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鳗弧菌胞外产物中致病因子的分离纯化及性质研究

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高技术通讯 2002年第8期12卷 96-100页

作者：陈师勇莫照兰张振冬徐永立张培军中国科学院海洋研究所海洋生物学开放室青岛266071

鳗弧菌致病株M3的胞外产物经超滤、SephadexG10 0凝胶层析、DEAE cellulose离子交换层析和HPLC凝胶色谱层析纯化后 ,得到一个纯化的毒性蛋白酶 ,其对金鱼的半数致死量为 1 2微克蛋白 /克体重。该蛋白酶的分子量为 36 5kDa ,等电点为 5 ... 详细信息

鳗弧菌致病株M3的胞外产物经超滤、SephadexG10 0凝胶层析、DEAE cellulose离子交换层析和HPLC凝胶色谱层析纯化后 ,得到一个纯化的毒性蛋白酶 ,其对金鱼的半数致死量为 1 2微克蛋白 /克体重。该蛋白酶的分子量为 36 5kDa ,等电点为 5 1;与底物A zocasin作用的最适pH为 8 0 ,最适作用温度 5 5℃ ,85℃作用 30min后酶被灭活。该酶活性可被EDTA、EGTA及 1,10 菲咯啉抑制 ,表明它是金属蛋白酶。N端部分氨基酸序列经测定为AGATGTGPGGAGLTG。

关键词：胞外产物鳗弧菌致病因子蛋白酶分离纯化鱼类毒性流行性疾病

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哈维氏弧菌胞外产物及鞭毛蛋白的研究

哈维氏弧菌胞外产物及鞭毛蛋白的研究

作者：陈雅芳厦门大学

学位级别：硕士

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi ）是一种能产生单极端鞭毛的革兰氏阴性杆菌,它是海水养殖中常见的致病菌,由其引起的弧菌病是水产养殖经济动物中最为严重的疾病之一,其爆发性流行可导致多种海水养殖鱼虾贝类大量死亡,造成巨大的经济损失... 详细信息

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi ）是一种能产生单极端鞭毛的革兰氏阴性杆菌,它是海水养殖中常见的致病菌,由其引起的弧菌病是水产养殖经济动物中最为严重的疾病之一,其爆发性流行可导致多种海水养殖鱼虾贝类大量死亡,造成巨大的经济损失。本论文致力于哈维氏弧菌胞外产物及其鞭毛蛋白免疫原性的研究,主要结果如下: 1.以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼（Epinephlus awoara）和斜带石斑鱼（E. coioides）分离的哈维氏弧菌TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物（Extracellular product,ECP）,并对其成分进行分析。杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白谱带主要集中在分子质量范围25.0~66.2kDa之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白带几乎一致。采用复性电泳方法（G-PAGE）分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下（pH4）,蛋白酶活性较强,在碱性条件下（pH9）,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。 2.采用梯度离心和CsCl等密度超速离心法提取并纯化哈维氏弧菌TS-628菌株的鞭毛蛋白（flagellin）。电镜观察到鞭毛蛋白呈经典的中空丝状结构,这与其他学者报道的细菌的鞭毛蛋白形态相似,电镜下几乎不见杂质,表明所提纯的鞭毛蛋白纯度还是比较高。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,纯化的鞭毛蛋白亚基分子量分别为43、43.5和44kDa。以纯化的鞭毛蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,dot-ELISA检测兔抗鞭毛蛋白抗血清效价为1:25000,表明所提的鞭毛蛋白具有较强的抗原性,免疫新西兰大白兔约2个月,即可产生高效价的抗血清。Western-blotting印迹检测发现只有相对分子量为43、43.5和44kDa的3条鞭毛蛋白带出现强阳性反应,没有检

关键词：哈维氏弧菌鞭毛蛋白免疫原性胞外产物

美人鱼发光杆菌胞外产物的主要生物学特性分析及免疫保护评价

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美人鱼发光杆菌胞外产物的主要生物学特性分析及免疫保护评价

作者：王洪彬河北科技师范学院

学位级别：硕士

美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)是造成多种水产动物发病的主要病原菌,现已被公认为是水产养殖中的一种新病原。本课题组前期从病死大菱鲆(Turbot)分离到1株美人鱼发光杆菌,对该菌和胞外产物(Extracellular products,ECP)进行... 详细信息

