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七叶皂苷钠对胆管结扎诱导的肝纤维化作用研究

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安徽医科大学学报 2021年第8期56卷 1257-1262页

作者：王玮琛周大臣崔笑侯辉张彬安徽医科大学第二附属医院普外科合肥230601

目的探究七叶皂苷钠(SA)对胆管结扎诱导的肝纤维化作用机制。方法54只雄性SD大鼠随机均分为:假手术组(Sham组)仅行开关腹,术后每日注射等量生理盐水、生理盐水组(OJ组)行胆管结扎后术后每日注射等量生理盐水、SA组(SA组)行胆管结扎后术... 详细信息

目的探究七叶皂苷钠(SA)对胆管结扎诱导的肝纤维化作用机制。方法54只雄性SD大鼠随机均分为:假手术组(Sham组)仅行开关腹,术后每日注射等量生理盐水、生理盐水组(OJ组)行胆管结扎后术后每日注射等量生理盐水、SA组(SA组)行胆管结扎后术后每日注射SA 3.6 mg/kg。通过ELISA测定各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)的水平。HE及Masson染色观察大鼠肝脏形态结构和胶原纤维的改变。免疫荧光检测Ⅰ、Ⅲ型胶原。免疫组化及Western blot检测eIF-4E、P-4EBP1蛋白表达。结果OJ组大鼠肝脏结构紊乱,血清中的ALT、AST、TBIL水平上升,Ⅰ、Ⅲ型胶原增多,eIF-4E、P-4EBP1在肝细胞中表达减少。SA干预的大鼠血清中ALT、AST、TBIL较OJ组下降,大鼠肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达减少且上调OJ组大鼠肝细胞中原本下调的P-4EBP1、eIF-4E。结论七叶皂苷钠可以通过促进肝细胞中的4EBP1的磷酸化及eIF-4E的激活保护肝细胞从而减少了肝纤维化。

关键词： eIF-4E P-4EBP1 胆管结扎肝纤维化七叶皂苷钠

人参总皂苷对胆管结扎致肝纤维化小鼠氧化应激的影响

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中国临床药理学杂志 2021年第14期37卷 1836-1839页

作者：黄容张元礼黄琳艳黔西南州人民医院药学部贵州黔西南州562400

目的观察人参总皂苷对胆管结扎致肝纤维化(HF)小鼠氧化应激指标及结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达的影响。方法将昆明种小鼠随机分成假手术组、模型组和实验组,每组20只。模型组和实验组小鼠采用胆管结扎的... 详细信息

目的观察人参总皂苷对胆管结扎致肝纤维化(HF)小鼠氧化应激指标及结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达的影响。方法将昆明种小鼠随机分成假手术组、模型组和实验组,每组20只。模型组和实验组小鼠采用胆管结扎的方法构建HF模型。术后4周,实验组小鼠给予人参总皂苷水煎剂溶液100 mg·kg^(-1),灌胃,假手术组和模型组小鼠则给予等量0.9%氯化钠,灌胃,每日1次,共4周。用试剂盒检测小鼠肝组织中氧化应激指标,用免疫组化染色及蛋白质印迹法检测小鼠肝组织中内皮素-1(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达。结果假手术组、模型组和实验组小鼠肝组织中髓过氧化物酶(MPO)分别为(115.64±2.36),(243.66±12.41),(173.46±7.55)kU·g^(-1),羟脯氨酸(HYP)分别为(225.34±4.35),(425.94±4.15),(264.14±5.33)μg·g^(-1),谷胱甘肽(GSH)分别为(75.54±5.26),(28.14±4.63),(64.13±5.03)mg·g^(-1)。免疫组化染色可见,假手术组、模型组、实验组CTGF分别为(1.45±0.11)%,(28.54±2.21)%,(9.21±2.25)%;TGF-β1分别为(7.65±1.65)%,(57.25±10.23)%,(13.15±2.46)%;蛋白质印迹检测,CTGF蛋白相对表达量分别为0.42±0.06,1.23±0.14,1.02±0.06,TGF-β1蛋白相对表达量分别为0.23±0.03,0.85±0.11,0.52±0.04。假手术组和实验组分别与模型组比较,差异均有统计学意义(均P胆管结扎诱导的HF小鼠纤维化进程,降低HF小鼠的氧化应激反应。

