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中医药治疗草酸钙肾结石作用机制研究进展

中医学报 2024年

作者：樊世琪金劲松曹秋实湖北中医药大学湖北省中医院

草酸钙肾结石的发病率逐年增加，严重影响患者的生活水平和经济状况。其发病机制复杂且尚未明确，因此探索治疗草酸钙肾结石的有效方法尤为重要。中医药治疗草酸钙肾结石疗效显著，基于增加成石抑制物分泌、降低促石因素水平、改善机体... 详细信息

草酸钙肾结石的发病率逐年增加，严重影响患者的生活水平和经济状况。其发病机制复杂且尚未明确，因此探索治疗草酸钙肾结石的有效方法尤为重要。中医药治疗草酸钙肾结石疗效显著，基于增加成石抑制物分泌、降低促石因素水平、改善机体炎症反应和氧化应激等机制，可明显提高术后残留结石清除率和减轻术后并发症。本研究基于已发表文献，梳理近20余年草酸钙肾结石的中医药治疗方式及其机制研究进展，以期为草酸钙肾结石的临床治疗和机制的阐明提供参考。

关键词：草酸钙肾结石中医药作用机制研究进展

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草酸钙肾结石的研究现状：问题与方向

中华外科杂志 2009年第4期47卷 241-243页

作者：邓耀良叶章群黎承杨广西医科大学第一附属医院泌尿外科南宁530021 华中科技大学同济医院泌尿外科

有5％～15％的人群一生中会罹患肾结石，其中大部分的结石成分是草酸钙（calcium oxalate，CaOx）。多数CaOx肾结石患者未发现伴有其他系统性疾病的存在，称之为特发性草酸钙结石（idiopathic calcium oxalate，iCaOx）；一些患者存在... 详细信息

有5％～15％的人群一生中会罹患肾结石，其中大部分的结石成分是草酸钙（calcium oxalate，CaOx）。多数CaOx肾结石患者未发现伴有其他系统性疾病的存在，称之为特发性草酸钙结石（idiopathic calcium oxalate，iCaOx）；一些患者存在原发性甲状旁腺功能亢进或其他钙代谢异常疾病；一些患者的主要表现为高草酸尿症，其中因肠道疾病导致草酸吸收增多而引起的称为肠源性高草酸尿症，

关键词：草酸钙肾结石原发性甲状旁腺功能亢进系统性疾病高草酸尿草酸钙结石钙代谢异常结石成分结石患者

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基质Gla蛋白与骨形成蛋白2在草酸钙肾结石患者Randall钙斑中的表达

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中南大学学报（医学版） 2017年第3期42卷 277-283页

作者：朱敏曾锋崔雨刘细峰陈合群中南大学湘雅医院泌尿外科长沙410008

目的:对比基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)及骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)在草酸钙结石肾乳头Randall钙化斑组织中的表达,探讨其在草酸钙肾结石形成过程中的相关机制。方法:收集中南大学湘雅医院泌尿外科2015... 详细信息

目的:对比基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)及骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)在草酸钙结石肾乳头Randall钙化斑组织中的表达,探讨其在草酸钙肾结石形成过程中的相关机制。方法:收集中南大学湘雅医院泌尿外科2015年4月至12月期间住院的30例草酸钙肾结石患者的肾乳头钙化斑组织标本作为实验组,10例同期患肾肿瘤行根治性肾切除术患者的肾乳头组织标本作为对照组,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western印迹检测MGP和BMP-2在肾乳头组织中的表达,并采用免疫组织化学技术观察MGP和BMP-2在肾乳头组织中的表达。结果:1)RT-PCR检测实验组和对照组MGP mRNA的表达量为0.760±0.804和1.365±0.348,差异有统计学意义(P0.05);实验组和对照组BMP-2蛋白表达量为0.885±0.220和0.682±0.272,差异有统计学意义(P草酸钙肾结石患者的肾乳头组织内BMP-2表达增多,MGP表达减少,草酸钙肾结石的形成可能是一种与MGP和BMP-2相关的类成骨反应或异位钙化。

