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基于AuNCs-MnO2 NFs的荧光免疫法构建及在杀螟硫磷高灵敏检测中的应用研究

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基于AuNCs-MnO2 NFs的荧光免疫法构建及在杀螟硫磷高灵敏检测中的...

作者：吕婷吉林大学

学位级别：硕士

杀螟硫磷(Fenitrothion,FNT)是一种可通过控制昆虫损坏行为来保护农作物的有机磷农药,因其成本低、性能好被广泛应用,但不当的使用会导致水体、土壤、农作物的污染,进而增加通过食物链进入人体的可能,危害人类健康。杀螟硫磷可在人体内... 详细信息

杀螟硫磷(Fenitrothion,FNT)是一种可通过控制昆虫损坏行为来保护农作物的有机磷农药,因其成本低、性能好被广泛应用,但不当的使用会导致水体、土壤、农作物的污染,进而增加通过食物链进入人体的可能,危害人类健康。杀螟硫磷可在人体内通过抑制乙酰胆碱酯酶活性,导致神经肌肉系统中毒,甚至影响男性生殖健康。因此,基于对人类健康和公共卫生安全的考虑,开发杀螟硫磷的快速检测方法具有重要现实意义。目前,用于检测杀螟硫磷的方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、电化学传感、荧光传感等,上述方法均具有各自的优势,但在实现农作物、食品等复杂基质的快速检测方面也存在各自的缺陷,如依赖大型仪器和高水平操作人员、成本高、前处理复杂、抗干扰能力差等。为弥补上述缺陷,本文利用合成简单、荧光性能良好的金纳米簇-二氧化锰纳米片(Gold nanoclusters anchored manganese dioxide nanoflakes,Au NCs-Mn O NFs),结合碱性磷酸酶标记的杀螟硫磷纳米抗体(Nanobody against FNT linked-alkaline phosphatase,Nb-FNT-ALP)的竞争型免疫识别,构建了一种灵敏度高、抗干扰能力强的荧光免疫分析法,并成功应用于不同实际样品中的杀螟硫磷检测。除此之外,利用该方法对白菜中杀螟硫磷的残留和降解进行了探究,为实现有机磷农药在复杂基质中的快速检测提供了新思路。本文主要研究内容如下:1.建立基于AuNCs-MnO NFs的荧光信号响应平台。利用金纳米簇(Gold nanoclusters,Au NCs)锚定二氧化锰纳米片(Manganese dioxide nanoflakes,Mn O NFs)时会导致Au NCs荧光猝灭的机理,结合碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的高效催化特性,搭建稳定的荧光信号响应平台。ALP可以催化L-抗坏血酸-2-磷酸(L-ascorbic acid-2-phosphate,AAP)水解生成抗坏血酸(Ascorbic acid,AA),AA的强还原性会导致Mn O NFs的分解,从而恢复Au NCs被猝灭的荧光。在最佳条件下,基于Au NCs-Mn O NFs构建的荧光信号响应平台检测ALP的线性范围为0.001-1 U/L(R=0.9942),表明荧光信号响应平台构建成功。同时,该检测平台对生物样本中常见的干扰物质具有强抗干扰能力,可作为稳定的荧光信号响应平台。2.构建荧光免疫分析法用于杀螟硫磷高灵敏检测。利用上述构建的荧光信号响应平台,结合Nb-FNT-ALP免疫识别体系,建立荧光免疫分析方法检测杀螟硫磷。在免疫识别体系中,将抗原包被于96孔板上。通过杀螟硫磷和包被抗原对Nb-FNT-ALP的竞争型免疫反应,与包被抗原成功结合的Nb-FNT-ALP经洗涤后留于96孔板上。然后,利用ALP触发荧光信号响应,通过荧光信号的变化实现目标物的定量检测。在最优实验条件下,杀螟硫磷检出限(IC)为5.78 pg/m L,与相同实验条件下的传统比色免疫法相比,灵敏度提高了约56倍。本方法成功应用于自来水、江水、苹果、白菜、生菜、大米、西红柿7种实际样品中杀螟硫磷的检测,回收率为90.49-107.21%,相对标准偏差(Relative standard deviations,RSDs)≤7.45%。同时,该方法实现了对白菜叶和根中杀螟硫磷的残留和降解监测。该方法在应用过程中表现出灵敏度高、抗干扰能力强和重现性好等特点,为有机磷农药在复杂基质中的检测方法的构建提供新方案。