关键词：人参总皂苷肝纤维化胆管结扎氧化应激结缔组织生长因子转化生长因子-β1

肝细胞生长因子基因治疗减轻胆管结扎肝纤维化的实验研究

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中国临床医学 2005年第4期12卷 606-608页

作者：夏景林 DAI Chunsun Liu Youhua 复旦大学肝癌研究所复旦大学附属中山医院上海200032 匹兹堡大学医学院病理系 15261PAUSA

目的:验证肝细胞生长因子(HGF)基因治疗在胆管结扎肝纤维化中的保护作用。方法:用雄性CD-1小鼠,随机分为3组。正常对照组仅解剖肝门分离胆总管,不作胆管结扎;胆管结扎的2组,分别给予HGF质粒(pCMV-HGF,1μg/g)和空质粒(pcDNA3),每2周1次... 详细信息

目的:验证肝细胞生长因子(HGF)基因治疗在胆管结扎肝纤维化中的保护作用。方法:用雄性CD-1小鼠,随机分为3组。正常对照组仅解剖肝门分离胆总管,不作胆管结扎;胆管结扎的2组,分别给予HGF质粒(pCMV-HGF,1μg/g)和空质粒(pcDNA3),每2周1次。3个月后将小鼠处死,评价肝纤维化程度。结果:肝细胞生长因子基因治疗能显著减少胆管周围胶原的沉积,表现在:肝胶原染色(Masson-Trichrome染色)减少;胆管周围Ⅰ型和Ⅲ型胶原的免疫荧光染色减少。和空质粒组相比,HGF治疗组肝组织羟脯氨酸的含量显著降低(两组分别为0.48±0.04μg/mgvs1.37±0.06μg/mg,P胆管结扎肝纤维化中,肝细胞生长因子基因治疗能减轻肝纤维化的程度,肝细胞生长因子可用于肝纤维化的治疗。

关键词：肝细胞生长因子基因治疗肝纤维化胆管结扎

百里醌对胆管结扎大鼠氧化应激和肝损伤的保护作用研究

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医药导报 2013年第1期32卷 9-12页

作者：孔令宇王文娟席錾新乡医学院第一附属医院急诊科河南卫辉453100 新乡医学院第三附属医院神经内科河南卫辉453100 新乡医学院第一附属医院小儿外科河南卫辉453100

目的研究百里醌对总胆管结扎大鼠氧化应激和肝损伤的保护和治疗作用。方法 32只SD大鼠随机分为4组,分别为正常对照组、模型对照组、百里醌低剂量和高剂量组,每组8只。在胆管结扎术前3 d起灌胃给予百里醌,低剂量组为25 ***-1,高剂量组为5... 详细信息

目的研究百里醌对总胆管结扎大鼠氧化应激和肝损伤的保护和治疗作用。方法 32只SD大鼠随机分为4组,分别为正常对照组、模型对照组、百里醌低剂量和高剂量组,每组8只。在胆管结扎术前3 d起灌胃给予百里醌,低剂量组为25 ***-1,高剂量组为50 ***-1,连续2周。处死大鼠,检测肝组织匀浆中羟脯氨酸(HP)含量和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性。苏木精-伊红(HE)染色检测肝组织病理学改变。结果百里醌可显著降低胆总管结扎引起的肝脏组织内HP和MDA的含量,升高SOD和GPx含量(P<0.05)。百里醌治疗组肝脏坏死面积较模型对照组显著降低,炎性浸润程度明显降低。结论百里醌可以提高抗氧化损伤能力,减少肝脏氧化应激破坏,有望在胆汁淤积症患者中用于肝功能的保护。

关键词：百里醌胆管结扎氧化应激

缺氧在胆管结扎大鼠胆汁性肝纤维化形成中的作用机制

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缺氧在胆管结扎大鼠胆汁性肝纤维化形成中的作用机制

作者：邓毅恒第四军医大学

学位级别：硕士

肝纤维化的发病机制极为复杂,是一个由多因素多环节,涉及细胞、细胞因子、细胞外基质共同作用的结果。肝脏是机体最重要的代谢器官,因其血供系统的特殊性,从门静脉和肝动脉到中央静脉形成明显的氧分压梯度,所以肝脏容易遭受缺氧。各种... 详细信息