关键词：基质Gla蛋白骨形成蛋白2 草酸钙肾结石 Randall钙化斑

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草酸钙肾结石患者尿液微生物研究

草酸钙肾结石患者尿液微生物研究

作者：陶小五中南大学

学位级别：硕士

目的:通过16S rRNA扩增子测序技术检测草酸钙肾结石患者的尿液微生物组成,探讨草酸钙肾结石与尿液微生物群之间的相关关系。方法:本研究共纳入15例初发肾结石(OS)患者和14例复发肾结石(RS)患者,并同期招募14例健康人群作为对照组(HC)。... 详细信息

目的:通过16S rRNA扩增子测序技术检测草酸钙肾结石患者的尿液微生物组成,探讨草酸钙肾结石与尿液微生物群之间的相关关系。方法:本研究共纳入15例初发肾结石(OS)患者和14例复发肾结石(RS)患者,并同期招募14例健康人群作为对照组(HC)。分别采集三组人群尿液样本,通过16S rRNA扩增子测序技术检测其尿液微生物群的组成。结果:健康对照组的尿液微生物多样性显著低于草酸钙肾结石患者组,且差异具有显著性(P草酸钙肾结石患者组与健康对照组的尿液微生物结构也存在显著差异(P草酸钙肾结石患者组(KS)中发现了与促进草酸钙晶体聚集有关的菌属,如拟杆菌属(Bacteroides)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)及变形杆菌属(Proteus)。而在健康对照组发现了与抗炎相关的菌属,如韦荣氏球菌属(Veillonella)、普氏菌属(Prevotella)。尿液微生物多样性及尿液微生物的结构分布在OS及RS之间未发现明显差异性,但RS组中主要以肠杆菌属(Enterobacteriales)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)和变形杆菌属(Proteus)为主。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能预测分析发现草酸钙肾结石患者组与健康对照组在细胞生长与死亡、排泄系统、翻译功能上具有显著差异。结论:本研究发现16S rRNA扩增子测序技术可作为尿液微生物群检测的一种可靠手段;草酸钙肾结石患者和健康人的尿液微生物多样性及微生物结构分布存在显著差异;拟杆菌属、克雷伯氏杆菌属及变形杆菌属的存在可能是草酸钙肾结石形成的重要因素。图8幅,表6个,参考文献65篇

关键词：草酸钙肾结石尿液微生物群 16Sr RNA测序

P38MAPK通路在草酸钙肾结石形成中的机制研究

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P38MAPK通路在草酸钙肾结石形成中的机制研究

作者：解斌天津医科大学

学位级别：硕士

目的探讨激活后的NLRP3炎症小体进一步促进草酸钙肾结石形成的机制。方法通过对正常肾组织与草酸钙结石患者肾组织进行免疫组化检测P38蛋白表达水平差异;培养NRK-52E细胞,采用不同浓度的P38MAPK通路抑制剂（SB203580）（0,20,40,60,80,1... 详细信息

