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高效建立129/ter、C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系的方法学探讨

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生物工程学报 2002年第6期18卷 740-743页

作者：孟国良汤富酬尚克刚薛友纺北京大学生命科学学院遗传教研室北京100871

A new method for establishing ES cell lines from 129/ter、C57BL/6J mice was set up which was characterized by the murine embryonic fibroblast cell(MEF) feeder, the medium of rat heart cell-conditioned medium(RH-CM)for ES cells, and the consecutive digestion by the digestion liquid containing 1% serum. Every group of improved experiments was done with a control of routine method. The results showed that, compared with routine method, the improved way increased the ratio of ES cell lines of 129/ter mice from 11.8% to 33.3%, and of C57BL/6J from 3.7% to 13.3%. The difference is distinct. The passage culture of ES cells showed that, compared with medium added LIF, RH-CM not only inhibited the differentiation of murine ES cells, maintained its dipoild karyotype, but also promote its adherence growth. This kind of culture condition not only maintained the ES cells in an undifferentiated state and their normal dipoild karyotype, but also a series of other characteristics of totipotent embryonic stem cells during extended culture period.

关键词： 129/ter小鼠 C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系方法学大鼠心脏细胞条件培养建系二倍体核型

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单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系的建立

北京大学学报（医学版） 2004年第4期36卷 431-434页

作者：彭红梅陈贵安北京大学第三医院妇产科

目的 :建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法。方法 :用免疫溶解法 (immunosurgery)分离 3.5d的 1 2 9SvJ系小鼠囊胚内细胞团 ,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养 ,胰酶消化传代。用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标... 详细信息

目的 :建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法。方法 :用免疫溶解法 (immunosurgery)分离 3.5d的 1 2 9SvJ系小鼠囊胚内细胞团 ,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养 ,胰酶消化传代。用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标志 ,常规G带法行染色体核型分析 ,在体、离体分别观察细胞的多向分化能力。结果 :得到一个单细胞克隆 1 2 9系小鼠胚胎干细胞系G1 1 ,能长期稳定增殖不分化 ,具有正常 4 0XY核型 ,碱性磷酸酶阳性、SSEA 1阳性 ,在体和离体条件下可分化为多种细胞。结论

关键词：单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系细胞培养

BALB/c小鼠胚胎干细胞系的建立及其嵌合体小鼠的获得

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细胞生物学杂志 2001年第1期23卷 28-32页

作者：黄冰陈系古邓新燕林以理陈颖青黄春浓梁英杰中山医科大学实验动物中心广州510089 中山医科大学医学遗传教研室中山医科大学病理教研室

目的:建立BALB/c小鼠胚胎干细胞系,并用于制作嵌合体小鼠。方法:从BALB/c小鼠囊胚内分离培养内细胞团块。建系后,进行C_(57)BL/6小鼠受体囊胚腔注射,制作嵌合体小鼠。结果:建立了我国第一株BALB/c小鼠胚胎干细胞系。该细胞系具有典型的E... 详细信息

目的:建立BALB/c小鼠胚胎干细胞系,并用于制作嵌合体小鼠。方法:从BALB/c小鼠囊胚内分离培养内细胞团块。建系后,进行C_(57)BL/6小鼠受体囊胚腔注射,制作嵌合体小鼠。结果:建立了我国第一株BALB/c小鼠胚胎干细胞系。该细胞系具有典型的ES细胞形态,碱性磷酸酶强阳性,核型正常以及具有分化为三种胚层组织的能力,并已产生5只嵌合体小鼠。结论:建立的BALB/c小鼠胚胎干细胞系具有胚胎干细胞的各种特点,可用于体内外诱导分化研究。在进一步观察生殖系嵌合情况后,决定是否可应用于基因打靶等转基因动物的制作。

关键词： BALB/c小鼠胚胎干细胞系嵌合体建系

表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞系的建立及其特性研究

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云南大学学报（自然科学版） 1999年第S3期21卷 252-253页

作者：杨桦戴旭明傅继梁第二军医大学医学遗传学教研室上海200433

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4个品系小鼠胚胎干细胞系的建立

细胞生物学杂志 2007年第4期29卷 585-589页

作者：蒋永华孙筱放郑育红张文红银益飞廖宝平广州医学院第三附属医院广州市生殖与遗传重点实验室广州510150

探索高效的不同品系的小鼠胚胎干细胞的建系方法。B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)、129/SV×DBA/2、C57BL/6、BALB/C等4个不同品系小鼠,孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG)+人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)促排,3.5天交配后(days post coitus,dpc)冲洗子宫取囊胚,或者2.5dpc冲洗输卵管,卵裂球体外培养获取囊胚。囊胚种植到小鼠成纤维细胞饲养层上干细胞培养液培养,4～5天内细胞团扩增后玻璃毛细管挑出,种植到新的饲养层上过夜再行胰蛋白酶消化,3～4天传代一次。对所建立的小鼠ES细胞系进行形态学、染色体核型、AKP染色、体内外分化能力,干细胞分子标记物荧光免疫染色等鉴定。获得10株小鼠胚胎干细胞,具有典型的胚胎干细胞生长特性,符合ES细胞的鉴定标准。结果表明成功的建立了来自B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)、129/SV×DBA/2、C57BL/6、BALB/C等4个不同品系小鼠的10株ES细胞系。内细胞团挑出过夜增殖后消化的培养方法可能有助于提高ES细胞的建系率。