美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)是造成多种水产动物发病的主要病原菌,现已被公认为是水产养殖中的一种新病原。本课题组前期从病死大菱鲆(Turbot)分离到1株美人鱼发光杆菌,对该菌和胞外产物(Extracellular products,ECP)进行主要生物学特性及免疫保护评价分析,旨在揭示美人鱼发光杆菌的致病机理及为该病的防控提供参考。从病死大菱鲆心血中分离到1株优势菌株,经传统鉴定方法、生化鉴定和分子生物学方法确定为美人鱼发光杆菌;该菌对大菱鲆的LD为6.3×10cfu/mL,对卡那霉素和氟苯尼考等敏感。采用饱和硫酸铵超滤浓缩法制备美人鱼发光杆菌的ECP,琼脂平板扩散法对ECP的酶活性进行研究,同时检测其溶血谱及研究环境理化因子对胞外酶活性的影响,应用SDS-PAGE电泳初步分析蛋白成分,运用LC-MS/MS鉴定蛋白成分。结果显示,美人鱼发光杆菌的ECP有溶血酶、蛋白酶、脂肪酶和卵磷脂酶活性;对兔、绵羊、山羊、大菱鲆红细胞的溶血效价分别为2、2、2、2;培养时间、温度、盐度及pH均能影响ECP酶活性。当培养时间为48 h、温度为37℃、盐度为4%、pH值为7时,ECP酶活性最强;共检出145种蛋白成分,多定位于细胞质和细胞外膜,具有广泛的生物学功能。将美人鱼发光杆菌和ECP对大菱鲆和半滑舌鳎进行致病性试验研究,显示ECP对两者具有明显的致病性,ECP引起的病变特征与菌株感染引起的病变一致;当ECP浓度为0.56 mg/mL时,对大菱鲆和半滑舌鳎致死率最高,分别为70%、80%;ECP对半滑舌鳎免疫保护效果较强;半滑舌鳎鳃丝肿胀,伴有出血现象。鳃小片结构紊乱;肝细胞间隙变宽,坏死;脾脏出血,红细胞充盈;肠道黏液增加,肠绒毛坏死脱落。结论:美人鱼发光杆菌的ECP共检出26种假定蛋白、26种功能未知蛋白等145种蛋白成分,具有溶血酶、蛋白酶、脂肪酶和卵磷脂酶活性,酶活性受培养时间、温度、pH和盐浓度的影响;美人鱼发光杆菌和ECP对半滑舌鳎和大菱鲆致病性较强,对半滑舌鳎免疫保护效果较好。

关键词：美人鱼发光杆菌胞外产物生物学特性分析免疫保护评价

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质

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应用与环境生物学报 2002年第4期8卷 414-418页

作者：魏玉西汪靖超程殿林徐永立青岛大学生物系青岛266071 中国科学院海洋研究所青岛266071

对鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化方法及其性质进行了研究 .其中 ,蛋白酶的纯化步骤包括 :(1)硫酸铵沉淀 ;(2 )SephadexG 10 0凝胶过滤 ;(3)DEAE Sepharose色谱分离 ;(4)DEAE Cellulose (DE 32 )色谱分离 .经上述纯... 详细信息

对鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化方法及其性质进行了研究 .其中 ,蛋白酶的纯化步骤包括 :(1)硫酸铵沉淀 ;(2 )SephadexG 10 0凝胶过滤 ;(3)DEAE Sepharose色谱分离 ;(4)DEAE Cellulose (DE 32 )色谱分离 .经上述纯化步骤得到两种蛋白酶 ,经SDS PAGE分析 ,Mr分别为 37.4× 10 3 和 33.1× 10 3 .以偶氮酪蛋白 (azocasein)作底物测其水解酶活性 ,结果表明二者差别显著 ,前者明显高于后者 .而且 ,Mr37.4× 10 3 的蛋白酶在pH 7～ 10范围内均显示较高活性 ,在 4 0～ 6 0℃范围内稳定性好 .结果表明该蛋白酶是一种金属蛋白酶 .关于该蛋白酶对牙鲆(Paralichtysolivaceus)的毒性作用尚在研究之中 .图 6表 3参

关键词：鳗弧菌胞外产物蛋白酶纯化性质

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南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物活性与致病性研究

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南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物活性与致病性研究