目的探讨激活后的NLRP3炎症小体进一步促进草酸钙肾结石形成的机制。方法通过对正常肾组织与草酸钙结石患者肾组织进行免疫组化检测P38蛋白表达水平差异;培养NRK-52E细胞,采用不同浓度的P38MAPK通路抑制剂（SB203580）（0,20,40,60,80,1.00umol/L）和不同浓度的草酸（0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,mmol/L）分别作用于NRK-52E细胞24h后,分别采用检测培养基中LDH的含量的方法和MTT法检测草酸和SB203580对NRK-52E细胞的毒性;草酸以及添加SB203580的草酸处理NRK-52E细胞24h后,使用免疫荧光共聚焦显微镜观察细胞P38蛋白表达水平差异;草酸以及添加SB203580的草酸处理NRK-52E细胞24h后,相差显微镜下观察NRK-52E细胞表面晶体粘附性变化,并采用Western blotting和RT-q PCR法分析对NLRP3、P38及黏附因子OPN蛋白水平及m RNA表达量的影响;草酸处理NRK-52E细胞24h后,使用线粒体绿色荧光探针检测NRK-52E细胞内线粒体变化情况;通过转染NLRP3-Si RNA将NLRP3基因沉默之后,再次给予草酸处理24h后,采用western blotting实验方法检测NLRP3、P38以及OPN蛋白的表达水平差异,采用RT-q PCR法分别检测CD44、OPN、HAS1、HAS2以及HAS3m RNA表达水平变化情况;通过直接给予SD大鼠饮用乙二醇水从而构建草酸钙肾结石模型,采用透视电镜观察大鼠肾小管上皮细胞内细胞器变化情况,并采用Western blotting法检测大鼠肾组织中NLRP3、P38及OPN蛋白表达差异,通过免疫组化检测结石组大鼠肾组织和对照组大鼠肾组织P38蛋白表达水平差异,采用RT-q PCR法检测NLRP3、P38、OPN、HAS1、HAS2、HAS3、以及CD44 m RNA表达水平变化。所有实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果免疫组化显示P38蛋白在草酸钙肾结石患者肾组织中的表达水平明显高于正常肾组织标本,进而组织水平说明了P38MAPK通路的参与草酸钙肾结石形成过程;测定细胞培养基中LDH含量结果显示,当草酸浓度为0.8mmol/L处理NRK-52E细胞24h后,培养基内LDH的含量明显高于草酸浓度在0-0.6mmol/L（P＜0.05）,当SB203580浓度为60umol/L处理NRK-52E细胞24h后,培养基内LDH的含量明显高于SB203580浓度在0-40umol/L（P＜0.05）,同样MTT法结果显示SB203580浓度为60umol/L时（P＜0.05）、草酸浓度为0.8mmol/L时（P＜0.05）,对肾小管上皮细胞具有明显的细胞毒性;草酸处理NRK-52E细胞24h后,免疫荧光共聚焦显微镜下显示草酸组细胞P38蛋白表达水平明显多于对照组;草酸以及添加SB203580的草酸处理NRK-52E细胞24h后,western blotting结果发现草酸组细胞中NLRP3、P38以及黏附因子OPN的蛋白质表达水平比完全对照组增高（P＜0.05）,而草酸+抑制剂组与完全对照组相比仅有NLRP3蛋白表达水平增高（P＜0.05）,P38和黏附因子OPN蛋白未见明显升高（P＞0.05）;草酸（0.6mmol/L）处理NRK-52E细胞24h后,使用线粒体绿色荧光探针检测发现NRK-52E细胞内线粒体明显肿胀;通过NLRP3-Si RNA转染NRK-52E细胞后,草酸处理24小时后,NLRP3蛋白、P38蛋白以及粘附因子OPN蛋白表达水平下降（P＜0.05）,细胞表面的黏附因子CD44、HAS1、HAS2、HAS3、OPN的表达水平显著降低（P＜0.05）;通过乙二醇饮水法构建SD大鼠草酸钙肾结石模型,利用透视电镜观察发现高草酸尿症大鼠模型肾小管上皮细胞内细胞核成椭圆形,核内易染色质凝聚边集,线粒体肿胀空泡化,免疫组化结果发现P38蛋白在高草酸尿症大鼠肾组织中表达水平均较对照组肾组织显著增高,western boltting检测发现结石组大鼠的肾组织标本中NLRP3、P38、OPN蛋白表达水平显著高于正常大鼠肾组织（P＜0.05）,RT-q PCR技术发现高草酸尿症大鼠的肾组织标本中P38、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、HAS1、HAS2、HAS3、CD44、OPN的m RNA表达量也显著高于正常大鼠肾组织（P＜0.05）。结论草酸能够引起肾小管上皮细胞发生“细胞焦亡”;P38MAPK通路参与草酸钙肾结石的形成;激活的NLRP3炎症小体是通过P38MAPK通路影响肾小管上皮细胞表面黏附因子的改变,进而促进肾结石的形成,从而为草酸钙结石的治疗和预防

关键词：草酸钙肾结石草酸 P38MAPK NRK-522E

基于骨桥蛋白研究蒙药火硝七味散对草酸钙肾结石小鼠治疗作用及其机制研究

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基于骨桥蛋白研究蒙药火硝七味散对草酸钙肾结石小鼠治疗作用及其...

