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鸡催乳素受体胞外域的分子克隆及原核表达

华南农业大学学报 2006年第4期27卷 73-77页

作者：刘颖黎敏义刘志李孝伟施振旦华南农业大学动物科学学院广东广州510642

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌... 详细信息

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌Ecoli DH5α永久保存．通过设计第2对引物扩增PRLR胞外域cDNA片段，该片段经酶切后克隆到表达载体pRSETA的EcoRⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组质粒pR-PRLR．该质粒在转化感受态细菌*** B121（DF．3）后，在IPTG诱导下促使重组菌表达了相对分子质量为53640左右的重组融合蛋白，表达量在0．1mmol／L IPTG诱导5h时达到最高，约占总菌体蛋白的17．6％左右．表达产物可经体积分数为50％的Ni-NTA凝胶纯化，说明重组蛋白中具有正确的His-tag标签及之后的鸡催乳素受体编码区胞外域序列．

关键词：鸡催乳素受体基因胞外域克隆表达纯化

人EGF受体胞外域在大肠杆菌中表达、复性及抗原性鉴定

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免疫学杂志 2006年第4期22卷 362-365页

作者：徐丽慧洪岸何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广州510632

目的构建人EGF受体(EGFR)胞外域的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备EGFR特异性抗体,对表达产物进行鉴定。方法以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码胞外结构域L1、S1、L2(EGFRLSL)的DNA片段,并在其3′端加入编码His6标签的序... 详细信息

目的构建人EGF受体(EGFR)胞外域的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备EGFR特异性抗体,对表达产物进行鉴定。方法以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码胞外结构域L1、S1、L2(EGFRLSL)的DNA片段,并在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET3c连接构建EGFRLSL原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达;同时以纯化的EGFRL2结构域蛋白(EGFRL2)制备抗血清,以此抗血清鉴定表达产物。结果EGFRLSL在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,抗His6抗体免疫印迹分析表明,表达产物全部以包涵体形式存在,通过Ni2+NTA柱上复性获得纯化的可溶性EGFRLSL蛋白;免疫印迹分析表明,EGFRLSL与小鼠抗EGFRL2抗血清具有高特异性反应。结论从大肠杆菌中获得具有特异抗原性的可溶性EGFRLSL蛋白。

关键词：表皮生长因子受体胞外域原核表达包涵体抗原性

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白介素-1受体1胞外域的原核表达及鉴定

中国生物制品学杂志 2021年第12期34卷 1443-1448页

作者：周永飞韩顺子赵丹莹张健锋常军亮刘玉林曹玉锋刘景会长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130012 怡道生物科技(苏州)有限公司江苏苏州215004

目的原核表达白介素-1受体1(interleukin-1 receptor 1,IL-1R1)胞外域,并进行鉴定。方法从A375·S2细胞中扩增IL-1R1胞外域基因片段,克隆至载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-IL-1R1,转化入感受态OverExpress(DE3),经IPTG诱导表达,并进行亲和层析纯化。将纯化产物与弗氏佐剂充分乳化,免疫小鼠,分离血清,ELISA法检测血清抗体效价,Western blot和间接免疫荧光法检测抗体结合活性。结果菌落PCR及测序结果证明,重组表达质粒pET-28a-IL-1R1构建正确。表达产物的相对分子质量约34000,表达量为18%,纯化后纯度达93%,且可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。免疫小鼠血清效价约达1∶100000,且可与重组IL-1R1蛋白及A375·S2细胞中受体蛋白发生特异性结合。结论成功原核表达了IL-1R1胞外域,且免疫小鼠后可产生IL-1R1特异性抗体,本实验为后续IL-1R1单克隆抗体的制备及细胞受体功能的研究奠定了基础。

关键词：白介素-1受体1 胞外域原核表达纯化多克隆抗体

SEMA6C胞外域在293T细胞中的大量表达及其结构特性的研究

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南开大学学报（自然科学版） 2011年第4期44卷 1-7页

