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乳腺癌中肉碱棕榈酰转移酶1的表达及其在乳腺癌发生发展中的作用

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中华实验外科杂志 2015年第5期32卷 973-975页

作者：薛丹丹姜丹丹吕志栋王新刚李福年青岛大学医学院 266071 青岛大学附属医院乳腺病诊疗中心

目的观察乳腺癌中肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）的表达及其在乳腺癌发生发展中的作用.方法采用免疫组织化学方法检测211例乳腺癌患者（中位年龄50.7岁）的癌组织及癌旁组织标本中CPT1蛋白的表达,探讨CPT1与临床病理特征之间的关系.结果 C... 详细信息

目的观察乳腺癌中肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）的表达及其在乳腺癌发生发展中的作用.方法采用免疫组织化学方法检测211例乳腺癌患者（中位年龄50.7岁）的癌组织及癌旁组织标本中CPT1蛋白的表达,探讨CPT1与临床病理特征之间的关系.结果 CPT1在乳腺癌组织中阳性表达140例（66.35％）,癌旁组织中阳性表达13例（6.16％）,两者差异有统计学意义（P＜0.01）.细胞组织学Ⅲ级、肿瘤最大径＞2 cm、淋巴结有转移、细胞核增殖抗原（Ki-67）阳性表达率≥14％、雌激素受体（ER）阳性表达及人类表皮生长因子受体-2（Her-2）阳性表达组CPT1阳性表达率显著高于细胞学分级Ⅰ～Ⅱ级（P＜0.01）、肿瘤最大径≤2cm（P＜0.01）、淋巴结无转移（P＜0.01）、Ki-67阳性表达率＜14％（P＜0.01）、ER阴性表达（P＜0.01）及Her-2阴性表达组（P＜0.01）,在发病年龄、月经状态及孕激素受体（PR）表达分组中差异无统计学意义（P＞0.05）.结论乳腺癌组织中CPT1阳性表达率增高,CPT1能促进癌细胞增殖、侵袭及转移,与乳腺癌的发生、发展关系密切.

关键词：乳腺癌肉碱棕榈酰转移酶1 脂肪酸β氧化增殖

兔动脉粥样硬化形成过程中血管平滑肌细胞CPT-1和GLUT-4的变化

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兔动脉粥样硬化形成过程中血管平滑肌细胞CPT-1和GLUT-4的变化

作者：崇爱国安徽医科大学

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动脉粥样硬化发病机制非常复杂,曾有多种学说从不同角度来阐述。平滑肌细胞在动脉粥样硬化形成过程中起到很重要的作用,平滑肌细胞的增殖、迁移和分泌细胞外基质是动脉粥样硬化发生发展的基本特征之一。动脉粥样硬化时,血管平滑肌细胞... 详细信息

动脉粥样硬化发病机制非常复杂,曾有多种学说从不同角度来阐述。平滑肌细胞在动脉粥样硬化形成过程中起到很重要的作用,平滑肌细胞的增殖、迁移和分泌细胞外基质是动脉粥样硬化发生发展的基本特征之一。动脉粥样硬化时,血管平滑肌细胞发生增殖,向内膜下迁移并摄取脂质成为肌源性泡沫细胞,平滑肌细胞要完成这些生物学行为必然伴有能量的消耗。我们推测动脉粥样硬化形成过程中血管平滑肌细胞能量代谢发生了改变。本研究通过观察血管壁糖代谢和脂代谢两个关键酶表达的变化来探讨此问题。目的:观察高脂饮食复制的兔动脉粥样硬化模型过程中第8、16、24周血管平滑肌细胞层碱棕榈酰转移酶I(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-1)和葡萄糖转运蛋白4 (Glucose transporter-4,GLUT-4)表达的变化,来探讨动脉粥样硬化形成过程中的血管平滑肌细胞能量代谢的变化情况,探讨动脉粥样硬化的发病机制。方法:同批健康雄性新西兰大白兔36只,随机分成两组,每组18只,正常对照组给予普通饲料,模型组给予高脂饮食。在喂养的第8、16和24周,两组兔子随机各处死6只,进行病理学形态学观察主动脉组织学变化并进行病理形态学定量分析;生化法检测血清总胆固醇(Tc)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC);逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定各组胸主动脉血管平滑肌层CPT-1mRNA和GLUT-4 mRNA的表达;免疫组织化学法测定血管平滑肌CPT-1和GLUT-4的表达。结果:1.同正常对照组比较,各高脂组血清TC、TG和LDLC浓度升高(P脂肪酸的利用减少而糖利用增加,晚期脂肪酸和糖的利用都减少,推断动脉粥样硬化过程中血管平滑肌细胞存在能量代谢障碍。

