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脂质体介导人β-神经生长因子基因转染培养肌母细胞的表达研究

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华西医科大学学报 2002年第1期33卷 12-14页

作者：毛伯镛刘艳辉陈俊杰王若菡程永忠高立达贺民李胜富四川大学华西医院神经外科成都610041 华西基础医学与法医学院重组DNA研究室华西医院移植工程与移植免疫研究室

目的　了解含 β-神经生长因子 (β- NGF)基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT在培养肌母细胞中的表达及 L ipofect AMINE阳离子脂质体介导的转染效率。方法　将表达质粒 PSVCEP NGF- CAT经 L ipofectAMINE转染至培养成的肌母细胞中 ,用免... 详细信息

目的　了解含 β-神经生长因子 (β- NGF)基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT在培养肌母细胞中的表达及 L ipofect AMINE阳离子脂质体介导的转染效率。方法　将表达质粒 PSVCEP NGF- CAT经 L ipofectAMINE转染至培养成的肌母细胞中 ,用免疫细胞化学方法检测基因在肌母细胞内的表达。结果　培养肌母细胞在转染 6小时吞噬脂质体最显著 ,转染 48小时后约 40 %的肌母细胞胞质内有β- NGF基因表达。结论　含β- NGF基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT可以在培养肌母细胞中表达 ,脂质体转染的方法简便。

关键词： β-神经生长因子基因转染肌母细胞脂质体 LipofectAMINE 免疫细胞化学

肌母细胞外泌体的制备及其治疗深二度烫伤的实验研究

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肌母细胞外泌体的制备及其治疗深二度烫伤的实验研究

作者：谭强华中科技大学

学位级别：硕士

深度大面积烧烫伤的临床治疗效果远不能达到患者的期望,留下的瘢痕也给患者带来极大的生理和心理创伤。找到一种更为有效的治疗方法迫在眉睫。外泌体是细胞分泌的直径为30-150 nm的双层膜结构的囊泡,它不仅在细胞通讯和免疫调节中起作用... 详细信息

深度大面积烧烫伤的临床治疗效果远不能达到患者的期望,留下的瘢痕也给患者带来极大的生理和心理创伤。找到一种更为有效的治疗方法迫在眉睫。外泌体是细胞分泌的直径为30-150 nm的双层膜结构的囊泡,它不仅在细胞通讯和免疫调节中起作用,其组织修复功能近年来也倍受关注。肌母细胞外泌体与干细胞外泌体相比,产量更能满足烧烫伤临床需要并且稳定性更高。本课题以体内外模型为对象,研究了肌母细胞外泌体治疗烫伤的效果及其机制。取得如下主要研究结果:(1)建立了诱导鼠源肌母细胞C2C12分化促进其外泌体分泌的培养条件,并通过超速离心方法分离获得鼠源肌母细胞C2C12外泌体(以下简称C2C12-Ex)。诱导分化条件培养基为:含1%马血清和0.3%胰岛素的高糖DMEM。动态光散射和透射电镜分析所获得的肌母细胞外泌体为圆形或椭圆形并具备双层膜结构,粒径为100nm左右;进一步采用蛋白免疫印迹分析,发现所获得的外泌体中含有大量的外泌体标记蛋白CD63和TSG101;以上结果证明通过超速离心方法成功获得肌母细胞外泌体。并采用BCA蛋白定量方法确定外泌体的产率为2 mg外泌体蛋白/1000 mL条件培养基。(2)建立了体外热激小鼠成纤维细胞损伤模型,发现C2C12-Ex对该模型的细胞有明显的促增殖和抗凋亡效应。分别在40℃、43℃、46℃条件下热水浴刺激小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1和成纤维细胞L929 40 min,在不同时间对细胞计数,结果显示,43℃刺激40 min为最适造模温度;在选定的造模条件下,研究了C2C12-Ex对细胞损伤模型的修复效果,对增殖蛋白PCNA和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达进行分析,结果显示,C2C12-Ex能在该细胞损伤模型中促进PCNA和Bcl-2的表达,表明C2C12-Ex对体外热激受损的成纤维细胞3T3-L1和L929有明显的促增殖和抑凋亡效应。(3)建立了SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型,并研究了C2C12-Ex对该模型的治疗效果及可能机制。烫伤愈合实验发现,C2C12-Ex能显著促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合,且具有剂量效应;对创面组织角质细胞的表面标记CK19、增殖核抗原PCNA和新生血管标记CD31的表达进行分析,发现C2C12-Ex能加速创面更完整地完成表皮再生的过程,并能提前促进细胞和血管大量再生;对各组胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白ⅢmRNA表达的分析发现,C2C12-Ex在创面愈合过程中,能优化烫伤创面皮肤组织胶原的产生,减少瘢痕的形成。以上研究结果为肌母细胞外泌体C2C12-Ex治疗深Ⅱ度烫伤的临床应用提供了实验依据。

