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通过定向内胚层的高效分化提高多能干细胞体外生成肝细胞样细胞的效率

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基础医学与临床 2023年第7期43卷 1045-1052页

作者：闫煜聪杨淑春贾玉艳黄粤中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院医学遗传学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的优化多能干细胞(PSCs)体外定向分化为肝细胞样细胞(HLCs)的方法,提高得到HLCs的效率。方法根据体内肝细胞发育的规律,优化多能干细胞逐级诱导分化成HLCs过程中使用的细胞因子,制定出更高效率的肝细胞定向分化体系,并在人胚胎干细胞(... 详细信息

目的优化多能干细胞(PSCs)体外定向分化为肝细胞样细胞(HLCs)的方法,提高得到HLCs的效率。方法根据体内肝细胞发育的规律,优化多能干细胞逐级诱导分化成HLCs过程中使用的细胞因子,制定出更高效率的肝细胞定向分化体系,并在人胚胎干细胞(hESCs)系H9上进行分化实验。通过对分化不同阶段的细胞进行形态学观察、标志基因表达水平的RT-qPCR检测以及流式细胞术测量分析,综合评估得到HLCs的效率。结果在hESCs向定向内胚层(DE)分化阶段的培养基中同时添加细胞因子激活素A、骨形态发生蛋白4(BMP4)和成纤维细胞因子2(FGF2),能显著提高该阶段标志基因的表达量,荧光示踪和流式分选也表明最终得到的HLCs的比例明显增加。结论DE的高效分化能提高PSCs向HLCs的分化效率。

关键词：分化多能干细胞定向内胚层肝细胞样细胞

脐带间充质干细胞体外分化为有功能的低免疫原性肝细胞样细胞

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中国医学科学院学报 2010年第2期32卷 190-194,246页

作者：任红英赵钦军邢文杨少光卢士红任倩张磊韩忠朝中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

目的观察人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)体外诱导分化为肝细胞样细胞(DHC)后,是否具有肝细胞的生物学特性和功能,以及其免疫原性的变化。方法采用改良的二步法肝细胞分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化,并用RT-PCR和免疫荧光... 详细信息

目的观察人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)体外诱导分化为肝细胞样细胞(DHC)后,是否具有肝细胞的生物学特性和功能,以及其免疫原性的变化。方法采用改良的二步法肝细胞分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化,并用RT-PCR和免疫荧光染色法检测诱导后不同时间DHC肝细胞特异性标记的表达;采用ELISA法检测细胞培养液中白蛋白(ALB)和尿素的浓度,以及混合淋巴细胞培养检测DHC对淋巴细胞增殖能力的影响。结果 UC-MSCs低表达甲胎蛋白(AFP)、ALB和细胞角蛋白-19(CK-19)的mRNA和蛋白,成肝诱导分化后14和28dDHC均高表达肝细胞标志AFP、ALB、CK-19以及色氨酸2,3-加双氧酶基因。诱导后的DHC能够以时间依赖方式产生ALB和分泌尿素,不表达人白细胞DR抗原,而且能够抑制淋巴细胞增殖。结论 UC-MSCs在体外能够分化为有功能的DHC且具有低免疫原性的特征。

关键词：间充质干细胞肝细胞样细胞分化免疫原性

诱导人羊膜上皮细胞横向分化为肝细胞样细胞(英文)

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中南大学学报（医学版） 2011年第6期36卷 525-531页

作者：罗宏武黄湘俊黄飞舟刘浔阳中南大学湘雅三医院肝胆外科长沙410013

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞(hAECs)向肝细胞样细胞分化的能力。方法:采用地塞米松(Dex),HGF,IGF等细胞因子联合诱导hAECs向肝细胞样细胞分化,诱导周期为2周,诱导过程中采用RT-PCR鉴定albumin(ALB),CYP1A1,CYP1A2,IGF... 详细信息