关键词：动脉粥样硬化肉碱棕榈酰基转移酶-1 葡萄糖转运蛋白4 逆转录聚合酶链反应脂肪酸β氧化

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糖尿病情况下乙酸生成的机理和生理意义

糖尿病情况下乙酸生成的机理和生理意义

作者：温雅馨厦门大学

学位级别：硕士

糖尿病是一种以血糖水平显著升高为特点的代谢综合症。长期高血糖可导致一系列并发症,严重威胁患者的生命健康。研究糖尿病情况下机体代谢的改变,有助于更好地了解血糖升高的机理,开发相应的降血糖的方法。有研究显示,部分糖尿病患者血... 详细信息

糖尿病是一种以血糖水平显著升高为特点的代谢综合症。长期高血糖可导致一系列并发症,严重威胁患者的生命健康。研究糖尿病情况下机体代谢的改变,有助于更好地了解血糖升高的机理,开发相应的降血糖的方法。有研究显示,部分糖尿病患者血液中乙酸水平显著升高。然而,在糖尿病情况下乙酸生成的分子机制和生理意义尚不清楚,本文对此进行了研究,以期为开发新的降血糖策略寻找线索。首先,用NMR检测了 STZ诱导的糖尿病小鼠血液中的乙酸浓度,证实了糖尿病的确能导致血液乙酸升高,并用实验证明了这种乙酸升高主要源于小鼠自身组织,而非肠道菌群。然后,通过同位素示踪法证明在低葡萄糖条件下体外培养的哺乳动物细胞产生的乙酸主要源于脂肪酸,并通过一系列基因过表达和敲低实验确定了催化乙酸生成的主要酶为ACOT8。进一步,通过肝脏特异性敲低ACOT8证明肝细胞中的ACOT8介导了糖尿病情况下的乙酸生成,其机理是ACOT8催化脂肪酸来源的乙酰辅酶A水解生成乙酸和还原型辅酶A(CoASH),导致血液乙酸水平升高。另外,我们初步阐明了糖尿病情况下ACOT8催化乙酰辅酶A生成CoASH和乙酸的生理意义:一方面,肝细胞中一定水平的CoASH是脂肪酸β氧化的必须条件,ACOT8催化乙酰辅酶A生成CoASH,能保证肝细胞中脂肪酸β氧化的持续进行;另一方面,该反应产生的乙酸,能为肝外组织,如大脑提供能源物质。综上所述,本研究初步阐明了糖尿病情况下血液乙酸水平升高的分子机制和生理意义。结合已有的关于乙酸可以刺激胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性、抑制体内脂肪酸积累的研究,我们认为乙酸有可能作为糖尿病治疗的一种策略,而我们的研究结果可能为解释乙酸治疗糖尿病的机理及寻找乙酸治疗糖尿病的靶点提供基础。

关键词：糖尿病脂肪酸β氧化乙酰辅酶A 乙酸 ACOT8

利拉鲁肽通过上调肝脏局部的ACE2/A1-7/MAS轴改善小鼠的非酒精性脂肪肝

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利拉鲁肽通过上调肝脏局部的ACE2/A1-7/MAS轴改善小鼠的非酒精性...

作者：杨梦萦华中科技大学

学位级别：硕士

目的:1.通过体内外建立的NAFLD模型,观察利拉鲁肽对NAFLD模型的小鼠及HepG2细胞的肝细胞脂肪变、糖异生及炎症等方面的改善效应及对肝脏局部RAAS系统ACE/AngⅡ/AT1R轴和ACE2/A1-7/MAS轴表达的调控作用,探讨RAAS系统在利拉鲁肽改善NAFLD... 详细信息