关键词：烧烫伤肌母细胞外泌体创面愈合

肌母细胞分离纯化及flrg转基因细胞株构建

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肌母细胞分离纯化及flrg转基因细胞株构建

作者：方晗华中科技大学

学位级别：硕士

肌病、缺血性心肌病和II型糖尿病等疾病都是由肌细胞缺陷造成的，且目前均无有效的治疗手段。近期，通过肌母细胞移植能够有效的缓解或治疗这些疾病。肌母细胞是一种单能干细胞，它能够定向分化为肌细胞，而且在其富集后能够互相融合最... 详细信息

肌病、缺血性心肌病和II型糖尿病等疾病都是由肌细胞缺陷造成的，且目前均无有效的治疗手段。近期，通过肌母细胞移植能够有效的缓解或治疗这些疾病。肌母细胞是一种单能干细胞，它能够定向分化为肌细胞，而且在其富集后能够互相融合最终分化为新的肌纤维，并且移植后的肌母细胞能够产生收缩蛋白，增强骨骼肌和心肌收缩功能，因此在治疗肌病和心肌梗死等肌细胞功能不全的疾病过程中，具有良好的疗效;另外，由于移植的肌母细胞能够和受体细胞天然融合，通过将正常肌母细胞中的核移植至受体细胞，能够在基因组层面上进行治疗，从而治疗II型糖尿病等基因缺陷型疾病。目前，肌母细胞的分离纯化方法尚处于研究阶段，距离其临床应用仍需要大量的研究工作。因此，本课题的研究目的即以Wistar大鼠为模型，建立分离纯化能够应用于临床治疗的肌母细胞的方法，主要研究结果主要有以下几个方面： 1．本研究利用混合酶分步消化的方法，成功的从小鼠的四肢肌肉群中分离出了原代肌母细胞，并利用差速贴壁法对分离出的肌母细胞进行纯化，纯化率高达90%以上，建立了原代肌母细胞体外培养体系。 2．根据肌母细胞特异性表达蛋白Desmin，分别从基因水平和免疫水平对分离出的细胞进行鉴定，确定为肌母细胞。 3．成功的构建了flrg-pcDNA3.1(-)表达质粒，转入肌母细胞后，利用qRT-PCR和western blotting实验分别检测flrg基因和FLRG蛋白的表达量，证明flrg基因和FLRG蛋白成功过表达，成功构建了flrg转基因细胞株。 4．利用细胞计数和流式细胞仪检测细胞周期方法，确定了flrg转基因细胞株细胞增殖能力提高，转染后的肌母细胞处于S期的比例比未处理的肌母细胞处于S期的比例要高一倍左右，这表明，FLRG蛋白是通过加速细胞从G0/G1期到S期的过渡来促进肌母细胞的增殖，具有促进肌母细胞增殖的作用。

关键词：肌母细胞分离纯化细胞培养 flrg转基因

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肌母细胞对裸鼠子宫内膜癌的初步治疗研究

肌母细胞对裸鼠子宫内膜癌的初步治疗研究

作者：张慧郑州大学

学位级别：硕士

研究背景子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,以来源于子宫内膜癌腺体最常见,近年发病率在世界范围内呈上升趋势[3],部分患者因合并症及自身原因不能耐受手术或放疗、化疗治疗,临床医生一直试图寻求一种既能产生疗效又能提高生活质量... 详细信息