作者：白博文内蒙古民族大学

学位级别：硕士

目的:探讨蒙药火硝七味散对小鼠草酸钙肾结石模型的治疗作用及骨桥蛋白(OPN)的影响,为临床提供科学依据。方法:(1)实验开始前小鼠适应环境,适应饲养1周;(2)将KM小鼠70只,按体重随机分为6组,空白组、模型组、枸橼酸氢钾钠颗粒组、蒙药火... 详细信息

目的:探讨蒙药火硝七味散对小鼠草酸钙肾结石模型的治疗作用及骨桥蛋白(OPN)的影响,为临床提供科学依据。方法:(1)实验开始前小鼠适应环境,适应饲养1周;(2)将KM小鼠70只,按体重随机分为6组,空白组、模型组、枸橼酸氢钾钠颗粒组、蒙药火硝七味散低、中、高剂量组;(3)空白组给予自由饮水+生理盐水1m L/天灌胃,其余组灌胃1%乙二醇+1%氯化铵1m L/天进行造模,共造模4周;(4)造模期间每周记录各组小鼠体重,并计算每组体重均值,观察小鼠有无死亡,进食、行为活动及毛发变化;(5)造模3周后,空白组与模型组随机处死1只小鼠,采用HE染色检查小鼠肾脏内有无结晶体,评估造模情况;(6)造模成功后,模型组小鼠给予纯净水,蒙药火硝七味散低剂量组给予0.25g/kg、蒙药火硝七味散中剂量组给予0.5g/kg、蒙药火硝七味散高剂量组给予1.0g/kg、枸橼酸氢钾钠颗粒组给予1.67g/kg,灌胃体积为20ml/kg,每日灌胃1次,共灌胃3周;(7)给药期间,每周记录各组小鼠体重,并计算每组体重均值,观察小鼠有无死亡,进食、行为活动及毛发变化;(8)检测指标:采用酶联免疫法检测肾组织中OPN的含量。结果:(1)造模期间,蒙药火硝七味散高剂量组小鼠第1周体重均值与其他各组小鼠体重均值差异有统计学意(P0.05);(2)给药期间,各组小鼠之间体重均值差异无统计学意义(P>0.05);(3)给药4周后,空白组与模型组OPN比较差异有统计学意义(P0.05);蒙药火硝七味散中、高剂量组与模型组OPN比较有统计学意义(P草酸钙肾结石,其机制为抑制肾组织中OPN的含量,从而抑制肾脏中OPN的聚集、成核。

关键词：火硝七味散枸橼酸氢钾钠颗粒草酸钙肾结石骨桥蛋白

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遗传性草酸钙肾结石果蝇模型的建立与应用

遗传性草酸钙肾结石果蝇模型的建立与应用

作者：樊秋霞南方医科大学

学位级别：硕士

肾结石是临床上常见的肾脏疾病之一,75%的结石为草酸钙结石。国内的流行病学统计显示肾结石的发病率约为10%-15%,近几年来发病率呈全球性上升趋势。严重的肾结石可进展为慢性肾脏病(CKD)、终末期肾脏病(ESRD),给社会和家庭带来沉重的经... 详细信息