作者：王一凡梁艳俊赵青徐筠李树杰南开大学物理科学学院生物物理系天津300071 南开大学医院天津300071

Sema6C是semaphorin蛋白超家族的成员之一,具有调节神经系统发生和发展的生理功能.Sema6C由胞外域、跨膜片段和胞内结构域组成.利用293T细胞表达了Sema6C的胞外域并研究了其结构特性.实验结果表明Sema6C可在293T细胞中大量表达,纯化出... 详细信息

Sema6C是semaphorin蛋白超家族的成员之一,具有调节神经系统发生和发展的生理功能.Sema6C由胞外域、跨膜片段和胞内结构域组成.利用293T细胞表达了Sema6C的胞外域并研究了其结构特性.实验结果表明Sema6C可在293T细胞中大量表达,纯化出的该蛋白N-糖基化修饰,并具有导致背根神经节(DRG)生长冠萎缩的活性,其EC_(50)约为600 pmol/L.用分子筛层析色谱和不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳研究该蛋白的结构特性,发现该蛋白在糖基化和去糖基化的状态下均具有稳定的结构和单一的分布形态,其相对分子量分别为190.2和168.8 kDa.此外,分析沉降平衡试验结果表明了该蛋白质形成二聚体.基于以上结果,对Sema6C胞外域的二聚体结构对其致萎缩活性的影响进行了讨论.

关键词： Sema6C 胞外域 N-糖基化生长冠致萎缩活性二聚体

构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2008年第4期29卷 331-335页

作者：卢宏松徐丽慧施焕敬韩捷何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心广东广州510632 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广东广州510632

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法:依据Flt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Flt3L基因并构建其... 详细信息

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法:依据Flt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Flt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果:克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论:成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。

关键词： FMS样酪氨酸激酶3配体胞外域原核表达组氨酸标签

猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

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河南农业大学学报 2013年第4期47卷 420-424页

作者：杨青原张军杰秦运杰王冬梅夏平安崔保安河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

为了克隆表达猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域(IFN2EC)基因,试验采用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中扩增出猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的cDNA序列,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,并将阳性重组质粒转化BL21(DE3)菌株,IFN2EC重组蛋白... 详细信息

为了克隆表达猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域(IFN2EC)基因,试验采用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中扩增出猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的cDNA序列,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,并将阳性重组质粒转化BL21(DE3)菌株,IFN2EC重组蛋白得到高效表达.将融合蛋白IFNR2EC免疫BALB/C小鼠,获得鼠抗IFN2EC融合蛋白多克隆抗体,将得到的融合蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测.本研究成功构建重组表达质粒pET-IFNR2EC,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶12800,Western-blotting试验结果表明,制备的鼠抗IFNR2EC融合蛋白多克隆抗体可以与融合蛋白进行特异性结合,从而证明融合蛋白具有很好的免疫原性.

关键词：猪I型干扰素受体II 胞外域克隆原核表达

鸡STARD3胞外域的原核表达及其抗血清制备

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畜牧与兽医 2019年第10期51卷 54-56页

作者：吴悠马宇驰赵祎云隋国燕石辛月唐峰锦州医科大学/辽宁省畜产品质量与安全工程重点实验室

为获得鸡类固醇激素合成急性调节蛋白结构域3(STARD3)胞外域融合蛋白的特异性抗血清,采用人工合成方法获得鸡STARD3胞外域基因,利用pGEX6P-1质粒及BL21(DE3)进行原核表达,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用Western blot及间接ELISA方法测... 详细信息

为获得鸡类固醇激素合成急性调节蛋白结构域3(STARD3)胞外域融合蛋白的特异性抗血清,采用人工合成方法获得鸡STARD3胞外域基因,利用pGEX6P-1质粒及BL21(DE3)进行原核表达,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用Western blot及间接ELISA方法测定抗体特异性和效价。结果显示:获得了STARD3胞外域融合蛋白的特异性抗血清,效价大于1∶6 400。本试验为研究鸡STARD3蛋白功能奠定了基础。