研究背景子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,以来源于子宫内膜癌腺体最常见,近年发病率在世界范围内呈上升趋势[3],部分患者因合并症及自身原因不能耐受手术或放疗、化疗治疗,临床医生一直试图寻求一种既能产生疗效又能提高生活质量的治疗方案。人肌母细胞基因疗法(HMGT)作为目前世界医疗水平较前研的治疗手段,可修复退化肌纤维受损基因补充活细胞。柳叶刀在1990年7月14日公布它是世界上第一个人类基因治疗,其可通过修复受损基因补充Duchenne型肌营养不良症的抗肌萎缩蛋白[13]。据来自美国食品药品管理局批准的II/III期临床试验中的数据表明,肌母细胞移植治疗肌营养不良症有明显的的疗效和安全性的优点;由FDA和EMA批准的II/III期缺血性心肌病临床试验中表现出显著的的疗效和较高的安全性[24];研究表明在II型糖尿病中肌母细胞参与了胰岛素信号通路和线粒体生物合成的功能[66],可以调节基因的表达水平;近年来,肌母细胞对胃癌动物模型和前列腺癌根治术后尿失禁也有一定的治疗作用。实验研究显示,肌母细胞移植入宿主细胞后可以导致肿瘤细胞的周期停滞与诱导凋亡,在前列腺癌小鼠模型中[65],注射肌母细胞能够抑制实体肿瘤的生长及转移,从而达到肿瘤的治疗与防治的目标。研究目的建立裸鼠子宫内膜癌模型,研究肌母细胞和子宫内膜癌细胞在裸鼠体内的相互作用,探讨肌母细胞对子宫内膜癌的初步治疗作用,为靶向子宫内膜癌的治疗提供理论与科学依据。如果该实验研究达到预期效果,将进一步进入临床研究阶段,并在子宫内膜癌的治疗中取得突破性的进展,人肌母细胞基因疗法成为了继手术、放疗、化疗等治疗手段之外的新的治疗方法,不仅能够有效的延长子宫内膜癌患者的长期生存率,而且可以极大的提高肿瘤患者的生活质量。材料与方法建立子宫内膜癌裸鼠模型,并将构建成功的30个裸鼠模型随机分为3组,即实验组、对照组、化疗组,每组10只,三组分别给予肌母细胞瘤体注射、腹腔注射顺氯氨铂、腹腔注射生理盐水。注射后每两日测量肿瘤长、短径,观察肿瘤及裸鼠变化,连续观察4周,计算各组肿瘤体积、抑瘤率及裸鼠体重及精神变化。HE染色观察各组肿瘤组织形态学改变,免疫组织化学法检测肿瘤中PTEN蛋白的表达水平。研究结果实验前对照组,化疗组及实验组裸鼠体重、肿瘤体积分别为(17.16±0.73)g、(38.27±2.5 8)mm3,(17.02±0.40)g、(35.99±1.32)mm3,(17.05±0.38)g、(37.05±2.9 3)mm3,实验后三组裸鼠体重,肿瘤体积分别为(16.23±0.3 1)g、(1 5 4.0 2±1 3.6 6)mm3,(17.26±0.50)g、(54.94±10.84)mm3,(19.50±0.49)g、(21.64±7.56)mm3;实验组、化疗组抑瘤率分别为85.95%、64.33%;三组PTNE阳性率分别为30%、40%、60%;HE染色光镜下观察,对照组可见大量典型的肿瘤细胞、异型性明显;实验组肿瘤细胞固缩、胞核裂解,可见大量凋亡坏死细胞;化疗组可见瘤体部分局限坏死组织,瘤体仍存在肿瘤细胞。结论1.实验组瘤体明显缩小,瘤体生长较化疗组缓慢,提示肌母细胞可能成为临床上子宫内膜癌的有效治疗方法。2.实验组瘤体HE染色提示癌细胞大量裂解坏死,免疫组化提示PTEN高表达,其治疗效果较化疗组明显。3.肌母细胞治疗裸鼠子宫内膜癌时对小鼠体重的影响是正向的,在抑制肿瘤增殖的同时,对体重、食欲、精神等方面的影响较小,可上调PTEN表达。4.肌母细胞较顺氯氨铂可更好地抑制裸鼠子宫内膜癌增殖,应用于子宫内膜癌治疗方面有一定可行性。

关键词：子宫内膜癌裸鼠肌母细胞

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小鼠肌母细胞的增殖与分化

四川动物 2007年第4期26卷 810-811页

作者：王丽霞陈祥贵杨潇卢胜娟西华大学生物工程学院成都610039

通过对小鼠肌母细胞C2C12的培养,研究C2C12细胞的增殖与分化的关系以及胰岛素在细胞分化过程中的作用。在对照组中,C2C12细胞增殖占了明显的优势,细胞形态几乎没有发生变化;而在实验组中,C2C12细胞在换为分化培养基24小时后,就出现了部... 详细信息