肾结石是临床上常见的肾脏疾病之一,75%的结石为草酸钙结石。国内的流行病学统计显示肾结石的发病率约为10%-15%,近几年来发病率呈全球性上升趋势。严重的肾结石可进展为慢性肾脏病(CKD)、终末期肾脏病(ESRD),给社会和家庭带来沉重的经济和心理负担。随着现代医学和生物学研究的快速发展,利用全外显子组测序技术,目前已从肾结石患者中鉴定出了 30多个疾病相关基因。但是由于缺乏好的动物模型,这些基因是否为真正的致病基因,以及他们的致病分子机制仍不明确。在本论文研究中,我们首先利用UAS-RNAi/Ga14系统建立了遗传性草酸钙肾结石果蝇模型,然后利用果蝇肾结石模型系统性的研究了目前已知的30多个肾结石相关基因的致结石作用及其潜在的分子机制。利用我们建立的果蝇草酸钙肾结石模型,我们进一步发现藤黄果提取物在体内可以明显抑制果蝇马氏管内结石的形成。同时,藤黄果提取物(GCE)在体内也可以高效的溶解果蝇马氏管内草酸钙结石。最后,我们的体外实验证实藤黄果提取物的主要成分羟基柠檬酸(HCA)可以迅速完全溶解果蝇马氏管内的草酸钙结石。我们的研究结果表明:果蝇肾结石模型是用来筛选肾结石致病新基因和溶石新药物的理想模型;藤黄果提取物作为潜在的溶石药物,在草酸钙肾结石的临床治疗中有着光明的前景。1.遗传性草酸钙肾结石果蝇模型的建立目的:构建遗传性草酸钙肾结石果蝇模型,确立利用果蝇研究遗传性肾结石的可行性。方法:利用UAS-RNAi/Uro-Ga14系统将vha55和vha100-2基因特异性的在果蝇马氏管主细胞内敲低后,检测vha55和vha100-2对马氏管内草酸钙结石形成的影响。结果:vha55和vha100-2基因在果蝇马氏管主细胞内敲低后,显著促进马氏管内草酸钙结石的形成。小结:利用UAS-RNAi/Uro-Ga14系统可以用来研究遗传性肾结石致病基因的功能。2.利用果蝇肾结石模型系统研究肾结石相关基因的功能,并初步探究其影响结石肾结石形成的分子机制目的:系统研究肾结石相关基因的功能,并初步探究其影响肾结石形成的分子机制方法:(1)首先利用生物信息学方法,从果蝇基因信息库中找出目前已发现的30个肾结石相关基因的果蝇同源基因,利用UAS-RNAi/Uro-Ga14系统将这些基因特异性的在果蝇马氏管主细胞内敲低,再将這些果蝇喂养在含草酸钠的果蝇培养基中,1周后在解剖镜下将马氏管解剖,偏振光显微镜下观察马氏管内结石形成情况;(2)将基因敲低果蝇与野生型果蝇加入PBS后碾碎后,取上清,利用草酸根检测试剂盒,检测草酸根的离子浓度。结果:目前已知的30个肾结石基因,80%的基因在马氏管主细胞内特异性敲低后,结石形成明显增加;基因敲低果蝇体内的草酸根离子普遍比野生型果蝇高。小结:可以利用果蝇草酸钙肾结石模型,在体内对从结石病人中鉴定出的肾结石形成相关基因进行功能分析。这些基因是通过影响草酸的代谢和分泌,进而影响肾结石的形成。3.探究藤黄果提取物对草酸钙肾结石的治疗作用及其分子作用机制目的:利用体内和体外果蝇草酸钙肾结石模型,探究藤黄果提取物对草酸钙肾结石的治疗作用和它的分子作用机制。方法:(1)将野生型雌性果蝇分别放于含有1%草酸钠和不同浓度GCE的果蝇培养基中,置于25℃、50%湿度、12h昼夜交替光照培养箱内培养一周,解剖分离出三期幼虫的马氏小管,在偏振光显微镜下观察马氏小管内结石的形成情况;(2)将出生3天的雌性果蝇分别放于含有0.1%草酸钠和不同浓度GCE果蝇培养基中,置于25℃、50%湿度、12h昼夜交替光照培养箱内,1周后解剖分离出马氏管,在偏振光显微镜下观察马氏管内结石的形成情况;(3)将出生3天的雌性果蝇放入含有0.3%草酸钠果蝇培养基中培养1周,使果蝇马氏管内形成大量结石,再将這些果蝇放入含有0.1%草酸钠和不同GCE的果蝇培养基中,分别在第4d、7d解剖分离出马氏管,在偏振光显微镜下观察结石的形成情况;(4)将出生3天的野生型雌性果蝇放于含有0.3%草酸钠果蝇食物中,1周后解剖分离马氏管,将分离出的马氏管放入含有不同浓度羟基柠檬酸的水溶液中,在偏振光显微镜下实时动态观察马氏管内结石的变化情况。根据不同药物处理后,结石的形成面积或者溶解后剩余面积,计算出藤黄果提取物对草酸钙结石的形成或者结石溶解的影响。结果:藤黄果提取物有效抑制果蝇幼虫和成虫马氏管内草酸钙结石的形成;藤黄果提取物高效溶解果蝇成虫马氏管内的草酸钙结石;羟基柠檬酸在体外高效的直接溶解马氏管内草酸钙结石。小结:体内实验证实藤黄果提取物通过直接溶解马氏管内的草酸钙结石,进而抑制结石的形成;体外试验的结果表明藤黄果提取物通过其有效成分羟基柠檬酸溶解草酸钙结石。