目的:1.通过体内外建立的NAFLD模型,观察利拉鲁肽对NAFLD模型的小鼠及HepG2细胞的肝细胞脂肪变、糖异生及炎症等方面的改善效应及对肝脏局部RAAS系统ACE/AngⅡ/AT1R轴和ACE2/A1-7/MAS轴表达的调控作用,探讨RAAS系统在利拉鲁肽改善NAFLD中所起的作用及机制。2.使用ACE2敲除的小鼠及外源性A1-7干预NAFLD模型的C57BL/6J小鼠分别下调及上调ACE2/Ang-(1-7)/MAS轴以进一步证明ACE2/Ang-(1-7)/MAS轴在NAFLD中所直接扮演的角色。方法:1.选用15只6周龄雄性C57BL/6J小鼠,长期高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导T2DM非酒精性脂肪肝模型。造模成功后随机分为T2DM模型组(T2DM组)(n=5),利拉鲁肽干预组(n=5)(利拉鲁肽组)和Ang-(1-7)干预组(A1-7组)(n=5)。另选取5只正常的雄性C57BL/6J小鼠持续普通饲料喂养作为正常对照组(NC组)(n=5)。药物干预组均持续给药4周。实验结束后,肝脏组织HE染色和油红O染色及TG含量测定检测肝脏的脂肪变情况;RT-PCR检测肝脏CPT-1a、ACOX-1、G6P、PEPCK、NFκB和IL-1β的mRNA表达水平。***组,T2DM模型组及利拉鲁肽组采用RT-PCR方法检测肝脏RAAS系统组分ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达水平。***2基因敲除(ACE2 KO)和野生型(WT)小鼠各选取3只,均持续给予普通饲料喂养,肝脏组织HE染色和油红O染色及TG含量测定观察肝脏的脂肪变情况;RT-PCR检测肝脏CPT-1a、ACOX-1、G6P、PEPCK、NFκB和IL-1β的mRNA表达水平。4.0.25mM浓度的棕榈酸(PA)干预HepG2细胞诱导肝细胞脂肪变,建立体外NAFLD模型。为了检测在体外NAFLD条件下利拉鲁肽对HepG2细胞RAAS组分基因表达的影响及信号通路PI3K/AKT在其中所起的作用,我们将细胞分为正常对照组(C组)、0.25mM PA组(PA组)、PA+利拉鲁肽(10 nmol/L)组(利拉鲁肽组)、PA+利拉鲁肽(10 nmol/L)+PI3K抑制剂LY294002(20umol/L)组(LY294002组)。干预24小时后,Western blot检测各组细胞AKT、P-AKT蛋白的表达,RT-PCR检测各组细胞RAAS系统组分ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达。5.为了检测ACE2/A1-7/MAS轴在利拉鲁肽介导的改善NAFLD效应中所扮演的角色,我们使用MAS受体特异性拮抗剂A779,检测阻断ACE2/A1-7/MAS轴对利拉鲁肽效应的影响。0.25mM浓度的棕榈酸(PA)干预HepG2细胞诱导肝细胞脂肪变,建立体外NAFLD模型。这部分实验将细胞分为正常对照组(C组)、0.25mM PA组(PA组)、PA+利拉鲁肽(10 nmol/L)组(利拉鲁肽组)、PA+Ang-(1-7)(10mol/L)组(A1-7组)、PA+利拉鲁肽(10 nmol/L)+Ang-(1-7)(10mol/L)组(利拉鲁肽+A1-7联合组)、PA+利拉鲁肽(10 nmol/L)+A779(10mol/L)组(利拉鲁肽+A779组)。干预24小时后,检测各组细胞中甘油三酯(TG)的含量;RT-PCR检测CPT-1a、ACOX-1、G6P、PEPCK、NFκB和IL-1β的mRNA表达;细胞免疫荧光法检测NFκBp65因子的核转位;Western blot检测AMPK、P-AMPK蛋白的表达。6.所有的实验数据采用SPSS11.5统计学软件进行分析,以均数±标准差表示,两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA);P脂肪沉积,肝细胞内红色脂滴明显增多,利拉鲁肽组肝脏组织学结构及脂肪变明显得到改善,红色脂滴明显减少;TG含量检测结果显示:T2DM组肝脏TG含量显著高于NC组(P脂肪酸β氧化相关基因CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达降低(分别P<0.01和P<0.05),糖异生的关键酶G6P、PEPCK的mRNA表达升高(均P<0.01),炎症信号NFκB及IL-1βmRNA表达也升高(均P<0.01)。和T2DM组相比,利拉鲁肽组CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达明显升高(分别P<0.01和P<0.05),G6P、PEPCK的mRNA表

关键词：非酒精性脂肪肝肾素血管紧张素系统胰高血糖素样肽-1 脂肪酸β氧化糖异生炎症

miRNA-23b-5p调控棕色脂肪细胞生热作用与机制研究

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miRNA-23b-5p调控棕色脂肪细胞生热作用与机制研究

