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枯草芽孢杆菌斯氏亚种胞外产物的抑菌活性分析及特性研究

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微生物学报 2024年

作者：刘妮王印庚庞明海张正王春元廖梅杰李彬荣小军葛建龙于永翔宁波大学海洋学院上海海洋大学水产与生命学院中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室

【目的】研究枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii， Bspi2104)胞外抑菌物质的理化特性及抗菌活性组分。【方法】选取具有广谱抗菌活性的枯草芽孢杆菌斯氏亚种Bspi2104菌株和无抗菌作用的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Ba... 详细信息

【目的】研究枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii， Bspi2104)胞外抑菌物质的理化特性及抗菌活性组分。【方法】选取具有广谱抗菌活性的枯草芽孢杆菌斯氏亚种Bspi2104菌株和无抗菌作用的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii， BspiL6)结合牛津杯法和代谢组学检测技术对菌株胞外产物的抑菌活性和理化特性及其抗菌活性组分进行研究。【结果】胞外产物理化稳定性试验表明，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶和脂肪酶处理对胞外产物的抑菌活性无显著影响；胞外产物经80 ℃和100 ℃处理后丧失抑菌活性；pH 9.0和pH 11.0条件下胞外产物的抑菌活性下降，且pH值越大抑菌活性越弱；经过紫外处理的胞外产物与未经紫外处理的胞外产物抑菌活性无明显差异(P产物具有抑菌活性，且抑菌活性最强时硫酸铵饱和度为70%；菌株胞外产物进行盐酸沉淀甲醇抽提提取、乙酸乙酯萃取提取和氯仿萃取提取后的产物均有抑菌活性，其中菌株Bspi2104的乙酸乙酯萃取提取产物抑菌效果最好。通过LC-MS/MS检测技术对菌株Bspi2104和BspiL6不同提取方式下枯草芽孢杆菌胞外产物组分进行分析，差异代谢物筛选表明，两株菌的不同提取方式产物中具有显著性差异的代谢物(P1)共有973种，共有的差异代谢物共有35种；差异代谢产物主要分属于羧酸及其衍生物、脂肪酸类、有机含氧化合物、有机含氮化合物、甾体及其衍生物、孕烯醇酮脂类、酚类、生物碱及其衍生物、甘油磷酯类、异黄酮类、苯及其取代衍生物等37类物质，包括苦参素、表面活性素B等多种抑菌物质。【结论】枯草芽孢杆菌斯氏亚种Bspi2104胞外产物的理化稳定性较好，在多种蛋白酶和脂肪酶、pH 1.0-11.0、-20-60 ℃和紫外照射3 h处理下仍然具备较高的抑菌活性。枯草芽孢杆菌斯氏亚种Bspi2104胞外产物的硫酸铵沉淀、盐酸沉淀甲醇抽提、乙酸乙酯萃取和氯仿萃取提取物均有抑菌活性，其中70%硫酸铵沉淀提取物和乙酸乙酯萃取提取物抑菌效果最好，菌株具有多种类型的抑菌活性物质。相关研究结果为芽孢杆菌抑菌活性组分的发现和筛选提供了理论参考，相关代谢产物具有一定的研究前景。

关键词：枯草芽孢杆菌胞外产物理化稳定性抑菌活性成分

异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

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中国水产科学 2022年第2期29卷 325-340页

作者：祝璟琳邹芝英李大宇肖炜喻杰陈炳霖马文静杨弘沈锦玉中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室南京农业大学无锡渔业学院农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室浙江省淡水水产研究所

为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果,本研究采用10%甲醛溶液灭活法制备了无乳链球菌HN0901和GX1101胞外产物灭活疫苗,通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O. aureus♂),在免疫后2... 详细信息