关键词：肾结石果蝇模型羟基柠檬酸藤黄果提取物草酸钙肾结石

钙化性纳米微粒与草酸钙肾结石关系的初步研究

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钙化性纳米微粒与草酸钙肾结石关系的初步研究

作者：陶芝伟广西医科大学

学位级别：硕士

目的通过对草酸钙肾结石患者肾结石、肾盂尿液和肾乳头钙化斑组织标本的钙化性纳米微粒检测,探讨钙化性纳米微粒与草酸钙肾结石形成的关系;通过肾乳头钙化组织的超微结构观察,阐述钙化性纳米微粒致草酸钙肾结石形成的可能机制。方法1、... 详细信息

目的通过对草酸钙肾结石患者肾结石、肾盂尿液和肾乳头钙化斑组织标本的钙化性纳米微粒检测,探讨钙化性纳米微粒与草酸钙肾结石形成的关系;通过肾乳头钙化组织的超微结构观察,阐述钙化性纳米微粒致草酸钙肾结石形成的可能机制。方法1、收集20例草酸钙肾结石患者的肾结石、肾盂尿液和肾乳头钙化组织标本,分离和培养钙化性纳米微粒,并应用Von kossa染色、电镜、X线能谱、傅里叶变换红外光谱等技术检测钙化性纳米微粒的存在,取6例肾脏肿瘤患者的肾盂尿液、肾乳头组织标本作为对照,RPMI 1640培养液作为空白对照。2、在光镜下观察钙化性纳米微粒检测阳性的草酸钙肾结石患者的肾乳头钙化组织中钙盐沉积的部位,并利用电镜对该组织的超微结构进行观察。3、在不同的时间段,利用扫描电镜对肾结石、肾盂尿液和肾乳头钙化组织标本来源的钙化性纳米微粒的形态变化进行观察。结果草酸钙肾结石患者的肾结石核心、表面、肾盂尿液和肾乳头钙化组织标本中均检测到钙化性纳米微粒的存在,阳性率分别为75%、60%、55%、65%。扫描电镜观察发现肾乳头钙化组织内存在大量钙化性纳米微粒,这些微粒聚集成团,粘附于小管上皮,并被内吞。透射电镜下,在肾乳头钙化组织间质中也发现了类似钙化性纳米微粒的颗粒,髓攀间质中的钙化斑结构与钙化性纳米微粒在体外培养了40周的形态极为相似。结论钙化性纳米微粒与草酸钙肾结石的形成存在密切联系：钙化性纳米微粒可能参与肾乳头钙化-草酸钙肾结石的形成过程。肾结石、肾盂尿液和肾乳头钙化组织标本来源的钙化性纳米微粒的形态在无血清的培养环境中具有多形性。

关键词：钙化性纳米微粒肾乳头钙化草酸钙肾结石

NLRP3炎症小体促进草酸钙肾结石形成机制的初步研究

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NLRP3炎症小体促进草酸钙肾结石形成机制的初步研究

作者：何振天津医科大学

学位级别：硕士

目的明确草酸钙肾结石形成过程中NLRP3炎症小体激活的机制,探讨NLRP3炎症小体促进草酸钙肾结石形成的机制。方法通过免疫组化检测分析人草酸钙结石肾组织与正常肾组织组NLRP3、Caspase-1及IL-1β的表达水平差异;培养HK-2细胞,使用不同... 详细信息

