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腺苷激酶在难治性癫痫患者脑组织中过量表达

中国医师杂志 2023年第9期25卷 1355-1358页

作者：赫丹丹兰春伟寇雨霏刘涛王清勇段淑荣中国科学院大学深圳医院(光明)神经内科深圳518107 哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科哈尔滨150001

目的观察腺苷激酶(ADK)在难治性癫痫患者海马内的表达,进而探讨ADK在难治性癫痫发病机制中的作用。方法收集哈尔滨医科大学附属第一医院因难治性癫痫手术切除海马组织的患者13例,作为癫痫组;同时收集颅脑外伤行清创术患者(相对正常的颞... 详细信息

目的观察腺苷激酶(ADK)在难治性癫痫患者海马内的表达,进而探讨ADK在难治性癫痫发病机制中的作用。方法收集哈尔滨医科大学附属第一医院因难治性癫痫手术切除海马组织的患者13例,作为癫痫组;同时收集颅脑外伤行清创术患者(相对正常的颞叶脑组织)4例(既往无癫痫发作史),该4例患者为对照组。利用双荧光免疫组织化学、实时定量PCR(RT-Real-time PCR)、蛋白免疫印迹等方法从组织水平、基因水平、蛋白水平检测两组标本ADK的表达情况。结果在人脑中,ADK主要在星形胶质细胞核中表达。通过组织学观察,ADK在正常脑组织内有微弱表达,而在难治性癫痫患者脑组织中胶质细胞明显增生,同时有ADK的过量表达。癫痫组ADK阳性胶质细胞百分比为(53.90±17.59)%,对照组为(23.82±4.18)%,差异有统计学意义(P<0.01)。从基因水平,利用RT-Real-time PCR法发现癫痫组ADK mRNA高于对照组表达量,其2^(-△△Cp)为13.36,表达量是对照组的13.36倍。在蛋白水平,利用蛋白免疫印迹方法发现癫痫组ADK蛋白表达高于对照组(P<0.01)。结论ADK在人的正常脑组织星形胶质细胞核内有微弱表达。而在难治性癫痫患者脑组织中,星形胶质细胞显著增生并且有ADK的过量表达。ADK在人类难治性癫痫的发生发展过程中可能起到了重要作用。

关键词：腺苷激酶难治性癫痫海马

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腺苷激酶活化在幼鼠癫痫形成中的作用

武汉大学学报（医学版） 2022年第6期43卷 908-912页

作者：张海菊余诗倩姚宝珍武汉大学人民医院儿科湖北武汉430060

目的:探讨腺苷激酶(ADK)在幼鼠癫痫形成中的作用和相关机制。方法:海人藻酸(KA)诱导幼鼠痫性发作(SE),检测静止期(SE后14 d)和慢性自发性癫痫(SRS)形成期(SE后42 d)ADK的表达;部分幼鼠腹腔注射腺苷受体拮抗剂ABT⁃702,分为对照组(NC)、... 详细信息

目的:探讨腺苷激酶(ADK)在幼鼠癫痫形成中的作用和相关机制。方法:海人藻酸(KA)诱导幼鼠痫性发作(SE),检测静止期(SE后14 d)和慢性自发性癫痫(SRS)形成期(SE后42 d)ADK的表达;部分幼鼠腹腔注射腺苷受体拮抗剂ABT⁃702,分为对照组(NC)、致痫组(SE)和SE后ABT⁃702干预组(SE+ABT⁃702)。观察SRS在各组的差异,检测SRS形成期各组ADK,腺苷A1受体(A1R)和A2αR蛋白表达差异;尼氏染色观察海马神经元丢失和促炎性因子IL⁃18和IL⁃1β的表达在各组的差异。结果:KA诱导SE发作后,静止期及SRS形成期海马区ADK表达均增加;ABT⁃702抑制SRS慢性期ADK的活化,降低SRS发生率,抑制抑制海马神经元丢失;SE组ADK活化激活A2αR,诱导促炎性因子IL⁃18和IL⁃1β,ABT⁃702抑制A2αR及促炎性因子IL⁃18和IL⁃1β的活化。结论:SE诱导ADK持续活化,癫痫形成期腺苷A2α受体被激活,诱导海马神经元丢失和促炎性因子IL⁃18和IL⁃1β释放,在幼鼠慢性癫痫形成发挥重要作用。