作者：阳涛四川农业大学

学位级别：硕士

“南方鲇溃疡综合症”是近年来南方鲇养殖中出现的一种急性致死性的细菌性传染病。该病具有流行广、发病快、死亡率高等特点,以体表溃疡、肝、脾、肾肿大,腹水和胃肠道充血、出血为主要特征。该病给我国南方鲇养殖业造成了严重的经济损... 详细信息

“南方鲇溃疡综合症”是近年来南方鲇养殖中出现的一种急性致死性的细菌性传染病。该病具有流行广、发病快、死亡率高等特点,以体表溃疡、肝、脾、肾肿大,腹水和胃肠道充血、出血为主要特征。该病给我国南方鲇养殖业造成了严重的经济损失。本试验对南方鲇源豚鼠气单胞菌的胞外产物(extracellular products,ECP)的活性和致病性进行研究,并分离纯化得到一种分子量为32.2KD的溶血素,确定其为豚鼠气单胞菌的致病因子,以上研究为阐明该病的致病机理提供理论依据。具体试验方法及结果如下: (1)采用琼脂扩散法测定了南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性和溶血活性,同时采用微量板法对胞外产物的细胞毒性进行了研究。结果显示:南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物具有蛋白酶、脂酶、明胶酶和脲酶活性,同时具有很强的溶血活性和细胞毒性。 (2)豚鼠气单胞菌胞外产物腹腔注射小白鼠,结果显示:豚鼠气单胞菌胞外产物对小白鼠具有明显的致病性,其LD为1.70mg/kg体重。实验小鼠主要表现为呼吸困难,食欲减退;肝肿大;肺淤血,肠道扩张、壁变薄,肠腔内充有大量气体和黄色黏液。病理组织学上,心脏肌纤维变性,横纹消失,肌间毛细血管扩张充血、出血,部分肌浆凝固,红染;肝细胞空泡变性、坏死;肾间质增宽,炎性水肿,细胞离散,大量单核细胞、中性白细胞等炎性细胞渗出,肾小血管严重瘀血,肾小球充血;脾出血,淋巴细胞数量明显减少;肺微静脉扩张淤血,肺泡腔内充斥大量红细胞;肠绒毛坏死脱落;胃上皮变性、坏死,脱落,粘膜下层水肿,病变严重的病例可见固有膜、粘膜下层坏死。 (3)豚鼠气单胞菌胞外产物肌肉注射南方鲇,结果显示:豚鼠气单胞菌胞外产物对南方鲇具有明显的致病性,其LD为0.802mg/kg。试验鱼主要表现为体表溃疡、腹水;肝、脾、肾肿大,充血,出血;胃积液,胃表面充血;肠腔内充有大量黄色粘液。病理组织学上表现骨骼肌和心肌坏死断裂,炎症细胞浸润;肝脏严重的空泡变性;肾小管上皮细胞变性、坏死、间质间大量炎症细胞浸润;脾充血出血,淋巴细胞减少;胃肠粘膜上皮细胞变性坏死脱落。细胞病理学上,病鱼主要器官的细胞均有较为严重的损伤,细胞肿胀,超微结构破坏。具体表现为肌纤维坏死,明暗带模糊不清;肝细胞内出现大量空泡,线粒体肿胀,染色质聚集边移;脾淋巴细胞染色质溶解消失,线粒体肿胀;肾脏内大量的白细胞浸润,上皮细胞坏死。血液病理变化表现为注射后24小时和48小时,RBC和Hb含量显著减少,WBC增加,红细胞脆性增加,血清中的AST、ALT、LDH活性显著升高和Cr含量也显著升高。 (4)采用硫酸铵盐析,DEAE-Sephadex A50凝胶层析法从豚鼠气单胞菌胞外产物中提纯了一种分子量为32.2KDa的单一多肽溶血素。该溶血活性强,溶血价为2,对南方鲇有致病性,其LD为0.29 mg/kg体重。注射后的南方鲇表现为腹部膨大、腹水,肝、脾、肾肿大,淤血、出血;胃肠道内充有大量粘液,粘膜充血、出血。组织病理学表现为骨骼肌水肿,变性,肌浆红染,甚至肌纤维坏死,溶解、断裂;肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血;肾小管上皮细胞变性、坏死,病变严重的整个肾小管的结构完全消失,间质造血拟淋巴细胞减少,大量巨噬细胞浸润;脾充充血,出血,淋巴细胞坏死,数量减少;胃肠到粘膜上皮变性、坏死,脱落。