关键词：杀螟硫磷碱性磷酸酶金纳米簇-二氧化锰纳米片纳米抗体荧光免疫法

基于量子点检测鸡蛋腐败菌荧光免疫法的建立及其条件优化

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基于量子点检测鸡蛋腐败菌荧光免疫法的建立及其条件优化

作者：余锦露华中农业大学

学位级别：硕士

鸡蛋具有丰富的营养价值,是人们生活中必不可少的食品,因此鸡蛋的安全备受研究者的关注,导致鸡蛋发生安全事件的病原菌常见的有沙门氏菌、变形杆菌和大肠杆菌等,对于这些致病菌的检测方法的研究已经很多,而对于引起鸡蛋腐败的腐败菌(如... 详细信息

鸡蛋具有丰富的营养价值,是人们生活中必不可少的食品,因此鸡蛋的安全备受研究者的关注,导致鸡蛋发生安全事件的病原菌常见的有沙门氏菌、变形杆菌和大肠杆菌等,对于这些致病菌的检测方法的研究已经很多,而对于引起鸡蛋腐败的腐败菌(如戴尔福特菌、彭氏变形杆菌等)的研究相对较少,并且鸡蛋在存贮过程中常常发生由这些菌引起的腐败,导致较大的经济损失,因此,对这些腐败菌建立快速、简便的检测方法非常必要。荧光免疫法(FLISA法)是一种高灵敏度、操作简单且准确度较高的检测方法,而量子点因其较高的荧光性和稳定性,逐渐广泛应用于荧光免疫法中。在本研究中,选取从鸡蛋中分离的戴尔福特菌和彭氏变形杆菌为研究对象,建立一种可用于快速检测鸡蛋腐败菌的FLISA法,并与具有相似原理和操作过程的ELISA法进行比较,为微生物的检测提供了一个新思路。本研究的研究内容包括:水溶性CdTe:Zn/ZnSQDs的制备:通过水相合成法成功制备CdTe:Zn/ZnSQDs,并对其合成条件进行了优化,优化结果如下:[Cd]/[Te]=5:1,[Cd]/[Zn]/[MPA]=1:1.5:3.6,反应体系的pH为7.5,CdTe:ZnQDs回流温度为100℃,回流时间为2.5h,锌前驱体与硫前驱体的最佳的加入方式为先锌前驱体,后硫前驱体;ZnS包裹CdTe:ZnQDs的最佳回流温度为85℃,回流时间为3.5 h。在此合成条件下制备的CdTe:Zn/ZnSQDs的荧光量子产率为40.78%。由TEMs图可知,CdTe:Zn/ZnSQDs较CdTe:ZnQDs具有较好的分散性,且CdTe:Zn/ZnSQDs是由晶体呈直线有序排列而成,粒径约为3 nm。另外,由稳定性实验可知,CdTe:Zn/ZnSQDs比CdTe:ZnQDs具有较好的稳定性,在避光条件下,存放第50 d的CdTe:Zn/ZnSQDs的荧光强度为最初的84.26%,而CdTe:ZnQDs的荧光强度为最初的55.33%。多克隆抗体的制备:热灭活的戴尔福特菌CM13和彭氏变形杆菌通过皮下5点注射法分别免疫新西兰大白兔三个月获得血清,采用间接ELISA法测定血清的效价均为1:51200,经过纯化后,戴尔福特菌CM13多克隆抗体和彭氏变形杆菌多克隆抗体的效价分别为1:12800和1:25600。多克隆抗体所含蛋白质浓度分别为2.90 mg/mL和3.40 mg/mL,分子量均约为148 k D。戴尔福特菌CM13多克隆抗体和彭氏变形杆菌多克隆抗体与大肠杆菌O157:H7,宋内氏志贺氏菌,铜绿假单胞菌,枯草芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌,单增李斯特菌不发生反应,戴尔福特菌CM13多克隆抗体与彭氏变形杆菌之间不发生反应,彭氏变形杆菌多克隆抗体与戴尔福特菌CM13之间不发生反应,表明所制备的戴尔福特菌CM13多克隆抗体与彭氏变形杆菌多克隆抗体均具有较好的特异性。CdTe:Zn/ZnSQDs与抗体偶联:由荧光发射光谱可知,CdTe:Zn/ZnSQDs与抗体的偶联物的荧光强度较CdTe:Zn/ZnSQDs增强了30 a.u.;由紫外吸收光谱可知,抗体与CdTe:Zn/ZnSQDs偶联后,其在280 nm处的特征吸收峰消失,且偶联物的吸收强度较单纯的CdTe:Zn/ZnSQDs溶液增强,初步判定CdTe:Zn/ZnSQDs与抗体偶联成功,并由琼脂糖凝胶紫外荧光图和TEM进一步验证了CdTe:Zn/ZnSQDs与抗体成功偶联。由斑点印迹实验可知,抗体与CdTe:Zn/ZnSQDs偶联后,仍保持其生物活性,且随着抗原量的增加,斑点在紫外照射下的亮度增强。CdTe:Zn/ZnSQDs与抗体的最佳的偶联条件为:活化剂EDC·HCI(0.1mol/L)和偶联剂NHs(0.1mol/L)的最适添加量分别为80μL和60μL;与抗体偶联的最佳反应pH为9.0;抗体(1mg/mL)的最适添加量为120μL,最佳反应时间为2 h。CdTe:Zn/ZnSQDs与抗体的偶联率为53%。CdTe:Zn/ZnSQDs-抗体偶联物可置于4℃避光贮存2个月。荧光免疫法(FLISA法)检测鸡蛋腐败菌的研究:采用FLISA法检测鸡蛋腐败菌,并与ELISA法进行比较。首先,对ELISA法和FLISA法检测条件进行优化,ELISA法最佳条件为:封闭剂为10%BSA,封闭时间为2.0 h,兔血清稀释度为1:3200,反应时间为1.0 h,羊抗兔IgG-HRP稀释度为1:5000,反应时间为1.0 h,OPD显色时间为10 min。FLISA法检测最佳条件为:封闭剂为10%BSA,封闭时间为1.5 h,兔血清浓度为1.5 mg/mL,反应时间为1.5 h,CdTe:Zn/ZnSQDs标记的羊抗兔IgG的添加量为300μL,反应时间为1.5 h,过量的CdTe:Zn/ZnSQDs标记的羊抗兔