关键词：鸡 STARD3 胞外域原核表达抗血清

抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域的原核表达及纯化研究

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抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域的原核表达及纯化研究

作者：李新新东北农业大学

学位级别：硕士

抑制性谷氨酸门控氯离子通道(Inhibitory glutamate-gated chloride ion channels, IGluCls)属于半胱氨酸环配体门控离子通道超家族(Cys-loop LGIC superfamily)中的阴离子通道,主要分布于无脊椎动物的中枢神经和神经肌肉的连接处,在控... 详细信息

抑制性谷氨酸门控氯离子通道(Inhibitory glutamate-gated chloride ion channels, IGluCls)属于半胱氨酸环配体门控离子通道超家族(Cys-loop LGIC superfamily)中的阴离子通道,主要分布于无脊椎动物的中枢神经和神经肌肉的连接处,在控制吞咽、运动、感知等方面起关键作用。抑制性谷氨酸门控氯离子通道它是杀虫剂的作用靶标,仅存在于无脊椎动物中,鉴于该靶标的选择性及高效、安全等特点,建立该通道的体外筛选方法,在天然产物库中筛选具有选择毒性的杀虫剂具有广阔的应用前景。本文以黑腹果蝇抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域(Drosophila melanogaster inhibitory glutamate-gated chloride ion channels,DmIGluCl ECD)为研究对象,进行了DmIGluCl ECD的亚克隆及在大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统的表达研究,并对在大肠杆菌中表达的胞外域蛋白进行了纯化。主要结果如下:(1)DmIGluCl通道由胞外区(Extracellular domain,ECD)、4个跨膜区(transmembrane domain,TM)和胞内区(intracellular domain,ICD)三部分组成。考虑到毕赤酵母表达系统属于真核表达系统,具备翻译后加工等一系列修饰过程,首选其进行表达。首先从本实验室已经构建了的DmIGluClα全长重组质粒中克隆DmIGluClαTM2-TM3环之前的313个氨基酸残基基因片段,与穿梭质粒pPIC9K连接,成功构建了重组载体并成功转化毕赤酵母宿主GS115,利用毕赤酵母表达系统进行表达研究。(2)扩增了DmIGluClαECD基因片段,同时与真核表达载体pPIC9K和原核表达载体pET-28a-c(+)连接,限制性内切酶酶切鉴定及序列测定表明,得到了目标基因的真核及原核表达的阳性重组子,成功构建了重组质粒,并成功转化毕赤酵母GS115和大肠杆菌Rosetta。利用毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统进行表达研究。(3)进行基因工程菌培养,在大肠杆菌宿主Rosetta中,诱导外源蛋白DmIGluCl ECD的表达,SDS-PAGE分析发现外源蛋白以不可溶的包涵体形式存在于破菌沉淀中。对目标蛋白的诱导条件进行了优化实验。优化结果表明,当诱导剂IPTG添加浓度为0.1mM时, 25℃诱导5 h将获得占菌体总蛋白比例最高的的目标蛋白。经凝胶电泳光密度扫描分析可知,目标蛋白表达量占全菌蛋白的31.02%。(4)利用3M尿素对包涵体蛋白进行洗涤纯化后,在变性条件下利用Ni2+柱亲和层析方法对DmIGluCl ECD蛋白进行了纯化,获得了纯度为100%的目标蛋白。

关键词：抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域原核表达系统真和表达系统亲和层析

鸭瘟病毒囊膜糖蛋白gE胞内域和胞外域对病毒毒力及免疫效力的影响

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鸭瘟病毒囊膜糖蛋白gE胞内域和胞外域对病毒毒力及免疫效力的影响