肝纤维化的发病机制极为复杂,是一个由多因素多环节,涉及细胞、细胞因子、细胞外基质共同作用的结果。肝脏是机体最重要的代谢器官,因其血供系统的特殊性,从门静脉和肝动脉到中央静脉形成明显的氧分压梯度,所以肝脏容易遭受缺氧。各种原因引起的肝损伤都是造成肝脏缺氧的重要因素,缺氧激活肝星状细胞从而启动肝纤维化形成,可能是各种病因致肝纤维化的共同机制,因此探讨缺氧在肝纤维化形成中的作用机制,对于了解肝纤维化形成机制有重要的意义。目的探讨缺氧在大鼠胆汁性肝纤维化形成中的作用机制。方法 1.利用胆管结扎(bile duct ligation,BDL)建立大鼠胆汁性肝纤维化模型,于术后1d、3d、7d、14d、21d、28d杀鼠取材,观察组织学和超微结构改变;逆转录PCR法检测转化生长因子β1(TGF-β1)、I型胶原mRNA的表达;蛋白免疫印迹检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle,α-SMA)的表达。 2.缺氧培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)株HSC-T6,逆转录PCR检测HIF-1α、TGF-β1、I型胶原mRNA的表达,蛋白免疫印迹检测α-SMA表达。缺氧/常氧下,加2μg/mL TGF-β1中和抗体、50μmol/L HIF-1α诱导剂氯化钴(cobalt chloride, CoCl2)或HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2),逆转录PCR检测HSC-T6表达I型胶原mRNA的变化。结果 1.电镜结果显示胆管结扎后早期肝细胞便出现缺氧、能量代谢障碍表现;胆管结扎3d时,HIF-1α表达明显升高,于胆管结扎7d时,α-SMA蛋白、TGF-β1、I型胶原mRNA表达明显升高。 2.缺氧能诱导HSC-T6表达HIF-1α、TGF-β1、I型胶原mRNA及α-SMA蛋白;常氧下CoCl2能诱导HSC-T6表达I型胶原mRNA,TGF-β1中和抗体及2ME2能减弱缺氧诱导HSC-T6表达I型胶原mRNA;结论缺氧激活肝星状细胞,分泌I型胶原,增加细胞外基质沉积,其作用机制既依赖于TGF-β1的胞内信号传导机制,也与HIF-α介导的信号传导有关,在大鼠胆汁淤积性肝纤维化形成中起着重要的作用。

关键词：胆管结扎胆汁性肝纤维化缺氧缺氧诱导因子-1α 肝星状细胞

积雪草酸对小鼠胆管结扎诱导的肝纤维化的治疗作用及机制的研究

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积雪草酸对小鼠胆管结扎诱导的肝纤维化的治疗作用及机制的研究

作者：周炳杰江苏大学

学位级别：硕士

目的:肝纤维化是许多肝脏疾病发展成为肝硬化的重要病理过程,目前还没有疗效良好的治疗药物。本课题研究积雪草酸对胆汁性肝纤维化小鼠的治疗作用,并探讨积雪草酸的作用机制,为其应用于肝纤维化的治疗提供实验依据。方法:本研究通过胆... 详细信息