关键词：癫痫形成腺苷激酶腺苷受体炎症海人藻酸

腺苷激酶在重症急性胰腺炎中的作用及机制研究

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腺苷激酶在重症急性胰腺炎中的作用及机制研究

作者：孙淑琨山东大学

学位级别：硕士

研究背景:急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)指因胰酶异常激活对胰腺自身及周围器官产生消化作用而引起的、以胰腺局部炎性反应为主要特征,甚至可导致器官功能障碍的急腹症。重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是指在AP的... 详细信息

研究背景:急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)指因胰酶异常激活对胰腺自身及周围器官产生消化作用而引起的、以胰腺局部炎性反应为主要特征,甚至可导致器官功能障碍的急腹症。重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是指在AP的基础上伴有脏器功能障碍,或出现坏死、脓肿或假性囊肿等局部并发症或两者兼有。炎症和腺泡细胞死亡在SAP的发生发展中起重要作用。腺泡细胞经历的程序性死亡方式包括凋亡和程序性坏死。轻症急性胰腺炎会发生细胞凋亡,而SAP则会发生细胞程序性坏死。SAP各种应激源激活胰蛋白酶原,活性胰蛋白酶使胰腺腺泡细胞钙离子大量释放,导致胰腺腺泡细胞坏死。细胞碎片进入细胞外间隙,被白细胞识别,导致炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的释放以及程序性坏死的发生。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是SAP发病的核心细胞事件之一。ERS的过度激活触发和加重AP胰腺损伤,并与未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)、炎症反应、腺泡细胞凋亡和坏死及胰腺酶原颗粒自噬等多种机制有关。腺苷激酶(Adenosine kinase,ADK)是一种催化腺苷转化为腺苷酸的胞浆酶,是决定细胞内外腺苷水平的主要酶,ADK将腺苷磷酸化为一磷酸腺苷。抑制ADK可增加细胞内外腺苷水平。腺苷作为稳态和代谢调节剂在生命系统中发挥广泛的生理功能。研究表明ADK对炎症和细胞死亡有潜在的作用。然而,ADK是否调控SAP中的炎症和腺泡细胞死亡尚不清楚。研究目的:1.明确SAP时胰腺组织中ADK的变化;2.阐明ADK在SAP中的作用及潜在机制;3.明确抑制ADK对雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用及分子机制。研究方法:1.建立SAP动物模型:C57BL/6雄性小鼠分别给予雨蛙素(Cerulein)50 μg/kg,腹腔内注射,每小时1次,连续7次,在末次注射cerulein时腹腔内注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)10 mg/kg,用 ABT702 1.5 mg/kg 抑制 ADK,在造模前 1h 腹腔内注射;2.建立雨蛙素刺激胰腺腺泡细胞模型:大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J和小鼠胰腺腺泡细胞系MPC-83给予100 nM的Cerulein,孵育24h;在Cerulein孵育前30min用1μM的ABT702抑制ADK,在ABT702孵育前30min用100 nM的ZM241385抑制腺苷A2A受体,在Cerulein孵育前30min用5μM的GSK2606414抑制ERS的PERK通路;3.胰腺体重比测量:分别测量小鼠取材时体重及胰腺重量;4.血清淀粉酶脂肪酶检测:采集小鼠血清,用试剂盒进行血清淀粉酶和脂肪酶检测;5.S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine,SAH)检测:采集小鼠血清,用ELISA试剂盒进行血清SAH水平检测;6.胰腺组织染色及病理学评分:取小鼠胰腺组织,石蜡包埋,进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色,在光学显微镜下用Schmidt评分衡量胰腺组织病理学改变;7.胰腺组织程序性坏死检测:小鼠取材前提前4h腹腔注射10 mg/mL伊文思蓝染料(Evans blue dye,EBD),取小鼠胰腺组织,冰冻切片,免疫荧光染色检测小鼠胰腺组织淀粉酶及EBD含量;8.免疫组化与免疫荧光染色:取小鼠胰腺组织,石蜡切片,免疫组化检测中性粒细胞表达,免疫荧光检测巨噬细胞表达;9.蛋白免疫印迹实验:取小鼠胰腺组织蛋白、AR42J和MPC-83细胞蛋白,检测炎症、程序性坏死、ERS相关指标变化;10.统计分析:使用GraphPad Prism 6.0对所有数据进行分析,数据以平均值±标准误(Mean±SEM)形式表示,采用t检验或单因素方差分析,然后进行Tukey’s后置检验,P腺苷A2A受体介导ADK调控腺泡细胞炎症、程序性坏死和内质网应激的作用。研究结论:抑制ADK通过腺苷A2A受体/内质网应激途径减少SAP炎症和腺泡细胞程序性坏死,ADK可能是治疗SAP的潜在靶点。