作者：高尧南京医科大学

学位级别：硕士

肥胖是由机体能量代谢紊乱引起的白色脂肪组织在体内积聚过多而导致的营养障碍性疾病。肥胖的危害巨大,是2型糖尿病、心血管疾病、高血压、脂肪肝及部分恶性肿瘤等疾病发生的重要因素,不仅严重威胁个人健康,也给家庭和社会造成巨大经济... 详细信息

肥胖是由机体能量代谢紊乱引起的白色脂肪组织在体内积聚过多而导致的营养障碍性疾病。肥胖的危害巨大,是2型糖尿病、心血管疾病、高血压、脂肪肝及部分恶性肿瘤等疾病发生的重要因素,不仅严重威胁个人健康,也给家庭和社会造成巨大经济损失。棕色脂肪组织（Brown adipose tissue,BAT）具备将脂肪以热能消耗掉这一独特而强大的代谢能力。此外棕色脂肪组织的活性与体重、BMI呈负相关,因此通过激活体内棕色脂肪活性成为肥胖治疗研究领域最具前景的突破口。micro RNA（miRNA）是一类重要的小非编码RNAs（21-24核苷酸）,广泛参与不同的生物学过程,在转录后水平负反馈调节基因表达。近年,miRNA在脂肪细胞分化及产热中扮演重要的角色,而且其表达受到环境因素（寒冷）、药物（如肾上腺素受体激动剂、PPARγ激动剂等）、激素（如BMP7、T3等）等多种因素的调控,如此复杂的调控网络有效地维持着机体脂肪组织的内分泌稳态。目前,尽管多个miRNA（miR-133a、miR-196a、miR-155等）被报道能作为关键因子对棕色脂肪功能进行调控,但是仍不足以完整阐释miRNA调控棕色脂肪功能的机制,进一步寻找新的miRNA填补现有制的空缺、构建更为完善的调控网络,将对肥胖的治疗提供有力的支持。为进一步挖掘寒冷因素调控的miRNAs,我们采用miRNA测序技术（miRNA Sequencing）筛选寒冷刺激前后小鼠BAT中差异表达的miRNAs,结果显示:82条miRNA差异表达于寒冷刺激下的小鼠BAT（|fold change|≥1,P＜0.05）,其中38条高表达于寒冷刺激后的BAT,44条低表达于寒冷刺激后的BAT。依据信号值大、组内差异小的原则,我们选择20条miRNA进行q PCR验证,结果与测序结果基本一致。为了进一步缩小miRNA的筛选范围,我们应用体外分离的小鼠和人原代棕色脂肪前体细胞并诱导分化成熟,采用β3-肾上腺素受体激动剂CL-316,243（CL）和毛喉素（FSK）模拟体外的激活状态,进一步检测差异miRNA的表达变化。研究结果显示:相对于CL,FSK刺激下miR-23b-5p,miR-133a-3p,miR-135-5p,miR-491-5p和miR-150-3p表达明显下降,miR-455-5p表达显著增加。其中,miR-23b-5p因其体内外表达差异显著、丰度较高（CT＜30）且尚未在脂肪组织或脂肪细胞中有任何功能报道,进而成为候选miRNA。为进一步提示miR-23b-5p在棕色脂肪细胞中发挥重要的调控作用,我们在在体CL药物刺激和不同周龄小鼠BAT中检测miR-23b-5p的表达,并分析miR-23b-5p表达水平与BAT功能标志基因Ucp-1的表达是否存在相关性,结果显示:miR-23b-5p在CL刺激的BAT中表达显著下调,且随着小鼠年龄增加在BAT中逐渐升高;miR-23b-5p与BAT功能标志基因Ucp-1的表达成显著负相关。以上证据进一步支持我们提出的设想:miR-23b-5p可能负向调控棕色脂肪细胞分化与产热的过程。为了探究miR-23b-5p在棕色脂肪细胞中的功能,我们通过构建miR-23b-5p过表达的慢病毒载体在小鼠棕色脂肪前体细胞中过表达miR-23b-5p,对细胞的成脂分化和产热的能力进行评估。结果显示:过表达miR-23b-5p对小鼠棕色脂肪细胞成脂水平无影响,但可以显著减少线粒体的数量和损害线粒体功能,降低棕色脂肪细胞功能标志基因Ucp-1的m RNA和蛋白水平。通过Targetscan、RNA22、miRwalk等miRNA数据库对miR-23b-5p潜在靶基因进行预测,其中Fatp4、Adam12、Ern1基因成为候选靶标,其3’UTR存在与miR-23b-5p结合的位点。q PCR检测结果显示miR-23b-5p过表达后,仅有Ern1的表达水平显著降低,而其他基因无显著变化。荧光素酶报告基因检测提示miR-23b-5p与靶标ERN1的3’UTRs不存在结合关系。结合已有的文献报道,棕色脂肪细胞产热功能的调节与脂肪细胞脂解过程、线粒体呼吸链各组分、脂肪酸β氧化过程密切相关。为了寻找miR-23b-5p下游调控的线索,我们筛选了以上三个过程中重要的基因,结果显示:miR-23b-5p主要是通过调控脂解和脂肪酸β氧化途径来影响产热,而对线粒体呼吸链各组分的表达无显著影响。综上所述:寒冷相关的miRNA参与BAT功能的调节,其中miR-23b-5p在棕色脂肪细胞产热相关的基因程序调控中可能发挥重要的作用,阐明其调控因素及对棕色脂肪细胞生热功能的作用与机制,将有助于完善棕色脂肪细胞功能调控网络,为开发棕色脂肪功能激活的新药物提供支持,为肥胖治疗带来光明的前景。第一部分寒冷刺激下棕色脂