目的:肝纤维化是许多肝脏疾病发展成为肝硬化的重要病理过程,目前还没有疗效良好的治疗药物。本课题研究积雪草酸对胆汁性肝纤维化小鼠的治疗作用,并探讨积雪草酸的作用机制,为其应用于肝纤维化的治疗提供实验依据。方法:本研究通过胆管结扎(BDL)诱导小鼠肝损伤及肝纤维化建立在体实验模型,并以甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)处理HL-7702细胞建立体外肝损伤模型,通过在体和离体实验探讨积雪草酸的抗肝纤维化作用及机制。在体实验:结扎C57小鼠的总胆管,建立淤胆型肝损伤模型,分为假手术对照组、模型组、积雪草酸15 mg/kg组和30 mg/kg组,每组6只。各组小鼠连续灌胃给药5天。测定血清生化指标水平来检测肝功能。称量小鼠肝脏及脾脏组织,并计算肝脏指数和脾脏指数。检测肝组织内MDA(丙二醛),SOD(超氧化物气化酶)和Catalase(过氧化氢酶)和GSH(还原型谷胱甘肽)分析小鼠肝组织氧化应激。将肝脏组织切片H&E染色、Masson染色进行病理学检查,TUNEL染色检测肝细胞凋亡;α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)免疫组化及Western blot检测肝纤维化程度。采用实时荧光定量PCR测定炎症因子及肝纤维化因子相关基因的mRNA水平,分析积雪草酸对炎症、肝纤维化的改善作用;测定胆汁酸代谢相关的基因表达水平,分析胆汁酸代谢调节途径。Western blot法检测Bax、Bcl-2的表达水平,分析积雪草酸的抗凋亡机制;检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表达水平,研究积雪草酸的抗氧化机制。离体实验:采用GCDC作用于HL-7702细胞建立体外肝损伤模型,分为对照组、模型组和不同浓度的积雪草酸处理组,MTT法检测细胞活性,Annexin V/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡,DCFH-DA荧光探针法检测细胞中活性氧(ROS)的含量,细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测Nrf2的蛋白表达水平。结果:在BDL小鼠模型中,我们发现BDL模型组小鼠肝脏肿大、欠光泽,肝组织出现胶原沉积、炎性细胞浸润的现象,积雪草酸给药后能够改善BDL小鼠的肝组织形态和病理特征,降低肝脏指数和脾脏指数。BDL模型组小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、羟脯氨酸(Hyp)、总胆固醇(T-CHO)、总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)的水平显著上升,积雪草酸给药能够显著降低这些生化指标的水平,高剂量效果更明显。同时,积雪草酸能够减少肝组织α-SMA的表达;降低纤维化因子Ⅲ型胶原蛋白(Col3a1)、波形蛋白(Vim)、肌动蛋白(Acta2)、转化生长因子(TGF-β1)mRNA的表达水平;降低促炎因子包括前列腺素内过氧化物合成酶2(Pgst2)、IL-6、TNF-α、趋化因子配体3(CCL3)的mRNA表达水平。积雪草酸给药作用后,上调Bcl2,下调Bax表达,减少肝组织细胞的凋亡。积雪草酸给药能够抑制BDL小鼠肝组织的氧化应激水平,表现为MDA含量的降低,SOD、GSH和Catalase水平的提高,促进Nrf2和HO-1的蛋白表达。此外,积雪草酸给药能够调控BDL小鼠的胆汁酸代谢途径相关基因,法尼酯X受体(FXR)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7α1)、小分子异源二聚体伴侣(SHP)、成纤维细胞生长因子(FGF15)的mRNA水平,减少肝组织内胆汁酸淤积。离体实验表明积雪草酸能够有效的保护GCDC诱导的HL-7702细胞损伤。实验结果显示,积雪草酸处理可以显著增加细胞存活率(P<0.001);减少细胞内ROS生成,降低细胞凋亡率,抑制作用均呈浓度依赖性增强;促进HL-7702细胞表达Nrf2蛋白。结论:在体实验水平,积雪草酸具有显著改善BDL鼠肝纤维化的作用,抑制氧化应激,抑制炎症反应,调控胆汁酸代谢,改善肝组织形态和功能;在细胞水平上,积雪草酸对抗GCDC诱导的HL-7702细胞损伤,抑制ROS的增加,减少细胞凋亡,促进Nrf2的表达。本论文研究结果揭示积雪草酸有改善胆汁性肝纤维化的作用,其机制可能与抗凋亡以及Nrf2介导的抗氧化和调控胆汁酸代谢有关。

关键词：积雪草酸胆管结扎肝纤维化 Nrf2 抗氧化 HL-7702细胞

1α，25(OH)2D3对胆管结扎诱导肝纤维化小鼠的影响

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1α，25(OH)2D3对胆管结扎诱导肝纤维化小鼠的影响

作者：王文慧苏州大学

学位级别：硕士

目的:肝纤维化是一种慢性肝损伤的修复反应,以细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的合成与降解失衡、且异常沉积为特征。肝纤维化发病率高,预后不良。目前尚无有效的治疗方法。流行病学调查发现慢性肝病患者中普遍存在维生素D缺乏现... 详细信息