关键词：南方鲇豚鼠气单胞菌胞外产物溶血素组织病理学

斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌胞外产物生物特性分析及致病性研究

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斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌胞外产物生物特性分析及致病性研究

作者：华丽四川农业大学

学位级别：硕士

近年,由维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)引起的斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)急性、流行性传染病给我国斑点叉尾鮰养殖业造成了严重的经济损失。该病的主要表现为严重腹水、肠炎和内脏器官的广泛出血。目前对维氏气单胞菌的致病机... 详细信息

近年,由维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)引起的斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)急性、流行性传染病给我国斑点叉尾鮰养殖业造成了严重的经济损失。该病的主要表现为严重腹水、肠炎和内脏器官的广泛出血。目前对维氏气单胞菌的致病机理尚不清楚。本试验对斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌的胞外产物(extracellular products, ECP)活性成分和致病性进行了初步研究,以期弄清楚维氏气单胞菌ECP的活性及ECP对斑点叉尾鮰的致病作用,为阐明该病原菌的致病机理提供理论资料。本试验采用平板扩散法对斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌(JF490068)ECP的活性进行了分析,试验结果表明该菌ECP具有脂酶活性、蛋白酶活性、卵磷脂酶活性、DNA酶活性和溶血活性,不具有淀粉酶活性、明胶酶活性和脲酶活性。本试验测定了ECP对多种动物红细胞的溶血性的溶血谱,试验结果表明ECP对鸡、鸭红细胞无溶血活性,对人、斑点叉尾鮰、兔等其他多种动物红细胞具有溶血活性。维氏气单胞菌ECP对斑点叉尾鮰的致病性试验表明,ECP对斑点叉尾鮰具有明显的致病性。接种鱼临床表现为游动缓慢,食欲减退,离群独游;鱼体表面黏液增多并出现褪色斑,腹部、下颌、鳍条基部充血、出血,眼球充血,并在接种24h后陆续出现死亡。剖检后发现脑膜轻度充血,肝脏轻度肿大有出血点,脾脏表面粗糙,肠壁变薄、肠道内大量黄色黏液,心脏有出血点,肾脏出血。病理组织学上表现为：心肌纤维横纹消失、断裂,心外膜水肿,外膜下可见弥散的红细胞;肝组织淤血明显,肝细胞广泛性颗粒变性和空泡变性,局部肝细胞坏死溶解;脾正常结构消失,白髓区域出血面积减少,淋巴细胞显著减少结缔组织增生;红髓区淤血明显,白髓和红髓分界不明显：肾间质出血,局部可见增生的结缔组织,肾小管上皮细胞水肿,变性甚至坏死脱落;胃粘膜上皮细胞坏死、脱落,固有层裸露;肠上皮细胞坏死、脱落,固有层弥漫性分布有大量红细胞;脑表现为非化脓性脑炎,脑组织水肿、组织间隙增宽,脑膜水肿游离,毛细血管淤血,小胶质细胞增生、呈典型的噬神经元现象;鳃小片毛细血管扩张充血,并出现一定程度增生,局部呼吸上皮水肿游离,局灶性坏死、脱落。

关键词：维氏气单胞菌胞外产物活性成分致病性斑点叉尾鲴

维氏气单胞菌胞外产物蛋白分析及hisJ基因功能的初步研究

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维氏气单胞菌胞外产物蛋白分析及hisJ基因功能的初步研究

作者：张海朋吉林农业大学

学位级别：硕士

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人-兽-水生动物共患病原菌,具有广泛的致病性,鱼类感染***后常表现出溃疡和败血症,严重可引起死亡,同时人感染***也会产生腹泻和胃肠炎等症状。胞外产物(Extracellular products,ECPs)是细菌在生... 详细信息