为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果,本研究采用10%甲醛溶液灭活法制备了无乳链球菌HN0901和GX1101胞外产物灭活疫苗,通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O. aureus♂),在免疫后28 d用同/异源无乳链球菌攻毒,测定了免疫后和攻毒后罗非鱼的免疫应答反应和血清抗体效价,并比较了罗非鱼在腹腔注射1×10~8 CFU/尾无乳链球菌后的相对免疫保护率和交叉免疫保护率。结果显示,免疫鱼谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在免疫后28 d显著高于对照组,但在攻毒后显著低于对照组;与对照鱼相比,免疫鱼的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平在免疫和攻毒后均有不同程度的提高,丙二醛(MDA)显著降低(P胞因子基因TNF-α、IL-1β和TGF-β,体液免疫相关基因HSP70,MHC Ⅱ和Ig M在免疫和攻毒后也呈现显著升高趋势,并显著高于对照组(P<0.05)。血清抗体效价于免疫后第28天达到1∶6400,显著高于对照组(P<0.05)。攻毒实验结果显示,免疫组在同源和异源无乳链球菌攻毒后相对的免疫保护率在31.6%～47.4%。结果表明,研制的灭活疫苗免疫罗非鱼后,能够显著诱导罗非鱼体内的免疫应答,产生中等疫苗效力,对同/异源无乳链球菌都具有免疫保护能力。本研究结果为深入研究罗非鱼链球菌病的免疫预防技术和研制二价疫苗奠定了基础。

关键词：无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫保护奥尼罗非鱼

高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种胞外产物的毒力特性分析

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微生物学报 2022年第8期62卷 2995-3006页

作者：李永杰于永翔王印庚王春元刘定远张浩张正上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室山东青岛266071 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266237

【目的】美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae ***,PDD)是一种可导致多种海洋生物患病的重要病原菌。本研究以从我国海水养殖环境中分离的具有强磷脂酶活性、强溶血性表型且具有高致病性的2株PDD菌株为研究对象,分析PDD... 详细信息

【目的】美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae ***,PDD)是一种可导致多种海洋生物患病的重要病原菌。本研究以从我国海水养殖环境中分离的具有强磷脂酶活性、强溶血性表型且具有高致病性的2株PDD菌株为研究对象,分析PDD菌株胞外产物(extracellularproducts,ECP)的致病性及细胞毒性,及其与菌株致病性表型的相关性。【方法】利用培养基平板法测定菌株PDD1605、PDD1608的ECP体外磷脂酶活性和溶血性;通过人工感染实验测定PDD1605和PDD1608活菌株及其ECP对许氏平鲉的致病性,并进行组织病理切片观察组织的病理损伤;通过向人胚肾细胞系HEK293T和小鼠成纤维细胞系MCFS等2种培养细胞中添加菌株PDD1605和PDD1608的ECP测定其对哺乳动物的细胞毒性。【结果】人工感染PDD1605和PDD1608活菌株对许氏平鲉均表现为高致病性,5×108CFU/mL的菌液浓度24h内受试鱼全部死亡;菌株PDD1605和PDD1608的ECP对许氏平鲉同样表现为高致病性,受试鱼的死亡曲线与感染活菌株的死亡曲线趋势基本一致;病理切片观察发现,感染ECP后许氏平鲉组织发生明显病变,主要表现为肠黏膜层组织崩解,心脏心肌炎性细胞浸润,肝脏血细胞和炎性细胞浸润,脾脏出现血铁蛋白沉积等;2株PDD菌株的ECP也具有体外强溶血活性和强磷脂酶活性,与菌株的毒力特性基本一致;2株PDD菌株的ECP对人胚肾细胞系HEK293T和小鼠成纤维细胞系MCFS具有细胞损伤作用,均使体外培养的细胞体积萎缩,形成了圆形细胞簇等退行性变化。【结论】通过体外测定溶血性、磷脂酶活性,许氏平鲉人工感染实验和病理切片观察,以及细胞毒性研究,证实2株高致病性PDD菌株的致病性表型与其ECP致病性表型和细胞毒性高度一致,从而说明ECP是高致病性PDD菌株的重要致病机制之一。

关键词：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种胞外产物毒力特性细胞毒性许氏平鲉

温度、pH和亚硝酸盐水平对拟态弧菌的感染相关表型及胞外产物特性的影响

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温度、pH和亚硝酸盐水平对拟态弧菌的感染相关表型及胞外产物特性...