关键词： microRNA miR-23b-5p 棕色脂肪组织肥胖脂肪酸β氧化

灵芝ATP合酶介导产生的ATP在影响灵芝三萜合成中的分子机制研究

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灵芝ATP合酶介导产生的ATP在影响灵芝三萜合成中的分子机制研究

作者：岳思宁南京农业大学

学位级别：硕士

灵芝(Ganodermalucidum)是一种具有药用价值的真菌。灵芝三萜,又被称为灵芝酸(Ganodericacids,GAs),是灵芝主要的活性成分之一。但灵芝目前的基础研究并不深入,因此限制了灵芝发酵产业的发展。而近年来灵芝的全基因组也被报道出来,使灵... 详细信息

灵芝(Ganodermalucidum)是一种具有药用价值的真菌。灵芝三萜,又被称为灵芝酸(Ganodericacids,GAs),是灵芝主要的活性成分之一。但灵芝目前的基础研究并不深入,因此限制了灵芝发酵产业的发展。而近年来灵芝的全基因组也被报道出来,使灵芝可以进行更为细致的分子机制研究。腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)是生物中重要的“能量货币”,几乎参与了所有的生命过程。ATP合酶(ATP synthase)在所有真核生物的线粒体内膜上都有分布,是真核生物合成ATP的关键合酶。在动物和植物相关研究中,ATP在调控细胞代谢以及其它各种生命过程中都发挥了十分重要的作用,但是在真菌乃至微生物中,类似的研究却并不多见。本研究结果表明热胁迫(Heat stress,HS)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)、水杨酸(Salicylic acid,SA)以及氮饥饿(Nitrogen starvation)处理能使 WT 菌丝(Wild type)中ATP含量分别下降60.0%、74.5%、52.0%与67.0%;此时GAs的含量分别上升83.5%、68.0%、31.9%与35.5%。在此基础上,本研究通过外源添加2 μM寡霉素(Oligomycin,Oli)处理灵芝WT菌丝,使灵芝ATP含量下降91.1%,GAs含量上升66.5%;外源添加4 mM腺苷(Adenosine,Ade)处理灵芝WT菌丝使灵芝ATP含量上升102.0%,GAs含量下降53.5%。因此,根据上述结果推测灵芝胞内ATP的变化会影响灵芝GAs的合成。灵芝胞内ATP含量下降引起灵芝GAs含量上升具有实际生产意义,因此本研究继续探究了其具体的分子机制。首先,本研究在灵芝基因组库中鉴定并克隆了 ATP合酶β亚基,命名为GlATPsyn-β。该基因全长1626 bp,编码一个长度为542个氨基酸,大小为57.96 kDa的蛋白;然后,本研究使用RNAi技术构建了GlATPsyn-β沉默效率为53.3%与62.7%两个沉默转化子,分别命名为ATPsyn-beta-1i与ATPsyn-beta-12i。当沉默GlATPsyn-β时,两转化子胞内ATP含量分别下降69.3%与75.2%,GAs含量分别上升158.7%与142.1%。为了在代谢水平上探究灵芝胞内ATP含量下降引起灵芝GAs含量上升的机制,本研究检测了 GAs合成的最初底物乙酰辅酶A的含量变化,结果表明灵芝胞内ATP含量下降时乙酰辅酶A含量显著上升。为了探究乙酰辅酶A上升的来源,本研究检测了乙酰辅酶A的主要来源—糖酵解丙酮酸脱羧以及脂肪酸β氧化代谢的相关基因与酶活性变化,最终发现脂肪酸β氧化相关基因表达量与酶活性显著上升。为了证明脂肪酸β氧化参与了灵芝胞内ATP含量下降引起的灵芝GAs含量上升,本研究构建了ATP合酶β亚基与脂肪酸β氧化关键酶中链脂酰辅酶A脱氢酶ACD与β羟脂酰辅酶A脱氢酶HCD的双沉默菌株ATPsyn-ACD与ATPsyn-HCD,并与使用10 μM脂肪酸β氧化抑制剂etomoxir(eto.)处理GlATPsyn-β沉默菌株做药理学实验对比。结果表明ATPsyn-ACD、ATPsyn-HCD双沉默菌株和使用10 μM eto.处理GlATPsyn-β沉默菌株时GAs含量与GlATPsyn-β沉默菌株相比至少下降35.9%,并且与WT菌株相比无明显差异。而此时ATPsyn-ACD、ATPsyn-HCD双沉默菌株乙酰辅酶A含量与GlATPsyn-β沉默菌株相比也至少下降51.5%,并且与WT菌株相比无明显差异。因此,本研究认为在代谢水平上脂肪酸β氧化参与了灵芝胞内ATP含量下降引起的灵芝GAs含量上升的过程。在真核生物中ATP水平的变化常会影响胞内第二信使环腺苷酸cAMP的含量,为了在信号水平上探究灵芝胞内ATP含量下降引起灵芝GAs含量上升的机制,本研究检测了 ATP含量下降时灵芝胞内环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)途径相关底物与酶活性的变化,结果表明GlATPsyn-β两个沉默菌株胞内cAMP含量上升分别上升316.2%与296.1%,PKA酶活性分别提高53.2%与50.9%。为了证明cAMP-PKA途径参与了灵芝胞内ATP含量下降引起灵芝GAs含量上升的过程,本研究构建了 ATP合酶β亚基与PKA催化亚基PKAc的双沉默菌株ATPsyn-PKAc,并与使用20 μM PKA抑制剂H89处理GlATPsyn-β沉默菌株做药理学实验对比。此时实验结果表明ATPsyn-PKAc和使用20 μM PKA抑制剂H89处理GlATPsyn-β沉默菌株时GAs的含量与GlATPsyn-β沉默菌株相比至少下降39.3%,并且与WT菌株相比