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人-兽-水生动物共患病原菌,具有广泛的致病性,鱼类感染***后常表现出溃疡和败血症,严重可引起死亡,同时人感染***也会产生腹泻和胃肠炎等症状。胞外产物(Extracellular products,ECPs)是细菌在生长、繁殖过程中不断向外环境释放的代谢产物,它们可以入侵宿主机体,并在宿主体内繁殖扩散,抵抗宿主免疫因子正常工作,进而达到损坏宿主免疫机制,引起宿主发病,严重甚至引发死亡,这些胞外产物主要包括胞外酶、外毒素和肠毒素等,它们对于病原菌的毒力强弱具有重要的作用。近年来,关于***的报道逐年增多,研究发现,***具有较强的致病力,但对其致病机理的研究较少。目前国内外研究发现,大多数***中的胞外产物均可使水生动物感染死亡,但具体是胞外产物中哪种蛋白起到致病作用目前尚不清楚,因此,深入研究***胞外产物中蛋白质与致病力的关系将为进一步阐明***致病机制提供依据。本研究成功提取了黄颡鱼源*** TH0426的胞外产物,并通过液相质谱与串联质谱相结合的方法(LC-MSMS)测定其胞外产物蛋白成分,结果表明,黄颡鱼源*** TH0426的胞外产物中含有167种蛋白,此外,本试验以同样的方法提取并测定了其余五种不同源***胞外产物的蛋白成分,比较发现,AV161(乌鳢源)胞外产物中含有118种蛋白;CVCC3700(狐狸源)胞外产物中含有395种蛋白;ATCC35624(人源)胞外产物中含有189种蛋白;QXF0711B(青虾源)胞外产物中含有90种蛋白;CC-8155(草鱼源)胞外产物中含有197种蛋白。另外,将五种不同源***的胞外产物与黄颡鱼源TH0426进行比较发现,六种菌共有的蛋白为周质结合蛋白,编码基因为hisJ。在对*** TH0426胞外产物的分泌蛋白进行GO分析发现,其分泌蛋白可参与872个生物学过程,差异显著的有150个(P外,本试验通过qRT-PCR发现,互补株C-hisJ(pBBR)中hisJ基因表达量高于互补株C-hisJ(pACYC),因此本试验在生物学特性分析中,我们选择互补株C-hisJ(pBBR)进行后续试验。生物学特性分析结果显示,hisJ基因缺失后,细菌生长形态、溶血活性和游动能力无明显变化,但缺失株细菌的泳动能力和生物被膜形成能力明显减弱,通过鞭毛染色和透射电镜观察发现,缺失hisJ基因后,鞭毛极易脱落。此外,与野生株相比,缺失株对EPC的黏附能力下降了10倍,对EPC细胞的毒力也明显减弱,经动物回归感染斑马鱼和小鼠的致病试验发现,缺失株中斑马鱼的LD升高了865倍,差异极显著(p胞外产物中蛋白的种类,在以黄颡鱼源*** TH0426的胞外产物中蛋白为对照发现,六种不同源***的胞外产物中共有蛋白仅1种,其编码基因为hisJ,通过对*** TH0426株hisJ基因的缺失株和互补株进行生物学特性分析发现,缺失hisJ基因后,*** TH0426的鞭毛极易脱落,生物被膜形成能力和动物的致病力明显减弱,本试验结果为阐明***的致病机制提供了依据。

关键词： Aeromonas veronii 胞外产物基因敲除 hisJ基因生物学特性

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水产动物病原菌致病性胞外产物的研究进展

中国水产科学 2000年第2期7卷 93-95页

作者：牟海津刘志鸿中国水产科学研究院黄海水产研究所!山东青岛266071 青岛海洋大学水产学院!山东青岛266003

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胞外产物对膜滤法收集蛋白核小球藻的影响

广东化工 2018年第19期45卷 77-79,85页

作者：张凡菲张文文周雪飞黑龙江黑大环保科技有限公司黑龙江哈尔滨150001 同济大学环境科学与工程学院污染控制与资源化研究国家重点实验室长江水环境教育部重点实验室上海200092

本文在膜过滤过程中对溶解性胞外产物(dEOM)和附着型胞外产物(bEOM)导致的膜通量下降及膜污染机制等方面进行了深入研究。dEOM和bEOM均降低膜滤法收集微藻的效率,造成严重的膜污染。污染特点:蛋白质和多糖在滤膜上被截留,造成膜孔径堵... 详细信息

本文在膜过滤过程中对溶解性胞外产物(dEOM)和附着型胞外产物(bEOM)导致的膜通量下降及膜污染机制等方面进行了深入研究。dEOM和bEOM均降低膜滤法收集微藻的效率,造成严重的膜污染。污染特点:蛋白质和多糖在滤膜上被截留,造成膜孔径堵塞和膜通量下降;EOM中的疏水性蛋白质是膜污染的主要物质,bEOM中疏水性蛋白质产生的膜污染更严重。

关键词：胞外产物蛋白核小球藻膜滤法膜污染

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