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞(hAECs)向肝细胞样细胞分化的能力。方法:采用地塞米松(Dex),HGF,IGF等细胞因子联合诱导hAECs向肝细胞样细胞分化,诱导周期为2周,诱导过程中采用RT-PCR鉴定albumin(ALB),CYP1A1,CYP1A2,IGFR,c-met等肝细胞相关关键功能基因及HNF3,HNF4和C/EBPa 3种转录因子的表达,流式细胞术分析集落细胞表面标记ALB,AFP和CK18的时程变化。结果:诱导2周后hAECs表达ALB,CYP1A1,CYP1A2,c-met等肝细胞功能基因及HNF3,HNF4,C/EBPa,HNF1等转录因子,且功能基因随诱导天数的增加其表达逐渐增强;细胞表面标记检测发现:诱导第6天时,hAECs主要表达AFP+,为(15.1±2.1)%;随着诱导时间的延长,第10天时hAECs表达AFP+/ALB+,为(6.5±1.4)%;而诱导第14天时,hAECs基本上只表达ALB+,为(13.9±2.3)%。诱导第10天时的hAECs开始表达ALB+/CK18+;为(2.5±1.4)%;诱导第14天时,细胞依然表达ALB+/CK18+,且这种双阳性的细胞量有明显增加,为(18.9±3.1)%;同时CK18+细胞数并没有明显减少,诱导第10天时,CK18+细胞数为(16.1±1.2)%;诱导第14天时,CK18+细胞数为(21.3±4.6)%。提示诱导过程中的hAECs随着诱导时间的延长有一个逐渐成熟的过程。结论:体外诱导的hAECs具有分化为肝细胞样细胞的特性。

关键词：人羊膜上皮细胞肝细胞样细胞诱导分化

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第36期15卷 6669-6672页

作者：张涛赵振国高辉解放军成都军区总医院肿瘤诊治中心四川省成都市610083

背景:目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。目的:观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法:采用密度... 详细信息

背景:目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。目的:观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法:采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。结果与结论:诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。

关键词：肝细胞样细胞骨髓间充质干细胞胎肝细胞肝干细胞肝细胞生长因子

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向肝细胞样细胞的分化

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中国病理生理杂志 2007年第11期23卷 2205-2209页

作者：王跃春张洹暨南大学医学院血液病研究所广东广州510632

目的:分离鉴定人胎骨髓中的间质干细胞(MSCs),探索其体外培养的生物学特性,并在化学因子作用下诱导其向肝细胞分化。方法:利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓MSCs;利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其... 详细信息

目的:分离鉴定人胎骨髓中的间质干细胞(MSCs),探索其体外培养的生物学特性,并在化学因子作用下诱导其向肝细胞分化。方法:利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓MSCs;利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化;采用DMSO、β-Me和5-aza联合预诱导24h,换用H-DMEM和rh-HGF正式诱导人胎骨髓MSCs向肝细胞分化,并从形态学和特异性细胞化学染色等方面加以鉴定。结果:从人胎骨髓中成功分离、纯化得到MSCs,P4代MSCs有92.3%的细胞处于G0/G1期;P5代MSCs有96.1%的细胞处于G0/G1期。流式细胞仪检测P3代MSCs结果显示:人胎骨髓MSCs表达CD29、CD44、CD105和CD106,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下,人胎骨髓MSCs可快速向脂肪及成骨细胞分化;在上述诱导条件下,人胎肝MSCs可分化为类肝细胞,表达特异性抗原甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)。结论:人胎骨髓中含有丰富的MSCs,人胎骨髓来源的MSCs具有较强的多向分化潜能,经DMSO、β-Me和5-aza联合预诱导及rh-HGF、nictinion等化学因子的作用,易向肝细胞样细胞分化,且免疫原性弱,是组织工程(生物型人工肝)的较为理想的种子细胞。

关键词：人胎儿骨髓间质干细胞细胞分化肝细胞样细胞

多因子联合诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞

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中华实验外科杂志 2012年第5期29卷 877-879页