关键词：锌掺杂碲化镉/硫化锌量子点戴尔福特菌CM13 彭氏变形杆菌多克隆抗体荧光免疫法

荧光免疫法、ELISA法与PCR在婴幼儿腹泻常见病毒检测中的价值

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广东医学院学报 2016年第6期34卷 606-608页

作者：陈敏冯文聪广东医科大学病原生物学实验室广东东莞523800 广东省东莞市大岭山医院检验科广东东莞523800

目的探讨荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法与聚合酶链式反应(PCR)检测婴幼儿腹泻常见病毒的结果与一致性。方法对急性腹泻婴幼儿61例分别用荧光免疫法、ELISA法、PCR技术对患儿粪便标本中肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒及诺如病... 详细信息

目的探讨荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法与聚合酶链式反应(PCR)检测婴幼儿腹泻常见病毒的结果与一致性。方法对急性腹泻婴幼儿61例分别用荧光免疫法、ELISA法、PCR技术对患儿粪便标本中肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒及诺如病毒抗原进行检测。结果荧光免疫法肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒及诺如病毒抗原阳性检出率分别为11.48%、11.48%、6.56%及13.11%;ELISA法上述病毒抗原阳性检出率分别为1.64%、27.87%、13.11%及29.51%,PCR上述病毒抗原阳性检出率分别为26.23%、1.64%、1.64%、1.64%。荧光免疫法与ELISA法对比,轮状病毒、诺如病毒抗原阳性检出率差异均有统计学意义(P法检测结果有较好一致性;荧光免疫法同PCR对比,肠道腺病毒、诺如病毒抗原阳性检出率差异有统计学意义(P法检测结果有较好一致性;ELISA法与PCR对比,4种病毒抗原阳性检出率差异均有统计学意义(P法检测结果有较好一致性。结论 ELISA法与PCR对婴幼儿腹泻常见病毒检测一致性较高,在临床诊断中,可采用ELISA法进行初筛,再通过PCR进行确认,以提高诊断效率及准确性。

