不同真菌中高度保守。同时,本研究通过大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统成功表达并从蛋白裂解上清液中纯化得到了纯度较高的Ue Mkk1蛋白。另外,对不同碳源诱导后菰黑粉菌的生长特征观察及Ue Mkk1的表达分析表明,蔗糖能诱导菰黑粉菌菌丝的形成及生长,Ue Mkk1的表达量在菌丝生长后期下调表达;PDA、葡萄糖及麦芽糖培养基中菰黑粉菌保持酵母型生长,Ue Mkk1呈周期性上调表达。以上研究工作为进一步开展Ue Mkk1基因的功能研究,阐明其在菰黑粉菌二型态转换及茭白孕茭中的作用提供了基础材料。

关键词：菰黑粉菌 Ue Mkk1 丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK) 细胞壁完整性

菰黑粉菌MAPK同源基因UeKss1的克隆及表达

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植物病理学报 2016年第5期46卷 634-644页

作者：张雅芬胡鹏崔海峰应荣刘俊平余佳佳俞晓平叶子弘中国计量学院生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

菰黑粉菌作为茭白植株体内的内生真菌,其二型态转换与茭白孕茭密切相关,而MAPK途径在真菌二型态转换中具有重要调控作用。本研究在菰黑粉菌中克隆得到了一个MAPK基因UeKss1,通过与酵母菌中的MAPK途径蛋白进行聚类分析表明其属于Kss1的... 详细信息

菰黑粉菌作为茭白植株体内的内生真菌,其二型态转换与茭白孕茭密切相关,而MAPK途径在真菌二型态转换中具有重要调控作用。本研究在菰黑粉菌中克隆得到了一个MAPK基因UeKss1,通过与酵母菌中的MAPK途径蛋白进行聚类分析表明其属于Kss1的同源蛋白。进一步的系统进化分析表明,UeKss1与黑粉菌属真菌的Kss1同源性最高,达80%以上,且它的丝/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化结构域高度保守。不同碳源诱导下菰黑粉菌的生长特征及UeKss1表达分析发现,只有蔗糖培养基能诱导菰黑粉菌菌丝形成,而在PDA、葡萄糖和麦芽糖培养基中,该菌都保持酵母型生长;UeKss1基因的表达量在PDA和葡萄糖培养基中变化不显著,但在麦芽糖培养基中,该基因的表达随着培养时间的延长持续上调表达,而在蔗糖培养基中,UeKss1的表达量虽然也呈现上升趋势,但是远小于麦芽糖的诱导表达量。对UeKss1进行的原核表达纯化,经Western blot验证得到纯度较高的UeKss1蛋白。研究结果可为UeKss1基因的功能研究,阐明其在菰黑粉菌二型态转换中的作用机制提供帮助。

关键词：菰黑粉菌 UeKss1 丝裂原活化蛋白激酶二型态转换

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菰黑粉菌UeCS3.1基因的克隆及功能研究

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农业生物技术学报 2019年第8期27卷 1467-1477页

作者：吴敏张雅芬夏文强胡鹏陈玥俞晓平叶子弘中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种典型的二态性真菌,与菰(Zizania latifolia)互作诱导其茎部膨大,形成可食用的肉质茎—茭白,成为我国传统的水生蔬菜。几丁质(chitin)是真菌细胞壁的重要组成成分,其合成过程涉及7类几丁质合成酶(chit... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种典型的二态性真菌,与菰(Zizania latifolia)互作诱导其茎部膨大,形成可食用的肉质茎—茭白,成为我国传统的水生蔬菜。几丁质(chitin)是真菌细胞壁的重要组成成分,其合成过程涉及7类几丁质合成酶(chitin synthase, CS)基因,参与调控真菌的生长发育及致病性。有研究报道,第3类几丁质合成酶对部分丝状真菌的菌丝生长和致病性起着关键作用。本研究基于菰黑粉菌的全基因组序列,克隆得到了菰黑粉菌第3类几丁质合成酶基因(UeCS3.1)(GenBank No. KU302676),该基因序列全长3 054 bp,含有1个内含子。ORF编码框为2 751 bp,编码916个氨基酸。UeCS3.1具有2个催化结构域Chitin-synth-1 (pfam01644)、Chitin-synth-1N (pfam08407)和7个跨膜区,进化树分析表明UeCS3.1与玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)的Umchs1近源。表达模式分析发现,UeCS3.1在菰黑粉菌芽殖以及菌丝融合生长过程中均上调表达,而且UeCS3.1缺失突变体的菌丝融合生长能力明显减弱。以上结果表明,UeCS3.1基因可能在菌丝融合生长过程中起着关键作用。本研究初步探究了菰黑粉菌第3类几丁质合成酶基因在菌丝融合生长过程中的作用,为菰黑粉菌的致病机理研究提供基础材料。

关键词：菰黑粉菌菰菰黑粉菌第3类几丁质合成酶基因(UeCS3.1) 几丁质合成酶融合

基于TaqMan探针实时荧光PCR的菰黑粉菌分型检测方法

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植物生理学报 2023年第8期59卷 1616-1625页

作者：李士玉杨梦飞夏文强张雅芬汤近天崔海峰叶子弘李怡鹏张尚法张中进王书卿中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室杭州310018 金华市农业科学研究院(浙江省农业机械研究院) 浙江省特色水生蔬菜育种与栽培重点实验室浙江金华321000

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种专性寄生植物茭白(Zizania latifolia)的活体营养型真菌,菌丝态菰黑粉菌(MT型)侵染茭白后可以使植株茎部膨大形成可食用肉质茎,即茭白。田间种植中还存在冬孢子态菰黑粉菌(T型),其侵染形成的膨大肉... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种专性寄生植物茭白(Zizania latifolia)的活体营养型真菌,菌丝态菰黑粉菌(MT型)侵染茭白后可以使植株茎部膨大形成可食用肉质茎,即茭白。田间种植中还存在冬孢子态菰黑粉菌(T型),其侵染形成的膨大肉质茎内布满黑色冬孢子,无法食用,称作灰茭。为及早发现并去除灰茭植株,本研究对比了T型与MT型菰黑粉菌内转录间隔区序列(ITS),利用ITS上的单核苷酸多态性位点设计TaqMan探针与引物。本研究筛选得到了具有良好特异性的TaqMan探针及引物,优化了反应体系中的引物浓度与探针浓度,建立并优化了菰黑粉菌分型鉴定方法。该方法不受植物基因组DNA等基质影响,且菰黑粉菌基因组浓度在0.5~2000 ng·L^(-1)范围内时,结果具有良好的线性关系,判定系数(R^(2))>0.99。通过该方法对植物中T型和MT型菰黑粉菌分型定量,可以在茭白种植早期发现将结灰茭的植株,为灰茭预防及栽培措施改良提供新的参考。

关键词：茭白灰茭菰黑粉菌实时荧光定量PCR

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