关键词：小鼠品系胚胎干细胞系内细胞团体外培养

尼罗罗非鱼胚胎干细胞系的建立及白血病抑制因子维持其未分化状态的研究

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尼罗罗非鱼胚胎干细胞系的建立及白血病抑制因子维持其未分化状态...

作者：范振华西南大学

学位级别：硕士

胚胎干(ES)细胞来源于早期胚胎囊胚的内细胞团,具有自我更新与多向分化潜能,在再生医学、发育生物学、功能基因组学等领域具有极大应用前景,成为了当前生命科学研究的重点和热点课题。ES细胞分化的抑制是其体外培养的首要课题。自1981... 详细信息

胚胎干(ES)细胞来源于早期胚胎囊胚的内细胞团,具有自我更新与多向分化潜能,在再生医学、发育生物学、功能基因组学等领域具有极大应用前景,成为了当前生命科学研究的重点和热点课题。ES细胞分化的抑制是其体外培养的首要课题。自1981年小鼠胚胎干细胞首次成功建立以来,研究者相继采用饲养细胞、含不同生长因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的条件培养基等抑制细胞的分化,但迄今仅少数物种如人、猪、牛、猴成功建立了ES细胞系。因此,ES细胞未分化状态维持及其分子机制在不同物种中的保守性如何,尚待进一步研究。鱼类ES细胞的研究主要局限于小型模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)和斑马鱼(Danio renio)。采用无饲养细胞的条件培养基(含鱼类胚胎提取物、自身血清)目前已成功建立了青鳉、斑马鱼ES细胞系,同时从一些海水鱼中也得到了类似ES细胞的培养物。从而表明,饲养细胞对于鱼类ES细胞系的建立并非必需。罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明均指尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))作为世界性养殖鱼类,具有生长快、抗逆性强、繁殖周期短(14天)等特点,是开展ES细胞研究及其应用研究的理想对象。LIF是IL-6(白细胞介素-6)家族重要成员,在造血干细胞、间充质干细胞、原始生殖细胞、神经干细胞的增殖、存活等方面均具有重要作用,特别是在ES细胞未分化状态维持方面的作用,备受关注。大量研究表明,LIF通过激活JAK/STAT3、PI3K/AKT信号通路维持小鼠ES细胞的未分化状态,但其未能维持人ES细胞的未分化状态。LIF在其他物种ES细胞中的作用如何,对于揭示ES细胞多能性调控机制的分子进化具有积极作用。鉴于此,本研究以罗非鱼为对象,开展了以下两方面研究:一是采用条件培养基分离、培养罗非鱼胚胎囊胚中期细胞,成功建立了胚胎干细胞系(命名为TES1),通过体外多能性分子检测、体外分化诱导、胚胎嵌合体的形成等对其体内外多能性及分化潜能进行了鉴定,通过细胞增殖能力的检测对其培养基中的不同成分进行了检测与优化;二是对罗非鱼Lif蛋白(OnLif)在TES1细胞的增殖、存活及未分化状态的维持中的作用进行了深入研究,主要研究结果如下:1.胚胎干细胞系的建立1.1细胞的分离、培养从罗非鱼中期囊胚分离细胞,用含Hepes、青-链霉素、胎牛血清(FBS)、非蛋白因子5N(包括谷氨酰胺、丙酮酸钠、亚硒酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇)、人成纤维细胞生长因子(bFGF)、罗非鱼胚胎提取物(TEE)及其血清(TS)的DMEM条件培养基在28℃培养,获得三个细胞系TES1-3,都表现出ES细胞样的特征。本文以TES1为主要研究对象,在无饲养层培养条件下稳定传代至59代200天,仍具有ES细胞样的克隆形成能力及典型的ES细胞样表型特征(细胞圆形或多角形、核大、核仁明显等)。1.2体外多能性碱性磷酸酶(AP)活性及多能性基因的表达是ES细胞检测的重要指标。在本研究中,AP活性检测发现,第55代TES1细胞均呈现强阳性;RT-PCR分析结果显示,第16代及第50代TES1细胞均明显表达pou5f3,sox2,myc和klf4等多能性基因,此外,通过荧光免疫组化实验,从蛋白水平检测到Pou5f3显著表达于TES1细胞。这些结果证明,TES1细胞具有体外的多能性。1.3体外分化潜能证明ES细胞具有体外分化能力的重要手段是诱导细胞分化形成内、中、外3个胚层,并最终得到拟胚体(EB)。本研究中,通过在培养基中加入诱导剂RA,TES1经过10天悬浮培养,形成类似于EB形态的细胞团。现有研究已证明nf200,actn2,hnf3b和sox10分别是内、中、外3个胚层及神经嵴特异的分化基因,RT-PCR分析证实,EB细胞团均表达这些分化基因。同时在诱导后贴壁的细胞中也观察到多种不同类型的分化细胞如星型细胞、神经元细胞和扁平细胞等。由此表明,TES1具有体外多向分化的潜能。1.4体内分化潜能将标记了PKH26(活细胞红色荧光染料)的TES1细胞移植进入受体罗非鱼中期囊胚,胚胎发育后期发现有35%的胚胎(n=501)是PKH26细胞嵌合体,有13%嵌合体胚胎发育成幼鱼,同时观察发现PKH26阳性细胞随着胚胎的发育分布在罗非鱼身体的不同部位,如躯干、眼和鳍,从而表明,TES1细胞在体内具有多向分化潜能。1.5染色体分析对第40代TES1细胞的染色体经分析发现,在统计的100个细胞中,超过70%都是二倍体核型(2n=44),同时其形态未见异常。从而表明,长期培养的TES1细胞具有遗传稳定性。1.6不同成分对TES1细胞增殖活性的影响为优化培养条件,TES1细胞正常传代培养至第28代时,通过CCK-8分别检测多种因子对其增殖的影响。结