作者：康振亚四川农业大学

学位级别：硕士

拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种重要的水生生物病原菌,广泛存在于海水、淡水和淡咸水等各种水环境中,可感染鳌虾、蟹、龟和多种鱼类而致病,尤其是对以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、南方鲇(Silurus meridionalis)等为代表的淡水鲇... 详细信息

拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种重要的水生生物病原菌,广泛存在于海水、淡水和淡咸水等各种水环境中,可感染鳌虾、蟹、龟和多种鱼类而致病,尤其是对以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、南方鲇(Silurus meridionalis)等为代表的淡水鲇形目鱼类危害最为严重。研究表明,环境因子温度、pH、亚硝酸盐水平在疾病的发生与发展中具有重要的影响作用。为探究环境因子对拟态弧菌的感染与致病相关特性的影响,本研究通过设定温度(13℃、18℃、23℃、28℃、33℃)、pH(6.0、7.0、8.0、8.5、9.0)、亚硝酸盐水平(0.00、0.10、1.25、3.75、5.00 mg/L)的单因子变化,研究在这些条件下拟态弧菌的增殖、运动、自聚集、生物膜形成、胞外产物(Extracellular products,ECPs)特性及其转录组的变化,其研究结果将为进一步阐释拟态弧菌的感染与致病机制提供资料,同时也为养殖生产中通过调控水环境防控拟态弧菌感染提供参考。在13～33℃时,随温度升高拟态弧菌的增殖、泳动性增强,自聚集、生物膜与胞外产物的蛋白量、溶血活性与酶活性呈波动性。温度在18℃时,ECPs的蛋白量、酶活性、溶血性最强,此时拟态弧菌的能量合成代谢、蛋白质合成与蛋白质跨膜运输等过程较活跃,溶血素等毒力基因高表达;23℃时,自聚集与生物膜形成最强。在pH 6.0～9.0时,随pH升高拟态弧菌的增殖与ECPs溶血活性先增强后减弱,自聚集、生物膜形成、ECPs的蛋白量与酶活性及其对斑马鱼的毒力等呈波动性。pH 6.0时,自聚集、生物膜形成、ECPs的蛋白量、酶活性最强;pH 8.5时增殖最强,但自聚集、生物膜形成以及ECPs的蛋白量、酪蛋白酶酶活性、溶血性及其对斑马鱼的毒力弱,此时拟态弧菌糖代谢、氧化磷酸化膜转运基因表达上调,嘌呤与嘧啶合成与叶酸代谢、核苷酸代谢等基因表达下调。在亚硝酸盐水平0.0～5.0 mg/L时,亚硝酸盐水平对拟态弧菌的增殖无显著影响,但随亚硝酸盐水平升高其泳动性先下降后上升趋势,自聚集与生物膜形成、ECPs的酶活性与溶血性呈波动性,ECPs的蛋白量呈上升趋势。0.1 mg/L时拟态弧菌泳动性、自聚集、生物膜形成最强;2.5 mg/L时泳动、自聚集、生物膜形成、ECPs的卵磷脂酶、明胶酶活性最弱,ECPs对斑马鱼的毒力最强,此时拟态弧菌的氨基酸代谢、氮代谢、尿素循环等过程活跃,这可能引起拟态弧菌表型变化。温度、pH和亚硝酸盐水平变化对拟态弧菌的增殖、自聚集、泳动、生物膜形成等感染相关表型及其胞外产物特性均有影响,它们通过调控多种代谢途径及其相关基因表达影响拟态弧菌表型变化。