关键词：腺苷激酶炎症程序性坏死内质网应激腺苷A2A受体

腺苷激酶小干扰RNA修饰的角膜内皮细胞诱导调节性T细胞的增生和分泌

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中华实验眼科杂志 2019年第5期37卷 337-341页

作者：张万红焦惠英阮燕飞刘元真天津市泰达医院眼科 300457 南阳市中心医院眼科 473000

目的探讨腺苷激酶(ADK)小干扰RNA(siRNA)修饰的角膜内皮细胞诱导调节性T细胞(Treg)增生和分泌的作用。方法取第3~5代人角膜内皮细胞,实验分为转染组和未转染组,转染组采用Lipofectamine■ 3000将FAM-ADK siRNA转染进入角膜内皮细胞,采... 详细信息

目的探讨腺苷激酶(ADK)小干扰RNA(siRNA)修饰的角膜内皮细胞诱导调节性T细胞(Treg)增生和分泌的作用。方法取第3~5代人角膜内皮细胞,实验分为转染组和未转染组,转染组采用Lipofectamine■ 3000将FAM-ADK siRNA转染进入角膜内皮细胞,采用高效液相色谱法检测各组中腺苷的质量浓度。实验分为对照组[转染对照siRNA]、雷帕霉素组(转染对照siRNA后培养液中加入10 ng/ml雷帕霉素)和ADK siRNA组(转染ADK siRNA后培养液中加入10 ng/ml雷帕霉素),采用TUNEL染色检测细胞凋亡比例;采用流式细胞术检测内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-选择素的表达。实验分为单独培养组(单纯淋巴细胞培养)、共培养组(淋巴细胞与角膜内皮细胞共培养)和ADK siRNA组(淋巴细胞与ADK siRNA转染的角膜内皮细胞共培养),流式细胞术检测各组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例;ELISA法检测各组上清液中白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的质量浓度。结果流式细胞术检测结果显示,95.1%的角膜内皮细胞表达siRNA,转染组上清液中腺苷的质量浓度为(38.020±6.658)ng/ml,较对照组的(1.663±0.581)ng/ml明显升高,差异有统计学意义(t=5.437,P=0.006)。TUNEL染色结果显示,雷帕霉素组角膜内皮细胞平均凋亡率较对照组明显升高,ADK siRNA组角膜内皮细胞平均凋亡率较雷帕霉素组明显降低,差异均有统计学意义(t=3.763,P=0.020;t=4.405,P=0.012)。流式细胞术检测结果显示,ADK siRNA组ICAM-1、VCAM-1和E-选择素的平均荧光强度分别为4.060±1.179、3.600±1.234和5.223±1.734,明显弱于对照组的11.600±2.427、11.030±2.291和24.270±4.332,差异均有统计学意义(t=2.794,P=0.049;t=2.857,P=0.046;t=4.081,P=0.015)。单独培养组、共培养组和ADK siRNA组淋巴细胞中Treg细胞比例总体比较,差异有统计学意义(F=12.890,P=0.007),其中ADK siRNA组淋巴细胞中Treg细胞的比例较共培养组明显升高,差异有统计学意义(t=3.650,P=0.022)。ELISA检测结果显示,单独培养组、共培养组和ADK siRNA组淋巴细胞上清液中IL-10和TGF-β的质量浓度总体比较,差异均有统计学意义(F=20.960,P=0.003;F=27.320,P=0.001),其中ADK siRNA组淋巴细胞上清液中IL-10和TGF-β的质量浓度均较共培养组明显升高,差异均有统计学意义(t=4.492,P=0.011;t=5.280,P=0.006)。结论ADK siRNA修饰的角膜内皮细胞能够诱导Treg细胞增生及分泌IL-10和TGF-β,为角膜移植的免疫耐受诱导提供了新的选择。

关键词：腺苷激酶角膜移植内皮细胞调节性T细胞

重组酿酒酵母腺苷激酶的表达、纯化和鉴定(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第7期35卷 666-670页

作者：吕晓冰吴海珍叶江范怡张惠展华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达... 详细信息

腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达。重组蛋白质经部分纯化后 ,测定其酶动力学常数 ,结果表明该酶对腺苷的Km 值为 (3.5± 0 .2 ) μmol L ,对ATP的Km 值为(10 0 .0± 11.0 ) μmol L ,对腺苷的kcat值为 (15 30± 2 0 )min- 1 ,对ATP的kcat值为 (14 4 8± 2 5 )min- 1 。该酶对其他核苷和脱氧核苷的Km 值测定数据表明 ,从酵母中克隆得到的该重组腺苷激酶具有较高的底物特异性。