目的:肝纤维化是一种慢性肝损伤的修复反应,以细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的合成与降解失衡、且异常沉积为特征。肝纤维化发病率高,预后不良。目前尚无有效的治疗方法。流行病学调查发现慢性肝病患者中普遍存在维生素D缺乏现象。研究证实维生素D的代谢物1,25-二羟基维生素D3(1alpha,25-dihydroxy vitamin D3,1α,25(OH)D)能够延缓不同组织纤维化进程。因此,本实验通过胆管结扎建立肝纤维化小鼠模型,观察1α,25(OH)D对胆管结扎诱导肝纤维化小鼠的影响,为探索活性维生素D抗纤维化作用提供实验数据。方法:本研究分为两个部分:(1)建立胆管结扎诱导肝纤维化小鼠模型。这是一个非常成熟的模型。其制作过程如下:健康的雄性C57BL/6J小鼠在SPF级动物房适应性喂养一周后随机分为两组:假手术组(Sham组)和胆管结扎模型组(Bile duct ligation,BDL组)。禁食12小时后使用4%的水合氯醛麻醉小鼠,在无菌条件下打开小鼠腹腔游离并结扎胆总管(BDL组)。Sham组小鼠游离胆总管但不结扎。观察并记录小鼠一般情况、体重,实验至术后第15天,小鼠禁食6小时,动物麻醉后经心脏取血并脱颈椎处死小鼠,取肝右叶同一部位组织包埋并制作切片,观察肝组织病理学情况。(2)1α,25(OH)D3对胆管结扎诱导肝纤维化小鼠的影响。60只雄性C57BL/6J小鼠并随机分为4组:Sham组,BDL组,BDL+低剂量1α,25(OH)D(1 μg/kg/each time,Low vitamin D3,LVD 组),BDL+高剂量1α,25(OH)D 组(2.5 μg/kg/each time,High vitamin D3,HVD 组)。于术前一周开始皮下注射1α,25(OH)D,一周三次。Sham组和BDL组小鼠均注射等体积生理盐水,一周三次。术后第15天处死小鼠,称体重和肝重并计算肝脏系数;经心脏取血离心后测血清生化指标,收集各组小鼠肝组织,检测肝组织羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量;部分肝组织固定、制作切片进行H&E染色、Masson染色、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)免疫组化染色观察肝组织病理损伤和纤维化;部分制作冰冻切片并进行油红O染色;剩余部分保存-80℃超低温冰箱。提取各组小鼠肝组织RNA,利用实时定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)技术检测炎症因子白介素-6(Interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necosis factor-α,TNF-α)、转化生子因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和纤维化指标Ⅰ 型胶原(Collagen type Ⅰ,Col-Ⅰ)、Ⅲ 型胶原(Collagen type Ⅲ,Col-Ⅲ)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(Tissue inhibitor of rmetalloproteinase-1,TMIP-1)的基因表达水平。结果:(1)成功模拟胆管结扎诱导肝纤维化小鼠模型。Sham组小鼠肝脏表面光滑,呈红色,质软且有弹性;BDL组肝脏有结节颗粒感,呈黄褐色,质地较硬。BDL组小鼠的血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、总胆红素(Total bilirubin,TBIL)均显著高于Sham组小鼠(p胆管结扎诱导小鼠肝损伤的影响。相较于Sham组,BDL组小鼠体重显著下降,肝脏系数明显上升(p<0.01):ALT、AST、ALP、TBIL、总胆汁酸(Total bile acid,TBA)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)显著增加,空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)明显下降(p<0.05)。与 BDL 组相比,两组 1 α,25(OH)2D3均改善了血清 ALT、TBIL

关键词：肝纤维化胆管结扎小鼠 1α,25(OH)2D3

熊去氧胆酸对胆管结扎大鼠的肝脏炎症病变及血糖影响的研究

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熊去氧胆酸对胆管结扎大鼠的肝脏炎症病变及血糖影响的研究

作者：邢华冰山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探究熊去氧胆酸对胆管结扎大鼠的肝脏炎症病变及血糖影响的研究。方法:选择健康雄性6-8周龄大小的SD大鼠32只,随机分为四组:A组(正常组,n=8),不作任何处理,B组(假手术组,n=8)开腹后只游离胆管不结扎,C组(实验组,n=8)开腹后行胆管结... 详细信息