关键词：拟态弧菌环境因子感染特性胞外产物转录组分析

地衣芽孢杆菌De株的胞外产物对凡纳滨对虾脂肪酶活性影响的体外实验

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高技术通讯 2006年第2期16卷 191-195页

作者：李卓佳曹煜成陈永青江世贵冯娟中国水产科学研究院南海水产研究所广州510300 湛江海洋大学水产学院湛江524000

为探析芽孢杆菌提高水产动物的消化酶活性的作用机制，在体外条件下实验研究了地衣芽孢杆菌（Bacillw licheniformis）De株的胞外产物（Extracellular products，ECP）对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）脂肪酶活性的影响。以半透膜... 详细信息

为探析芽孢杆菌提高水产动物的消化酶活性的作用机制，在体外条件下实验研究了地衣芽孢杆菌（Bacillw licheniformis）De株的胞外产物（Extracellular products，ECP）对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）脂肪酶活性的影响。以半透膜法收集地衣芽孢杆菌De株的胞外产物，以匀浆离心法提取凡纳滨对虾成虾的肝胰腺和肠道消化酶，将胞外产物和对虾消化酶按体积比10：90混合，于体外条件下研究不同温度、pH及胞外产物添加量对样品脂肪酶活性的影响。结果显示，地衣芽孢杆菌胞外产物添加组的脂肪酶活性明显高于对照组（P〈0．05），在其最适的pn8。10下对虾肝胰腺和肠道的脂肪酶活性分别提高了118％和136．5％；而在其最适温度30℃～50℃时样品的脂肪酶活性则比两对照组分别提高了394．2％和195．1％。研究还发现，胞外产物添加组的脂肪酶活性与样品中胞外产物的添加量呈正相关。可见，在体外条件下地衣芽孢杆菌De株的胞外产物对凡纳滨对虾的脂肪酶活性具有促进作用。

关键词：地衣芽孢杆菌胞外产物凡纳滨对虾脂肪酶体外

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一株动物源乳酸菌的胞外产物免疫原性研究

今日畜牧兽医 2023年第2期39卷 1-3页

作者：刘少杰杨红亚张异岗段美玲于莉莉张金朝康梓哲康社强陆安石家庄九五堂生物科技有限公司 052160 河北诺达生物科技(赞皇)有限公司 051230 石家庄燕科生物科技有限公司 050200 青岛市市级公园管理服务中心 266033

以乳酸菌的胞外产物(ECP)为此次试验研究对象,经过对L-2 ECP的提取,制备ECP疫苗,给小鼠免疫后,通过脾淋巴细胞增殖试验、间接ELISA测血清IgG水平以及致病菌攻菌保护试验,来对L-2 ECP的免疫原性进行探究。结果表明:ECP疫苗不仅可以刺激... 详细信息

以乳酸菌的胞外产物(ECP)为此次试验研究对象,经过对L-2 ECP的提取,制备ECP疫苗,给小鼠免疫后,通过脾淋巴细胞增殖试验、间接ELISA测血清IgG水平以及致病菌攻菌保护试验,来对L-2 ECP的免疫原性进行探究。结果表明:ECP疫苗不仅可以刺激小鼠机体产生细胞免疫,还可以诱导产生较高水平的体液免疫,降低致病性大肠杆菌对小鼠的致死率。结论:L-2 ECP具有较好的免疫原性,可刺激小鼠机体同时产生细胞免疫和体液免疫,对小鼠有一定的相对保护效果。

关键词：乳酸菌胞外产物免疫原性

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哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性