关键词：腺苷激酶蛋白质纯化酶动力学常数 Saccharomyces cerevisiae

腺苷激酶在创伤性脑损伤中对神经元凋亡的作用研究

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腺苷激酶在创伤性脑损伤中对神经元凋亡的作用研究

作者：金巍南通大学

学位级别：硕士

目的研究腺苷激酶(adenosine kinase, ADK)在创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)中的表达变化,并探讨ADK参与星形胶质细胞活化及神经元凋亡的机制。方法 1.整体水平,建立大鼠脑锐器割伤模型;通过蛋白质印迹法(Western Blot, WB... 详细信息

目的研究腺苷激酶(adenosine kinase, ADK)在创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)中的表达变化,并探讨ADK参与星形胶质细胞活化及神经元凋亡的机制。方法 1.整体水平,建立大鼠脑锐器割伤模型;通过蛋白质印迹法(Western Blot, WB)和免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)检测TBI中ADK的表达和分布变化。 2.通过免疫荧光双标记法(double-immunofluorescent staining,1F)检测ADK在TBI中与不同细胞的共定位情况。 3.通过WB检测TBI后GFAP. Ki-67及iNOS的表达,并通过1F分别检测Ki-67/GFAP及Ki-67/ADK的共定位情况,以明确ADK与星形胶质细胞活化的关系。 4.采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测TB1后大鼠皮质神经元的凋亡情况。 5.离体水平,建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的星形胶质细胞活化模型,通过WB检测ADK、GFAP、iNOS的表达变化,并通过ELISA检测星形胶质细胞释放TNF-α、IL-1β,以及IL-6的释放情况,明确星形胶质细胞活化与ADK关系。 6.用星形胶质细胞活化后的条件培养基(conditioned medium, CM)刺激神经元,采用WB、IF、DAPI染色、以及细胞毒检测评估神经元的凋亡情况。 7.构建ADK的siRNA干扰,通过WB验证其干扰效率;并通过WB和ELISA检测ADK干扰对星形胶质细胞活化的影响。 8.通过WB、IF、DAPI染色及细胞毒检测对比ADK干扰前后星形胶质细胞活化CM对神经元凋亡的影响。结果 ***后大鼠损伤侧脑皮质ADK表达上调,在损伤后第5天达到峰值,后逐渐恢复正常。 ***分别与GFAP和CD11b在大鼠皮质存在共定位;但TBI后仅ADK与GFAP的共定位细胞数较TBI前增高。 ***中Ki-67、iNOS及GFAP的表达发生上调,在损伤后第5天达到峰值后恢复正常;ADK/Ki-67以及GFAP/Ki-67存在共定位。 ***后损伤侧皮质出现NeuN与TUNEL阳性共定位细胞。 5.星形胶质细胞中ADK、GFAP、iNOS的表达以及星形胶质细胞CM中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达随LPS刺激成浓度依赖式上升,且在相同浓度不同时间的LPS刺激下,上述分子的表达呈先增高后恢复的改变。 6.在星形胶质细胞CM的诱导下,神经元的active-caspase-3、 LDH表达呈浓度依赖式上升：在相同浓度不同时间CM刺激下,神经元的active-caspase-3、LDH表达呈先增高后恢复的改变。 ***干扰后,星形胶质细胞炎性因子释放减弱,且其CM对神经元凋亡的作用减轻。结论 ***参与了TBI的病理生理过程。 ***过程中,存在星形胶质细胞活化和神经元凋亡。 3.炎性介质诱导的胶质细胞活化能介导神经元凋亡,存在星形胶质细胞—神经元调控。 ***参与胶质细胞活化对神经元凋亡的调控。

关键词：创伤性脑损伤腺苷激酶星形胶质细胞神经元

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第二军医大学学报 2020年第7期41卷 769-774页

作者：吴越高庆祥沈洋屈淑平程庆保姜小清海军军医大学(第二军医大学)东方肝胆外科医院胆道一科上海200438 海军军医大学(第二军医大学)东方肝胆外科医院肝外一科上海200438

目的探讨特异性上调肝细胞中腺苷激酶(ADK)表达对高脂饮食诱导的小鼠葡萄糖耐量异常与肝脏脂肪变性的影响。方法20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,每组10只,其中1组通过尾静脉注射将携带甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子驱动表达ADK的腺... 详细信息