关键词：灵芝 ATP GAs 乙酰辅酶A 脂肪酸β氧化 cAMP-PKA途径

杜仲木脂素对HepG2细胞甘油三酯聚集的影响

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杜仲木脂素对HepG2细胞甘油三酯聚集的影响

作者：李慧中南大学

学位级别：硕士

背景：高甘油三酯血症是心血管疾病剩留风险的主要危险因素之一,目前,临床上针对性控制血浆甘油三酯的药物种类较少,疗效和安全性存在缺陷,开发新的降甘油三酯药物具有重要意义。杜仲含有多种药理活性成分,具有降血压、降血脂、抗氧化... 详细信息

背景：高甘油三酯血症是心血管疾病剩留风险的主要危险因素之一,目前,临床上针对性控制血浆甘油三酯的药物种类较少,疗效和安全性存在缺陷,开发新的降甘油三酯药物具有重要意义。杜仲含有多种药理活性成分,具有降血压、降血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、保护心肌等作用。杜仲木脂素是从杜仲中提取的有效部位。在治疗高血压疾病的临床应用中,杜仲木脂素可降低伴随有高血脂的患者的血浆甘油三酯。因此,研究杜仲木脂素对甘油三酯代谢的影响,阐明其机制,将为杜仲木脂素降甘油三酯功效的开发和临床应用提供理论依据。目的：研究杜仲木脂素对油酸孵育的HepG2细胞甘油三酯聚集的影响及其机制。方法：本课题采用HepG2细胞作为实验材料。在研究杜仲木脂素对HepG2生长的影响实验中,实验分为7组(空白对照组,15mg/L,37.5mg/L,75mg/L,150mg/L,300mg/L,600mg/L木脂素干预组)。采用MTT一步法检测A490值来评估细胞数目。在研究杜仲木脂素对OA孵育的HepG2细胞甘油三酯聚集的影响实验中,实验共分为6组：空白对照组;油酸(OA)孵育模型组(0.5mM OA);低浓度(0.5mM OA+15mg/L杜仲木脂素)、中浓度(0.5mM OA+30mg/L杜仲木脂素)和高浓度杜仲木脂素组(0.5mM OA+45mg/L杜仲木脂素);非诺贝特组(0.5mM OA+100μmo/L非诺贝特)。采用酶法测定细胞的甘油三酯含量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测细胞PPARα、FAS、CPTlA的mRNA,蛋白质印迹法检测细胞FAS、CPT1A、 PPARα蛋白表达水平。结果：与正常对照组相比,15mg/L～300mg/L杜仲木脂素组细胞数目差异不具有统计学意义,无细胞毒性。而600mg/L杜仲木脂素组的细胞数减少,差异具有统计学意义(0.83±0.17vs1.00±0.08,P=0.011)。与空白对照组相比,用0.5mM的OA孵育的HepG2细胞内甘油三酯的含量增加(3.13±0.27vs1.00±0.00,P脂肪酸氧化有关。