关键词：罗非鱼胚胎干细胞系白血病抑制因子未分化状态

《细胞》：小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系首次建立

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现代生物医学进展 2012年第17期12卷 I0003-I0004页

中国科学院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组和徐国良研究组在一项合作研究中，首次建立了来自孤雄囊胚的单倍体胚胎干细胞系，而这些细胞保持了一定水平的雄性印记，并进一步验证这些细胞能够代替精子在注入卵母细胞... 详细信息

中国科学院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组和徐国良研究组在一项合作研究中，首次建立了来自孤雄囊胚的单倍体胚胎干细胞系，而这些细胞保持了一定水平的雄性印记，并进一步验证这些细胞能够代替精子在注入卵母细胞后产生健康的小鼠。相关研究成果今天在线发表于国际著名学术期刊《细胞》（cen），并被重点推荐。

关键词：胚胎干细胞系《细胞》单倍体小鼠细胞生物学中国科学院生物化学卵母细胞

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4个品系小鼠胚胎干细胞系的建立

4个品系小鼠胚胎干细胞系的建立

建立单个卵裂球细胞来源胚胎干细胞系的基础研究——从动物的基础研究到人类的临床应用

第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会

作者：蒋永华孙筱放郑育红张文红银益飞廖宝平广州医学院第三附属医院妇产科研究室

目的:探索高效的不同品系的小鼠胚胎干细胞的建系方法。方法:B6D2F1(C57BL/6* DBA/2),129/SV*DBA/2,C57BL/6,BALB/C 等4个不同品系小鼠,PMSG+HCG 促排,3.5dpc 冲洗子宫取囊胚,或者2.5dpc 冲洗输卵管,卵裂球体外培养获取囊胚。囊胚种植... 详细信息

目的:探索高效的不同品系的小鼠胚胎干细胞的建系方法。方法:B6D2F1(C57BL/6* DBA/2),129/SV*DBA/2,C57BL/6,BALB/C 等4个不同品系小鼠,PMSG+HCG 促排,3.5dpc 冲洗子宫取囊胚,或者2.5dpc 冲洗输卵管,卵裂球体外培养获取囊胚。囊胚种植到小鼠成纤维细胞饲养层上,4～5天内细胞团扩增后玻璃毛细管挑出,种植到新的饲养层上过夜,胰酶消化,3～4天传代一次。对所建立的小鼠 ES 细胞系进行形态学、染色体核型、AKP 染色、体内外分化能力,胚胎表面抗原的荧光免疫染色的鉴定。结果:10株小鼠胚胎干细胞具有典型的胚胎干细胞生长特性,符合 ES 细胞的鉴定标准。结论:成功的建立了来自 B6D2F1(C57BL/6*DBA/2),129/SV*DBA/2,C57BL/6, BALB/C等4个不同品系小鼠的10株 ES 细胞系。内细胞团挑出过夜增殖后消化的培养方法可能有助于提高 ES 细胞的建系率.

关键词：小鼠品系胚胎干细胞系内细胞团体外培养

来源： cnki会议评论

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建立单个卵裂球细胞来源胚胎干细胞系的基础研究——从动物的基础...