目的探讨特异性上调肝细胞中腺苷激酶(ADK)表达对高脂饮食诱导的小鼠葡萄糖耐量异常与肝脏脂肪变性的影响。方法20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,每组10只,其中1组通过尾静脉注射将携带甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子驱动表达ADK的腺相关病毒(AAV8-TBG-ADK)注入小鼠体内(AAV8-TBG-ADK组),另1组注射对照腺相关病毒AAV8-TBG(AAV8-TBG组)。上述2组小鼠接受腺相关病毒注射后,再分别随机分为2个亚组,每亚组5只,分别给予8周普通饮食或高脂饮食。造模过程中检测各组小鼠体质量变化。造模结束后处死小鼠,采用蛋白质印迹法与qRT-PCR检测各组小鼠肝脏ADK表达,葡萄糖耐量试验检测小鼠葡萄糖耐量情况,H-E染色、油红O染色检测肝组织病理改变及脂滴沉积,qRT-PCR检测小鼠肝组织中糖异生相关基因[葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)]和脂肪生成相关基因[胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD-1)]的mRNA水平。结果与普通饮食饲喂小鼠相比,高脂饮食可导致小鼠体质量增加、葡萄糖代谢紊乱和肝脏脂质沉积。与注射AAV8-TBG的小鼠相比,注射AAV8-TBG-ADK特异性上调小鼠肝脏ADK的表达后,对普通饮食和高脂饮食饲喂的小鼠体质量均无明显影响,但可减轻高脂饮食导致的葡萄糖耐量异常和肝脏脂质沉积(P均<0.05),并可抑制高脂饮食饲喂小鼠肝脏糖异生与脂肪生成相关基因的表达(P均<0.05)。结论利用腺相关病毒特异性上调肝细胞ADK表达可改善高脂饮食导致的小鼠葡萄糖耐量异常与肝脏脂肪变性。

关键词：腺苷激酶高脂饮食葡萄糖耐量异常非酒精性脂肪肝

柠檬苦素通过抑制腺苷激酶活性改善小鼠迟发型超敏反应

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免疫学杂志 2012年第11期28卷 950-953页

作者：欧阳春丁翔连云港市第一人民医院药学部 222002

目的建立DNFB诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型,探讨柠檬苦素对小鼠DTH反应的影响并探索其作用机制。方法在小鼠DTH激发期腹腔注射柠檬苦素(5、10、20 mg/kg)以及地塞米松(DEX,1 mg/kg),考察化合物体内对小鼠耳肿胀程度的影响。构建... 详细信息

目的建立DNFB诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型,探讨柠檬苦素对小鼠DTH反应的影响并探索其作用机制。方法在小鼠DTH激发期腹腔注射柠檬苦素(5、10、20 mg/kg)以及地塞米松(DEX,1 mg/kg),考察化合物体内对小鼠耳肿胀程度的影响。构建腺苷激酶活性无细胞检测系统,考察柠檬苦素对腺苷激酶活性的抑制作用。利用高效液相色谱法(high performanceliquid chromatogroaphy,HPLC)检测小鼠耳组织局部腺苷浓度,考察柠檬苦素体内对腺苷激酶活性的抑制效应。进一步通过腺苷受体拮抗剂干预,验证腺苷在柠檬苦素治疗效果中的作用。结果 DTH小鼠耳肿胀程度以及HE染色结果均表明激发期给予柠檬苦素可以显著改善小鼠DTH。腺苷激酶活性实验证明柠檬苦素体外可以抑制腺苷激酶的活性,HPLC结果显示柠檬苦素体内可促进小鼠耳组织局部腺苷累积。腺苷受体拮抗剂咖啡因可拮抗柠檬苦素对小鼠DTH的抑制效果。结论柠檬苦素可抑制腺苷激酶活性,影响体内腺苷代谢,导致耳组织局部腺苷累积,改善小鼠迟发型超敏反应。

关键词：迟发型超敏反应柠檬苦素腺苷激酶腺苷

弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

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中国人兽共患病学报 2008年第6期24卷 495-499页

作者：李霞余莉罗庆礼乔增培沈继龙安徽省人兽共患病重点实验室(安徽医科大学) 教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室合肥230032 安徽中医学院第二附属医院合肥230061

目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓... 详细信息

目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌***21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。

关键词：弓形虫腺苷激酶基因克隆表达多抗血清