关键词：甘油三酯自由脂肪酸脂肪酸β氧化杜仲木脂素脂质

羊毛固醇合成酶（LSS）基因缺失对C57小鼠非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的影响

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羊毛固醇合成酶（LSS）基因缺失对C57小鼠非酒精性脂肪肝病（NAFL...

作者：李名聪安徽医科大学

学位级别：硕士

背景和目的:非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一组没有过量饮酒或其他肝病原因(包括自身免疫性,药物性或病毒性肝炎)的情况下,以超过5%肝实质细胞存在脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征,包括:非酒... 详细信息

背景和目的:非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一组没有过量饮酒或其他肝病原因(包括自身免疫性,药物性或病毒性肝炎)的情况下,以超过5%肝实质细胞存在脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征,包括:非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。据估计,NAFLD的全球患病率为25%,并且在全球范围内继续上升。NAFLD是一种进行性疾病,可从单纯性脂肪变性发展为肝硬化,肝细胞癌。其发病机制尚不清楚、也没有有效的治疗措施,因此,深入探讨其发病机制是NAFLD研究的重点之一。本研究利用LSS+/-小鼠建立非酒精性脂肪肝小鼠模型,探讨羊毛固醇合成酶对无胆碱-蛋氨酸饲料(methionine-and choline-deficient,MCD)诱导的非酒精性脂肪肝病的影响,并初步探讨可能的分子机制,阐明羊毛固醇在非酒精性脂肪肝疾病中的作用。方法:(1)采用MCD饲料饮食诱导建立NAFLD小鼠模型。40只SPF级雄性8周龄野生型(Wide type,Wt),LSS敲除鼠(LSS,KO)小鼠,体重(24±2)g,随机分为N-wt组,N-ko组,M-wt组,M-ko组共4组,每组10只,分别给予正常饲料(normal diet control,NC)或MCD,连续喂养2周,每天称量小鼠体重,动态监测饮食数据。在实验过程中,观察小鼠状态情况。实验结束后将小鼠麻醉处理,称重;收集血清;取肝脏并称重,计算肝指数;测定空腹血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、血清和肝匀浆的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC),并进行肝脏病理切片分析。(2)采用苏木素-伊红染色(HE)、油红O染色和电子显微镜方法,检测小鼠肝脏脂质沉积情况;天狼星红染色检测肝脏纤维化情况;质谱分析代谢组学方法检测各组肝脏组织差异脂质成分;基因芯片方法检测各组肝脏差异表达基因;免疫印迹(western blot,WB)方法检测脂肪酸氧化分解及胆汁酸合成的相关蛋白表达情况,同时检测SREBP2蛋白以及AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果:(1)小鼠状态情况:MCD饲养过程中,正常对照组小鼠体重持续增长,N-ko与N-wt两组无明显的差别。实验组小鼠的体重逐渐呈下降趋势,且M-ko与M-wt小鼠组无显著性差异。(2)小鼠肝组织形态学观察:HE染色显示N-wt组和N-ko组两组肝脏组织结构正常,肝细胞以中央静脉为中心,成条索状排列;油红染色没有明显的脂滴存在。M-wt组脂滴体积大、占位明显,细胞坏死及炎症细胞浸润,油红染色显示有大量的脂滴。而M-ko组脂滴显著较小、占位不显著,没有明显的细胞坏死及炎症细胞浸润。Nash评分M-wt组显著高于M-ko组(p氧化物酶体、昼夜节律、谷胱甘肽代谢、细胞凋亡及胆汁酸代谢等过程存在差异;N-wt组与M-wt组比较发现在氧化磷酸化、固醇类激素合成代谢、过氧化物酶体、谷胱甘肽代谢、PPAR信号途径、胆固醇代谢、脂肪酸代谢、初级胆汁酸合成代谢等过程存在差异;N-ko组与M-ko组在视黄醇代谢、脂肪酸降解、胆固醇代谢、谷胱甘肽代谢、PPAR信号途径等过程存在差异;M-wt组与M-ko组比较发现在氧化磷酸化、脂肪酸降解、过氧化物酶体、PPAR信号途径、初级胆汁酸合成及p53信号途径等过程存在差异。(6)Real-time PCR结果分析发现M-ko组中脂肪酸分解代谢相关的14基因表达水平与M-wt组相比均显著上调;M-ko组中胆汁酸合成代谢相关的9个基因表达水平与M-wt组相比均显著上调。(7)肝脏代谢组分析结果发现N-wt、N-ko两组肝脏的主要脂质成分没有显著性差异;M-wt组TG、CHE在肝脏脂质占比及绝对含量均显著高于M-ko组,而PC与PE结果则相反。(8)肝脏电镜结果分析发现N-wt组与N-ko组肝细胞线粒体结构完整,两组间没有显著差异;M-wt组肝脏细胞线粒体损伤比M-ko组严重;M-wt组肝脏细胞脂滴大、占位显著。而M-ko组