关键词：婴幼儿腹泻病毒检测荧光免疫法酶联免疫吸附试验聚合酶链式反应

荧光免疫法对丁胺卡那霉素药物动力学的初步探讨

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牡丹江医学院学报 1991年第3期12卷 144-145页

作者：杨志吴宜艳刘艳华牡丹江医学院附属一院药剂科牡丹江医学院药理教研室

本文应用荧光免疫法对健康人丁胺卡那霉素的动力学参数进行了初步探讨,此法与微生物法的动力学参数无明显差异。

关键词：荧光免疫法丁胺卡那霉素

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应用荧光免疫法检测泌尿生殖道沙眼衣原体

中华医学信息导报 1995年第6期10卷 8-9页

作者：毛家都

北京协和医院检验科李永哲等,应用标记荧光素的抗沙眼衣原体（C1

关键词：泌尿生殖道荧光免疫法沙眼衣原体直接免疫荧光法性传播疾病单克隆抗体男性非淋菌性尿道炎主要外膜蛋白北京协和医院泌尿生殖道标本

空间识别荧光免疫法(SRFIA)测定血清中AFP

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国际检验医学杂志 1994年第5期15卷 232-233页

作者：陈黔

作者采用Ni包被的载玻片吸附单层羊抗人AFP抗体.制成活化载玻片.将待测血清滴于活化玻片上保温后,用FITC-共轭兔抗人AFP抗体处理.立即用空间识别荧光免疫测定仪测定被吸附于标本表面的FITC的总量.从而求得待测血清中的AFP量.荧光测定仪... 详细信息

作者采用Ni包被的载玻片吸附单层羊抗人AFP抗体.制成活化载玻片.将待测血清滴于活化玻片上保温后,用FITC-共轭兔抗人AFP抗体处理.立即用空间识别荧光免疫测定仪测定被吸附于标本表面的FITC的总量.从而求得待测血清中的AFP量.荧光测定仪以氩激光为光源,光束经45°角照射于标本表面,用垂直的光子仪测定FITC的荧光以减弱噪音.

关键词： AFP 抗体荧光免疫法荧光抗体技术空间识别 SRFIA

用荧光免疫法对健康人妥布霉素药物动力学的研究

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中国医院药学杂志 1984年第7期 3-5页

作者：肖玉堃谢玉琼李芚吴正中李伯友四川医学院药学系四川省人民医院临床药理研究室

妥布霉素(TOBRAMYCIN)是一种氨基甙类抗生素,对多种革兰氏阴性杆菌具有高效,特别是对绿脓杆菌的作用比庆大霉素强2～8倍,动物实验证明其肾毒性较

关键词：药物动力学药代动力学生物力学妥布霉素荧光免疫法荧光抗体技术谷浓度残数法峰浓度

聚合酶链反应法与荧光免疫法检测沙眼衣原体的比较研究

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解放军医学高等专科学校学报 1998年第4期26卷 17-18页

作者：陈晓旭于灵郭哲大连市解放军大连医高专大连市大连铁路医院

为了评价聚合酶链反应法（ＰＣＲ）对泌尿生殖道标本中沙眼衣原体的检测结果，每份临床标本进行了ＰＣＲ法和荧光免疫法（ＤＦＡ）平行检测比较。检测临床标本９３例，ＰＣＲ法阳性率为２５．８％，ＤＦＡ法的阳性率为１７．２％（Ｐ＞... 详细信息

为了评价聚合酶链反应法（ＰＣＲ）对泌尿生殖道标本中沙眼衣原体的检测结果，每份临床标本进行了ＰＣＲ法和荧光免疫法（ＤＦＡ）平行检测比较。检测临床标本９３例，ＰＣＲ法阳性率为２５．８％，ＤＦＡ法的阳性率为１７．２％（Ｐ＞０．０５）。结果说明ＰＣＲ是一高度特异和敏感的检测方法。

关键词：聚合酶链反应荧光免疫法沙眼衣原体

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基于碳点的荧光免疫法检测蛋白G含量

基于碳点的荧光免疫法检测蛋白G含量