目的明确草酸钙肾结石形成过程中NLRP3炎症小体激活的机制,探讨NLRP3炎症小体促进草酸钙肾结石形成的机制。方法通过免疫组化检测分析人草酸钙结石肾组织与正常肾组织组NLRP3、Caspase-1及IL-1β的表达水平差异;培养HK-2细胞,使用不同浓度的草酸(0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0mmol/L)处理细胞24h后,通过检测细胞培养基中的LDH的含量、DAPI细胞核染色结果、MTT法以及CCK-8法分析草酸对HK-2细胞的毒性及活性的影响;草酸与COM共培养于HK-2细胞24h后,使用相差显微镜观察细胞表面晶体的粘附情况;通过Western blotting法和RT-q PCR分别分析草酸作用于HK-2细胞24h后对NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平及m RNA表达量的影响;应用RT-q PCR检测分析草酸作用于HK-2细胞24h后对HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 m RNA表达量的影响;草酸作用于HK-2后,采用氧化敏感的荧光探针DCFH-DA检测细胞中ROS;使用ROS抑制剂NAC预处理HK-2细胞2h,然后草酸作用于HK-2细胞24h,Western blotting和RT-q PCR分别检测分析NLRP3的蛋白水平及m RNA的表达量;使用RNA干扰技术,将NLRP3-Si RNA转染HK-2细胞后,相差显微镜观察细胞表面晶体粘附变化RT-q PCR法分别检测HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 m RNA表达水平变化;采用乙二醇法复制SD大鼠草酸钙肾结石模型,通过HE、Pizzolato染色法以及偏光显微镜观察大鼠肾组织结石形成情况,并通过Western blotting法和RT-q PCR检测大鼠肾组织中NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白和m RNA表达差异,以及HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 m RNA表达水平变化。实验数据整理后均采用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果免疫组化染色结果显示人草酸钙肾组织标本中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的蛋白表达水平高于人正常肾组织,进而说明草酸钙肾结石形成过程中存在NLRP3炎症小体的激活;培养基中LDH含量测定结果显示草酸浓度在0.8mmol/L时,LDH的含量显著高于草酸浓度在0-0.6mmol/L(P草酸浓度在0-0.8mmol/L时,DAPI染色结果发现各浓度梯度内细胞数量没有明显差异,当草酸浓度1.0mmol/L时,细胞数量开始显著减少(P草酸浓度为1.0mmol/L时(P草酸(0.8mmol/L)作用于HK-2细胞24h后,使用相差显微镜观察细胞表面COM晶体粘附数量明显多于对照组(P草酸(0.8mmol/L)作用于HK-2细胞24h后均高于对照组(P草酸(0.8mmol/L)可引起细胞内发生氧化应激产生ROS,且加入ROS抑制剂NAC作用后NLRP3的蛋白水平及m RNA表达量明显降低(P草酸作用于HK-2细胞后细胞内发生了氧化应激产生ROS,并导致NLRP3炎性体的激活;NLRP3-Si RNA转染HK-2细胞后,细胞表面晶体粘附数量显著少于对照组(P草酸钙肾结石模型,通过HE、Pizzolato染色法及偏光显微镜发现试验组大鼠肾组织内晶体形成,且NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平和m RNA表达量显著高于对照组(P草酸钙肾结石的形成。结论草酸钙肾结石形成过程中存在NLRP3炎症小体的激活,NLRP3炎症小体通过细胞内ROS的产生而激活;NLRP3炎症小体激活后通过改变肾小管上皮对晶体的粘附性进而参与结石的形成;同时为草酸钙肾结石的发生机制及防治提供了新的线索及靶点。

关键词： NLRP3炎症小体草酸 ROS 草酸钙肾结石 HK-2