关键词：羊毛固醇合成酶非酒精性脂肪肝胆固醇脂肪酸β氧化胆汁酸合成

抗性糊精改善肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗的作用及机制探讨

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抗性糊精改善肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗的作用及机制探讨

作者：胡帆上海交通大学

学位级别：硕士

目的:观察抗性糊精对肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响,并探索其潜在的机制。方法:分别采用两种动物模型进行实验。第一种动物模型采用8周龄SPF级雄性db/db(C57BL/Ks J)小鼠10只,随机分为对照组和抗性糊精处理组,每组5只,分别予以蒸馏水和... 详细信息

目的:观察抗性糊精对肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响,并探索其潜在的机制。方法:分别采用两种动物模型进行实验。第一种动物模型采用8周龄SPF级雄性db/db(C57BL/Ks J)小鼠10只,随机分为对照组和抗性糊精处理组,每组5只,分别予以蒸馏水和抗性糊精灌胃9周。第二种动物模型采用4周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠17只,适应性喂养1周后,随机分为两组,普通饮食(Normal diet,ND)组5只,高脂高果糖饮食(High fat high fructose diet,HFHFD)组12只,分别给予普通饲料和高脂高果糖饲料喂养12周。造模期间每周检测体重,每4周测定FBG。12周后将HFHFD组小鼠随机分为HFHFD+RD和HFHFD组,每组6只,分别予抗性糊精或蒸馏水灌胃10周,两组均继续HFHFD。ND组仍普通饮食,同时蒸馏水灌胃10周。干预期间记录小鼠进食量、检测体重、空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG),干预结束后行葡萄糖耐量试验(Glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)。小鼠处死后,留取血和肝脏标本,ELISA法检测血清空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)水平,根据公式FBG(mmol/L)×FINS(μU/L)/22.5计算HOMA-IR,全自动生化分析仪测定血清TG、TC、LDL-Ch、HDL-Ch。肝脏组织称重,根据肝重/体重计算肝指数,酶法测定肝脏TG、TC含量,HE染色观察肝组织病理学改变。实时荧光定量PCR法检测小鼠肝脏胰岛素信号通路和脂肪酸β氧化通路相关基因m RNA相对表达量,Western blot法检测肝脏上述通路相应蛋白表达水平,利用16s r RNA测序检测肠道菌群变化。结果:HFHFD诱导的小鼠体重和FBG显著增加(P脂肪变性减少。肝脏胰岛素信号通路相关基因m RNA表达增加,肝脏p-IRS1表达减少,p-AKT、GLUT-2蛋白表达增加。抗性糊精干预的HFHFD小鼠脂肪酸β氧化通路相关基因FXR、PPARα、CPT1a、ACOX1 m RNA相对表达量升高(均P脂肪酸β氧化,降低血脂、减少肝脏脂质沉积,并能改善HFHFD小鼠肠道菌群失调。

关键词：膳食纤维抗性糊精胰岛素抵抗脂肪酸β氧化肠道菌群