作者：崔罗方商昌珍任萌曹君吕丽虹陈亚进闵军中山大学干细胞与组织工程研究中心广州510120 中山大学孙逸仙纪念医院肝胆胰外科中山大学孙逸仙纪念医院内分泌科

目的建立有效的体外诱导人胚胎干细胞（hESCs）分化为肝细胞样细胞的培养体系。方法将H9hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上，序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化：100μg／L细胞因子活化素A（activinA）诱导3d，20... 详细信息

目的建立有效的体外诱导人胚胎干细胞（hESCs）分化为肝细胞样细胞的培养体系。方法将H9hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上，序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化：100μg／L细胞因子活化素A（activinA）诱导3d，20μg／L骨形成蛋白4（BMP4）和10μg／L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导4d，10μ∥L肝细胞生长因子（HGF）诱导5d，最后以含10μg／L制瘤素M（OSM）及1×10^-7moVL地塞米松（Dex）的培养液继续诱导4d。于细胞诱导分化第16天，采用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）及免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性基因和蛋白表达水平；过碘酸．雪夫反应（PAS）试验和吲哚氰绿（ICG）摄取试验检测分化细胞是否具备肝细胞功能。结果activinA、BMP4、bFGF、HGF、OSM和Dex联合诱导的分化细胞具有类似肝细胞的形态结构，呈多角形或卵圆形；RT—PCR结果显示分化第16天的细胞表达甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白7（CK7）、细胞角蛋白19（CK19）、肝细胞核因子-4a（HNF-4a）、a1-抗胰蛋白酶（AAT）等肝脏特异性基因；免疫荧光化学检测结果显示分化第16天的细胞表达AFP、ALB、CK19、CYP7A1等肝脏特异性蛋白；PAS试验及ICG试验显示分化细胞具备糖原合成和ICG摄取释放等肝细胞功能。结论体外联合多种诱导因子可诱导hESCs定向分化为肝细胞样细胞。

关键词：胚胎干细胞肝细胞样细胞分化

人诱导多能干细胞源性肝细胞样细胞及其应用研究进展

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中华肝脏病杂志 2018年第1期26卷 69-72页

作者：曹影影曾星广州中医药大学第二附属医院Ⅰ期临床研究室 510006

诱导多能干细胞（iPSCs）具有无限增殖、分化成多种体细胞的潜能，其中包括分化为肝细胞样细胞（HLCs）。人iPSCs诱导分化的肝细胞样细胞（hiPSC-HLCs）具有原代肝细胞相似的特征和功能，是一个高效的体外肝细胞模型，为肝脏疾病和药物... 详细信息

诱导多能干细胞（iPSCs）具有无限增殖、分化成多种体细胞的潜能，其中包括分化为肝细胞样细胞（HLCs）。人iPSCs诱导分化的肝细胞样细胞（hiPSC-HLCs）具有原代肝细胞相似的特征和功能，是一个高效的体外肝细胞模型，为肝脏疾病和药物肝毒性评价研究带来了希望。现对hiPSC—HLCs及其在疾病模型、药物肝毒性评价和细胞移植等领域的应用研究进行简要概述，并对其应用前景进行展望。

关键词：诱导多能干细胞肝细胞样细胞疾病模型药物肝毒性评价细胞移植

人脂肪来源的干细胞体外培养特性及分化为肝细胞样细胞的研究

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自然科学进展 2006年第4期16卷 421-426页

作者：李绍青管利东王韫芳白慈贤岳慧敏闫舫南雪施双双司徒镇强裴雪涛第四军医大学口腔医院军事医学科学院野战输血研究所北京100850 军事医学科学院野战输血研究所

肝脏组织工程的兴起和不断发展使各种急慢性肝病得到彻底的治愈成为可能．而肝脏组织工程的发展很大程度上受制于种子细胞的来源不足．为了寻找理想的肝脏组织工程种子细胞, 本实验从吸脂术所得的脂肪抽吸液中分离出干细胞,利用流式细... 详细信息