目的:探究熊去氧胆酸对胆管结扎大鼠的肝脏炎症病变及血糖影响的研究。方法:选择健康雄性6-8周龄大小的SD大鼠32只,随机分为四组:A组(正常组,n=8),不作任何处理,B组(假手术组,n=8)开腹后只游离胆管不结扎,C组(实验组,n=8)开腹后行胆管结扎,D组(干预组,n=8)在C组基础上,术后5天给予熊去氧胆酸干预(按进食量的0.25%,方式:灌胃,每日1次)。观察各组SD大鼠术后一般状态,于术后4周时将A、B、C、D组称取体重,处理时称取肝重,并计算肝指数(肝重/体重,%),测定糖耐量试验,测定血清总胆汁酸(TBA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)浓度,肝脏HE染色、masson染色观察有无出现肝纤维化,用免疫组化测定各组肝脏炎症因子NF-KB-p65、IKBα表达的变化。结果:术后3天,B组大鼠在日进食量、巩膜、尿液颜色、一般精神状态与A组相比未见明显变化,C组大鼠较B组均可见眼睛、耳尖及尾部出现明显黄疸,尿液颜色加深变成深黄色,日进食量减少,大便颜色变浅,D组较C组相比未见明显差异。术后4周,B组大鼠在日进食量、巩膜、尿液颜色、一般精神状态与A组相比未见明显变化。C组较B组精神稍差、日进食量减少,可见耳缘仍可见到黄染,尿液颜色大致相同,大便颜色颜色稍浅,较干燥,4周后C组大鼠打开腹腔可看到充盈的胆管;D组较C组相比精神相仿,耳缘黄染程度较轻,日进食量有所增加,尿液颜色及大便情况基本一样。B组的体重增加率(体重增加率=(术后4周体重-术后0周体重)/术后0周体重)A组相比,B组体重增加率未见明显差别(P>0.05),与B组相比,C组体重增加率明显降低(P0.05),C组的肝指数较B组相比明显增高(P0.05)。A、B、C、D组都于4周后处理,心脏采血,分别离心取上清液后测定ALT、AST、TBA、ALB指标。B组ALT、AST、TBA、ALB指标较A组未见明显变化(P>0.05);C组4周后AST、ALT、TBA较B组明显增高(P0.05)。显微镜下观察HE染色示:B组可见肝小叶条索状排列整齐,胆管未见明显扩张,肝细胞未见明显坏死。C组可见胆管扩张,周围可见纤维条索,肝小叶结构紊乱。D组可见胆管轻度扩张,周围未见明显纤维条索。masson染色是可以将胶原纤维染成蓝色。显微镜下masson染色观察:B组肝脏可见肝小叶整齐排列,胞浆染成深红色,周围未见明显蓝色。C组可见胆管周围有明显染成蓝色纤维条索形成。D组可见肝小叶局部及胆管周围轻微着色。选取肝脏组织蜡块,行肝脏NF-KB-p65及IKBα抗体的免疫组化,可对SD大鼠肝脏局部炎症表现进行定性及定量。结果如下所示:显微镜下C组的NF-KB-p65抗体表达与B组相比局部可见细胞核染色更深、阳性面积更大,D组的NF-KB-p65抗体与C组相比局部可见细胞核染色较浅、阳性面积较小;C组的IKBα抗体表达与B组相比未见明显变化,D组的IKBα抗体与C组相比局部可见细胞核染色更深、阳性面积更大。我们采用Image J软件,通过该软件可以计算出呈阳性表达面积(Area)和总光密度值(IOD值),最后我们通过运算IOD/Area可得到平均光密度值(AOD值)。我们可以通过各组AOD值的比较,明确各组NF-k Bp65抗体及IKBα抗体的表达数量,通过计算NF-KB-P65的平均光密度值(AOD1值)和IKBα的平均光密度值(AOD2值)的比值可比较三组之间的炎症反应情况。根据统计的结果分析可知:C组AOD1/AOD2的比值与B组相比明显增加(P0.05),C组0h、1h、2h的血糖较B组的有升高趋势(P>0.05),D组的1h、2h血糖较C组的明显降低(P0.05)。通过各组SD大鼠OGTT图计算OGTT曲线下面积(AUC),根据结果显示,B组AUC较A组未见明显变化(P>0.05),C组AUC较B组明显升高(P胆管结扎,激活NF-KB炎症通路,肝脏出现纤维化改变;血糖升高,出现胰岛素抵抗。熊去氧胆酸干预4周后,发现NF-KB-p65表达下降,肝脏纤维化改善;血糖有所下降,胰岛素抵抗有所改善。

关键词：熊去氧胆酸糖代谢胆管结扎 NF-KB通路

脱水穿心莲内酯对小鼠胆管结扎诱导的肝纤维化的抑制作用及机制探讨

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脱水穿心莲内酯对小鼠胆管结扎诱导的肝纤维化的抑制作用及机制探...