中国水产科学 2010年第1期17卷 88-96页

作者：王斌于兰萍袁甜姜志强大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀... 详细信息

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀红细胞的溶血活性;将哈氏弧菌在不同温度下(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养36h和25℃下培养不同时间(12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h)后提取其胞外产物并对其蛋白质含量进行测定;经SDS-PAGE分离粗提胞外产物中蛋白成分,并用Dot-ELISA和Western-blot方法对其成分进行分析。实验结果显示,该胞外产物对红鳍东方鲀具有致病性;具有淀粉酶和酪蛋白酶活性,不具有卵磷脂酶、脂肪酶和明胶酶活性;对红鳍东方鲀红细胞有溶血活性,对绵羊红细胞无溶血活性;胞外产物蛋白质总含量在35℃培养36h后出现高值,与温度变化无明显相关性;25℃下培养24h、36h和48h的粗提胞外产物经SDS-PAGE分离,有3条蛋白质条带最明显,分子量分别约为31kD、38kD、60kD;其中分子量约为60kD蛋白条带,经Dot-ELISA和Western-blot方法证实其为半胱氨酸蛋白酶-1。根据以上结果认为哈氏弧菌H-06091菌株胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。

关键词：红鳍东方鲀哈氏弧菌胞外产物

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株胞外产物及分泌性蛋白的分离与特性分析

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渔业科学进展 2017年第4期38卷 25-33页

作者：沈桂明李晨史成银贾丹范超谢国驷付泉洁农业部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 大连海洋大学水产与生命学院大连116023

本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus(♀)?Epinephelus lanceolatus(♂)]幼鱼"皮肤溃疡病"的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋... 详细信息

本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus(♀)?Epinephelus lanceolatus(♂)]幼鱼"皮肤溃疡病"的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋白。应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术,对纯化的胞外产物和3种主要的分泌性蛋白进行了特性分析与鉴定。结果显示,哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(Extracellular products,ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性,无脲酶活性。ECPs对羊红细胞无溶血性,对斑马鱼(Danio rerio)的半数致死剂量(LD50)为19.55μg/g鱼体重。从ML01株中分离到3种主要的分泌蛋白P42、P36、P31,其分子量分别为42、36、31 k Da。经质谱鉴定和分析,这3种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白Omp U和Omp N,以及一种功能未知的蛋白。利用同源克隆,成功地从ML01株基因组中扩增到了P42、P36、P31的基因。序列测定和比对结果显示,ML01株的这3个基因与哈维氏弧菌ATCC 33843(Gen Bank CP009467)的相应基因相比,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列的相似性分别为97.08%、100%、99.67%,其编码的多肽序列的相似性分别为99.71%、100%和99.93%。本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理、研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值。

关键词：哈维氏弧菌胞外产物分泌性蛋白质谱分析基因克隆

猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响

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畜牧兽医学报 2021年第3期52卷 733-741页

作者：李琦牛俊辉王晓利毛静全映颖刘桂坤雷显前朱鹏瑶廖成水河南科技大学动物科技学院/洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471023 河南科技大学基础医学院洛阳471023

旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影... 详细信息

旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影响以及胞外产物对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。猪霍乱沙门菌胞外产物具有降解λDNA的DNA酶活性,高温和酸性条件抑制DNA酶的活性,活性最适温度和pH分别为42℃和9.0,且胞外产物的核酸酶可被60℃以上的温度灭活。添加Na^(+)、K^(+)、Ca^(2+)和Ni^(2+)对胞外产物切割λDNA的活性没有影响;5.00和10.00 mmol·L^(-1)的Ba^(2+)、Mg^(2+)和Mn^(2+)可提高胞外产物的DNA酶活性;0.01~1.00 mmol·L^(-1)的Zn^(2+)、Cu^(2+)和Fe^(3+)对胞外产物的DNA酶活性具有促进作用,但Co^(2+)则表现出抑制作用。荧光显微镜和定量分析均显示,猪霍乱沙门菌不能刺激巨噬细胞释放胞外诱捕网,而猪霍乱沙门菌胞外产物可显著降解白色念珠菌刺激巨噬细胞形成的胞外诱捕网。本研究证实了猪霍乱沙门菌胞外产物的DNA酶活性,为进一步探究胞外产物在猪霍乱沙门菌感染与宿主免疫互作中的作用提供参考。

关键词：猪霍乱沙门菌胞外产物核酸酶巨噬细胞胞外诱捕网