肝脏组织工程的兴起和不断发展使各种急慢性肝病得到彻底的治愈成为可能．而肝脏组织工程的发展很大程度上受制于种子细胞的来源不足．为了寻找理想的肝脏组织工程种子细胞, 本实验从吸脂术所得的脂肪抽吸液中分离出干细胞,利用流式细胞仪、染色体核型分析等方法对其生长特性、表面标志及生长的稳定性作了分析;用含有肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF-4)的条件培养基将其向肝细胞样细胞诱导分化,并利用RT-PCR及免疫荧光的方法检测了分化后细胞的标志物CK18,甲胎蛋白(AFP)和白蛋白以及分化后细胞的功能．结果显示, 脂肪来源的干细胞不仅有良好的生物学稳定性,而且分化后的细胞表达了肝细胞的标志物且具有一定的肝细胞的功能．这为解决肝脏组织工程种子细胞来源的问题提供了可能．

关键词：脂肪干细胞细胞分化肝细胞样细胞

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骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的诱导分化

世界华人消化杂志 2009年第26期17卷 2654-2661页

作者：邢全台孙启龙李栋邢培祥马瑞萍陈丰哲邵美英姚永远关彦彦山东大学齐鲁医院感染病科山东大学齐鲁医院普外科山东省济南市250012 山东大学齐鲁医院低温医学研究室山东大学齐鲁医院检验科

目的:探讨大鼠骨髓间充质细胞向肝细胞样细胞的诱导分化,观察诱导分化细胞的形态和分子生物学特性,及其对急性肝损伤大鼠的治疗作用.方法:分离、培养并纯化大鼠骨髓间充质细胞,培养基中加入肝细胞生长因子(HGF)、纤维生长因子-4(FGF-4)... 详细信息

目的:探讨大鼠骨髓间充质细胞向肝细胞样细胞的诱导分化,观察诱导分化细胞的形态和分子生物学特性,及其对急性肝损伤大鼠的治疗作用.方法:分离、培养并纯化大鼠骨髓间充质细胞,培养基中加入肝细胞生长因子(HGF)、纤维生长因子-4(FGF-4)及上皮细胞生长因子(EGF),分别于7、14、21、28d观察细胞形态变化,采用RT-PCR方法检测细胞白蛋白(ALB)、甲种胎儿球蛋白(AFP)、细胞角蛋白-18(CK-18)的mRNA表达,将诱导分化28d的细胞经DAPI染料染色后,经门静脉注入同种异体大鼠体内,经24、48、72及168h分批处死大鼠,观察大鼠肝组织内荧光细胞的分布.大鼠腹腔注射硫代乙酰胺制作急性肝衰竭模型,将1×106及5×106个诱导分化细胞经门静脉注入大鼠体内,经48、168h采血查肝功,168h处死大鼠,取肝组织病理学检查.结果:大鼠间充质细胞经上述3种细胞因子诱导后,形态和生物学行为方面都发生向肝细胞样细胞方面的转化,经门静脉注入大鼠体内后,有大量该种细胞在肝组织内分布,24h荧光细胞最多,随时间延长逐渐减少,可持续7d.骨髓间充质细胞的诱导分化细胞经门静脉注入肝损伤模型大鼠体内后,大鼠肝功能有所好转,注入1×106细胞大鼠ALT由注入前238.0±113.5U/L,48h后降至189±68.4U/L,168h后降至149.0±54.2U/L,TBIL由注入前2.9±1.6μmol/L,48h至3.0±1.4μmol/L,168h至1.3±0.3μmol/L;注入5×106个细胞者(ALT)由注入前238.0±113.5U/L,48h后降至169.7±46.0U/L,168h后降至103.7±46.0U/L,TBIL由注入前2.9±1.6μmol/L,48h至2.9±1.3μmol/L,168h至0.9±0.3μmol/L.结论:大鼠骨髓间充质细胞可在某些细胞因子的诱导作用下发生类肝细胞样转化,将转化细胞经门静脉植入同种异体大鼠体内后可在肝组织内存活并对大鼠肝损伤有一定修复作用.

关键词：骨髓间充质细胞肝细胞样细胞诱导分化肝细胞生长因子成纤维细胞生长因子-4