通过对小鼠肌母细胞C2C12的培养,研究C2C12细胞的增殖与分化的关系以及胰岛素在细胞分化过程中的作用。在对照组中,C2C12细胞增殖占了明显的优势,细胞形态几乎没有发生变化;而在实验组中,C2C12细胞在换为分化培养基24小时后,就出现了部分细胞衰亡和死亡的现象,尤其是在48小时细胞的死亡率达到最高,存活细胞开始从增殖期进入分化期,72小时出现了少量肌管,在96小时细胞分化效果达到最好。而在添加了胰岛素的分化培养基中的细胞分化效果明显好于没有添加胰岛素的分化培养基中的细胞,结果表明,胰岛素促进C2C12细胞的分化。

关键词：肌母细胞增殖分化小鼠

脑源性神经营养因子基因转染培养肌母细胞的表达

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中华实验外科杂志 2001年第5期18卷 459-460,T003页

作者：刘艳辉毛伯镛陈俊杰王若菡高立达程永忠张杰李胜富华西医科大学附属第一医院神经外科成都610041 华西医科大学基础医学院重组DNA室华西医科大学附属第一医院病理科成都610041 华西医科大学附属第一医院移植工程与移植免疫研究室成都610041

目的　了解含脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的表达质粒PSVCEPBDNF CAT在培养肌母细胞中的表达情况及LipofectAMINE阳离子脂质体介导的转染效率。方法　按每 2 μg表达质粒PSVCEPBDNF CAT由 2 0 μlLipofectAMINE包裹后转染至细胞浓度... 详细信息

目的　了解含脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的表达质粒PSVCEPBDNF CAT在培养肌母细胞中的表达情况及LipofectAMINE阳离子脂质体介导的转染效率。方法　按每 2 μg表达质粒PSVCEPBDNF CAT由 2 0 μlLipofectAMINE包裹后转染至细胞浓度为 2× 1 0 8个 /L的3 .5cm培养皿培养的肌母细胞中 ,连续观察细胞形态 ,48h后用免疫细胞化学和免疫电镜的方法来检测其表达情况。结果　培养肌母细胞在转染 6h吞噬脂质体最显著 ,转染 48h后 ,40 %的肌母细胞胞质内有BDNF基因表达 ,免疫电镜结果证实表达在细胞质近胞膜处。结论　含BDNF微基因的表达质粒PSVCEPBDNF CAT可以在培养肌母细胞中表达 ,脂质体转染的方法简便、有效。

关键词：脑源性神经营养因子基因转染免疫细胞化学肌母细胞 BDNF

细胞膜去极化通过激活MAPK信号通路促进原代肌母细胞增殖

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南京师大学报（自然科学版） 2020年第1期43卷 100-106页

作者：郑丽蓉许艳华曾卫卫陈宇琛范春娥陈华群南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室江苏南京210023

细胞膜去极化可促进某些细胞包括肌卫星细胞的增殖,但去极化对于肌母细胞的作用还不清楚.本文通过培养基中高浓度的钾离子(K^+)引发小鼠原代肌母细胞膜的去极化,采用直接计数法评估细胞的增殖能力.结果显示,在K^+浓度为25 mmol/L的培养... 详细信息

细胞膜去极化可促进某些细胞包括肌卫星细胞的增殖,但去极化对于肌母细胞的作用还不清楚.本文通过培养基中高浓度的钾离子(K^+)引发小鼠原代肌母细胞膜的去极化,采用直接计数法评估细胞的增殖能力.结果显示,在K^+浓度为25 mmol/L的培养基中培养24 h后,肌母细胞数量较常规培养基(5 mmol/L K^+)明显增加,但K^+高至50 mmol/L和100 mmol/L时对细胞增殖没有促进作用.通过流式细胞技术进行细胞周期分析显示,25 mmol/L K^+处理使G1期的细胞数量减少,S期的细胞数量增加.免疫荧光染色和Western blot研究发现,25 mmol/L K^+处理后,对肌母细胞的肌分化能力没有影响.进一步研究发现,25 mmol/L K^+明显促进了肌母细胞MAPK信号通路(ERK1/2)的激活,并与其促进细胞增殖的效应相关.MEK1/ERK1/2的两种抑制剂U0126和PD98059均可减弱细胞膜去极化引起的细胞增殖促进效应.综上,研究结果表明细胞膜去极化通过激活MAPK通路促进小鼠原代肌母细胞的增殖.