作者：谢婧锦州医科大学

学位级别：硕士

目的该课题是利用小鼠胆管结扎(BDL)模型探讨脱水穿心莲内酯(DA)对小鼠胆汁淤积诱导的肝纤维化的保护作用;同时,通过体外培养人LX-2细胞探讨DA在肝纤维化过程中的作用机制。方法动物实验:40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组:羟甲基纤维素(... 详细信息

目的该课题是利用小鼠胆管结扎(BDL)模型探讨脱水穿心莲内酯(DA)对小鼠胆汁淤积诱导的肝纤维化的保护作用;同时,通过体外培养人LX-2细胞探讨DA在肝纤维化过程中的作用机制。方法动物实验:40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组:羟甲基纤维素(CMC)+假手术(sham)组、DA+sham组、CMC+BDL组和DA+BDL组,每组10只小鼠。BDL组小鼠进行胆总管双重结扎并中间离断,sham组小鼠进行假手术,胆总管只穿线不结扎。DA+sham组和DA+BDL组小鼠给予DA灌胃(100mg/kg)给药,每日一次,同时CMC+sham组和CMC+BDL组小鼠给予灌服相同剂量的CMC。连续灌胃5d后各组小鼠进行相应的手术,术后12h继续灌胃给予每只小鼠相应组别的药物治疗。连续7d后处死小鼠收集血清和肝脏标本,做以下检测:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)试剂盒检测血清中ALT、TBIL和TBA浓度;小鼠肝脏石蜡切片HE染色,镜下观察肝组织病理形态变化,天狼猩红染色观察肝纤维化程度;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中肝纤维化相关基因的相对表达量,包括转化生长因子-β(TGF-β)、I型胶原α1(Col1a1)mRNA表达;Western blot检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的相对表达量。体外细胞实验:体外培养人LX-2细胞,使用TGF-β激活LX-2细胞。分为空白溶剂(DMSO)对照组、DA组(20μM/L)、TGF-β组(2ng/ml)、低剂量DA(5μM/L)+TGF-β(2ng/ml)组、中剂量DA(10μM/L)+TGF-β(2ng/ml)组和高剂量DA(20μM/L)+TGF-β(2ng/ml)组。qRT-PCR检测各组细胞中Col1a1mRNA相对表达量。Western blot检测各组细胞中α-SMA的蛋白相对表达量。结果动物实验:在小鼠实验中,我们发现CMC+BDL组小鼠血清中ALT、TBIL和TBA的水平显著上升(P胆管壁明显增厚,并出现明显的增生,有大量的弥漫性、点状样肝细胞坏死灶;与CMC+BDL组相比,DA+BDL组小鼠病理损伤明显改善,炎性细胞浸润明显减少,坏死灶明显减少。天狼猩红染色结果显示,与CMC+sham组相比,CMC+BDL组小鼠肝组织中汇管区周围出现大量胶原纤维沉积;与CMC+BDL组相比,DA+BDL组小鼠肝组织汇管区周围胶原纤维沉积明显减少,纤维程度减轻(P<0.01)。同时qRT-PCR和Western blot结果显示,与CMC+sham组比较,CMC+BDL组小鼠肝组织中TGF-β、Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白表达水平升高;DA明显降低了小鼠肝组织中BDL诱导的TGF-β、Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白表达水平的升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。体外细胞实验:qRT-PCR和Western blot结果显示DA治疗能够显著抑制TGF-β激活的人LX-2细胞中Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论DA对BDL诱导的小鼠肝损伤具有保护作用;DA可能通过抑制纤维化相关因子的表达,进而减少肝星状细胞(HSC)的活化,达到抗纤维化的作用。

关键词：脱水穿心莲内酯胆管结扎肝纤维化肝星状细胞