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四川大学学报（医学版） 2019年第3期50卷 291-297页

作者：张春曦罗涛马鹏娇王楚涵索靖翟小倩彭璇鲍朗四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都610041

目的探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv3084编码的酯酶LipR的生物学特性及其在体内的免疫调节功能。方法从MTB H37Rv标准毒力株扩增LipR基因,构建重组表达质粒;测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌,诱导LipR蛋白表达并... 详细信息

目的探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv3084编码的酯酶LipR的生物学特性及其在体内的免疫调节功能。方法从MTB H37Rv标准毒力株扩增LipR基因,构建重组表达质粒;测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌,诱导LipR蛋白表达并纯化,Western blot鉴定;进行LipR酯酶活性检测,分析影响LipR酶活性的因素;将重组质粒于小鼠胫前肌肉注射0.1 mL(含质粒DNA 100μg)3次(第1,8,15天),末次注射后7 d,处死小鼠,取肺、脾脏进行细胞因子检测。结果成功构建重组表达质粒,并发现LipR蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,蛋白相对分子质量约为33×10~3;在标准水解活性实验条件(40℃,pH7.5)下,其最适水解底物为4-硝基苯基乙酸酯(pNPA,C2);以4-硝基苯基丁酸酯(pNPB,C4)作为底物,测得LipR水解活性的最适pH值为8.5,最适反应温度为40℃,说明LipR是一种相对耐碱耐热的酯酶;而在不同的除垢剂或金属离子存在的环境下,LipR水解pNPB的活性受到一定程度地抑制。重组质粒注射小鼠后,发现LipR能抑制γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-2的分泌,但IL-10分泌量增加。结论酯酶LipR可能参与帮助MTB协同抵抗宿主内苛刻的环境,并充当免疫调节剂,抑制促炎细胞因子分泌。

关键词：结核分枝杆菌 Lip家族 α/β水解酶脂酶/酯酶细胞因子

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结核分枝杆菌脂解酶Rv1076（LipU）促进细菌生存及宿主细胞因子的表达

结核分枝杆菌脂解酶Rv1076（LipU）促进细菌生存及宿主细胞因子的...

引用

作者：李春燕西南大学

学位级别：硕士

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌复合菌群感染所导致的一种人畜共患病,严重威胁着人类健康,是世界性的公共卫生难题。据世界卫生组织（WHO）报道,近年来结核病“死灰复燃”,全世界约三分之一的人为结核分枝杆菌潜伏感染者,... 详细信息

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌复合菌群感染所导致的一种人畜共患病,严重威胁着人类健康,是世界性的公共卫生难题。据世界卫生组织（WHO）报道,近年来结核病“死灰复燃”,全世界约三分之一的人为结核分枝杆菌潜伏感染者,每年新增感染者上千万,死亡人数高达数百万。中国是全球第三大结核病高负担国家,感染人数、患病人数和死亡人数均高于全球平均水平。近年来,耐多药（Multidrug-resistant tuberculosis,MDR）、广泛耐药（Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR）以及HIV共感染等问题的出现与扩散更加剧了结核病的严峻形势。分枝杆菌细胞壁含有大量脂质,约占细胞干重的30~40%,但它们的生物功能、合成途径及其错综复杂的结构仍然是个谜。研究表明,在感染过程中,结核分枝杆菌可积累大量的脂质（包括来自宿主细胞的脂类）,并以三酰甘油（TAG）形式储存起来,以维持细菌生存。处于非复制阶段的结核分枝杆菌可在宿主细胞内持续存活几十年,尤其难以消灭。在重新激活的情况下,TAG被用作能量来刺激细胞恢复到复制状态,从而导致活性感染。结核分枝杆菌基因组中有大量的基因编码脂质代谢相关的酶类（约250个）,其中,脂解酶可水解细菌储存的脂质,为结核分枝杆菌生存提供能量。这些酶主要分为五大家族:Lip家族、磷脂酶家族、角质酶家族、β-内酰胺酶家族和PE/PPE家族。它们在分枝杆菌的生命周期、持留和毒力中发挥着关键作用。深入研究这些酶的特性与功能,将有助于开发新型抗结核药物和诊断试剂。本课题以结核分枝杆菌H37Rv中Lip家族成员Rv1076（LipU）为研究对象,深入探索了LipU的酶学特性及功能。基于LipU与激素敏感型家族脂酶（HSL）一样,都具有保守的五肽模序“GXSXG”而被注释为脂酶/酯酶。为了确定Rv1076的酶学特性及功能,我们对该蛋白进行了表达纯化,并测定其活性、酶学特性及酶学动力学参数;然后通过定点突变来验证LipU的活性位点残基。同时,将其在耻垢分枝杆菌中的同源基因进行了敲除,以探索LipU的功能;通过细胞因子检测来揭示LipU在宿主免疫应答中的作用。实验结果发现,LipU对短链的对硝基苯酚酯具有高度的催化活性,其最适温度和pH分别为40℃、pH 8.0。LipU的酶活、Km和Vmax值分别为176.7 U/mg,1.73μM和62.24μM/min;离子型表面活性剂对LipU的活性影响较大;将其活性位点Ser140,Asp244和His269突变后,酶活几乎完全丧失。Rv1076在饥饿处理下显著上调;将该基因敲除后,耻垢分枝杆菌对碳源的利用能力降低,表明LipU对于结核分枝杆菌在胁迫条件下的生存具有关键作用。我们将重组蛋白rLipU与巨噬细胞THP-1共孵育后,检测到细胞因子TNF-α和IL-12显著上调,由此表明,LipU参与了宿主免疫应答,具有良好的免疫原性。本研究详细地阐释了结核分枝杆菌LipU的特性与功能,有助于提高大家对Lip家族的认识,并且为其他脂酶的研究提供了参考,为开发新型抗结核病药物和诊断试剂提供新思路。

关键词：脂酶/酯酶结核分枝杆菌 Rv1076(LipU)

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