关键词：去极化肌母细胞细胞增殖 MAPK信号通路

蛋白激酶C在L-6TG肌母细胞缺血预处理中的作用

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山东医药 2008年第17期48卷 38-39页

作者：李宏杰张连元董淑云门秀丽华北煤炭医学院河北唐山063000

将大鼠L-6TG肌母细胞随机分为五组:对照组(C组)不予处理,缺血再灌注组(IR组)行IR处理,缺血预处理组(IPC组)予IPC处理后行IR,PMA组予蛋白激酶C(PKC)激动剂PMA处理后行IR,H7组予PKC抑制剂H7处理后行IPC及IR。检测各组上清液中LDH及细胞内... 详细信息

将大鼠L-6TG肌母细胞随机分为五组:对照组(C组)不予处理,缺血再灌注组(IR组)行IR处理,缺血预处理组(IPC组)予IPC处理后行IR,PMA组予蛋白激酶C(PKC)激动剂PMA处理后行IR,H7组予PKC抑制剂H7处理后行IPC及IR。检测各组上清液中LDH及细胞内SOD、XOD、Ca2+水平,及线粒体呼吸功能、细胞凋亡率;光镜下观察细胞形态学改变。结果与对照组相比,IR组LDH及细胞内XOD、Ca2+水平及凋亡百分率明显增加,细胞内SOD及线粒体呼吸功能明显降低;DNA电泳出现典型梯状条带,细胞严重受损;与IR组相比,IPC组LDH、XOD、Ca2+水平及凋亡率明显降低,细胞内SOD及线粒体呼吸功能明显增加,DNA电泳无梯状条带,细胞形态变化不明显;PMA组变化与IPC组相似;H7组与IR组检测结果相近。提示PMA可模拟IPC的作用,H7可完全消除IPC作用;IPC减轻IR所致细胞凋亡的机制可能与PKC激活有关。

关键词：蛋白激酶C,激动剂,抑制剂肌母细胞缺血预适应再灌注损伤细胞凋亡

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适合人肌母细胞的无血清培养基

中国组织工程研究 2015年第51期19卷 8271-8275页

作者：王琳刘谋元周立冬刘理金刘爱兵武警总医院医学实验中心北京市100039 灾害救援医学北京市重点实验室北京市100071 辽宁医学院辽宁省锦州市121001

背景:肌母细胞体外培养大多使用添加胎牛血清培养基,存在很多不足,开发无血清培养基,更加稳定、安全、经济,有广泛的应用前景。目的:初步探索适合人肌母细胞培养的无血清培养基。方法:配制含胎牛血清培养基(DMEM/F12 1∶1添加胰岛素样... 详细信息

背景:肌母细胞体外培养大多使用添加胎牛血清培养基,存在很多不足,开发无血清培养基,更加稳定、安全、经济,有广泛的应用前景。目的:初步探索适合人肌母细胞培养的无血清培养基。方法:配制含胎牛血清培养基(DMEM/F12 1∶1添加胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子和体积分数20%胎牛血清),间充质干细胞无血清培养基组(无血清培养基、2%血清替代物、2 mmol/L L-谷氨酰胺,人脐带间充质干细胞,细胞纯度大于99%,UltraC ULTURETM添加血清替代物,谷氨酰胺)。自制无血清培养基组(GibcoTM添加胰岛素样生长因子1,碱性成纤维细胞生长因子,谷氨酰胺)。3种培养基分别对人肌母细胞分别进行培养,观察肌母细胞的形态、免疫组织化学的鉴定,计算克隆的形成率,绘制细胞生长的曲线,MTT检测肌母细胞的活性,比较3种培养基培养肌母细胞增殖、分化的差异。结果与结论:各组细胞形态上无明显差异;各组免疫组织化学鉴定肌母细胞纯度均达99%;含胎牛血清培养基组和自制无血清培养基组克隆形成率显著高于间充质干细胞无血清培养基组(P细胞数远高于间充质干细胞无血清培养基组;自制无血清培养基组细胞活性显著高于含胎牛血清培养基组和间充质干细胞无血清培养基组(P肌母细胞的培养,在促进肌母细胞早期贴壁、增殖上还需进一步优化。

关键词：肌纤维母细胞幼牛血清培养基组织构建组织工程肌母细胞胎牛血清无血清血清替代物谷氨酰胺增殖细胞培养