作者：黄雅琳四川农业大学

学位级别：硕士

鸭瘟是一种急性、败血性传染病,其病原为鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)。目前关于DPV囊膜糖蛋白gE(gE)胞内域、胞外域对病毒毒力及免疫效力的影响还未见报道,本文通过构建鸭瘟gE胞内域、胞外域缺失病毒对其进行评估,获得以下结果:**... 详细信息

鸭瘟是一种急性、败血性传染病,其病原为鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)。目前关于DPV囊膜糖蛋白gE(gE)胞内域、胞外域对病毒毒力及免疫效力的影响还未见报道,本文通过构建鸭瘟gE胞内域、胞外域缺失病毒对其进行评估,获得以下结果:***胞外域和gE胞内域缺失病毒的构建及遗传稳定性通过细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台和Red同源重组技术获得去除gE胞外域的DPV CHv-BAC-gEΔET病毒和去除gE胞内域的DPV CHv-BAC-gEΔCT病毒。在此基础上回复UL23基因,再通过拯救、挑斑纯化分别得到了去除BAC序列、仅缺失gE胞外域和胞内域的DPV CHv-gEΔET和DPV CHv-gEΔCT病毒。将MOI=0.01的DPV CHv-gEΔET、DPV CHv-gEΔCT和亲本病毒CHv-50株分别接种鸭胚成纤维细胞(DEF)。病毒滴度测定结果表明,DPVCHv-gEΔET、DPV CHv-gEΔCT缺失病毒与亲本病毒具有相似的增殖规律。与亲本病毒相比,gE胞外域、胞内域缺失病毒在感染DEF后72 h,滴度分别下降了约80倍和25倍,表明gE胞外域、胞内域缺失均会影响病毒在DEF细胞上的增殖。DPV CHv-gEΔET、DPV CHv-gEΔCT在DEF细胞上连续传20代,在雏鸭体内连续传10代,通过PCR鉴定、病毒毒价测定和对易感动物的致病性确定缺失病毒的遗传稳定性。结果表明,缺失病毒稳定、未发生回复突变,对易感动物的致病性未发生明显变化,即gE胞外域、胞内域缺失株具有良好的遗传稳定性。***-gEΔET和DPVCHv-gEΔCT对雏鸭致病性和免疫效力将DPV CHv-gEΔET、DPVCHv-gEΔCT、DPV CHv-ΔgE和亲本病毒CHv-50分别以10、10、10TCID/只,肌注14日龄鸭(设空白对照),观察10 d。结果亲本病毒CHv-50 10和10TCID组鸭出现体温升高,死亡率分别为50%和60%;DPVCHv-gEΔCT 10、10TCID组鸭均出现20%死亡;DPVCHv-gEΔET、DPV CHv-ΔgE组均未出现体温升高或死亡。DPV CHv-ΔgE和DPVCHv-gEΔET组10 d鸭血清中均可检测到DPV特异性抗体。结果表明,与亲本病毒相比,gE胞内域缺失可使DPV对雏鸭的毒力有所降低,gE胞外域缺失可使DPV对雏鸭的毒力显著降低,可诱导鸭产生特异性血清抗体。DPVCHv-gEΔET和DPV CHv-ΔgE参考1羽份鸭瘟活疫苗(10copies/只)免疫14日龄鸭,免疫后7 d可检测到中和抗体,在7～28 d抗体水平不断升高。接种14 d后用100LDCHv强毒攻击,DPVCHv-gEΔET和DPVCHv-ΔgE组雏鸭全部存活,而对照组全部死亡。表明DPVCHv-gEΔET和DPVCHv-ΔgE可有效诱导鸭机体产生保护性免疫应答,对100LD剂量的CHv强毒攻击能达到100%的保护。综上,DPVgE胞外域、胞内域缺失均可降低病毒对雏鸭的致病性,以gE胞外域对毒力的影响更大;DPVgE缺失、gE胞外域缺失病毒均能够刺激鸭产生中和抗体抵抗强毒攻击。

关键词：鸭瘟病毒 gE 胞外域胞内域缺失毒力免疫保护