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人端粒酶反转录酶cDNA编码区的克隆及重组表达载体的构建用于延长组织工程种子细胞寿命的研究

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中国临床康复 2004年第17期8卷 3245-3247,i001页

作者：芮钢王者生吕刚刘戈飞高景恒金旭红辽宁省人民医院骨科辽宁省沈阳市110016 辽宁省人民医院组织工程实验室辽宁省沈阳市110016 中国医科大学附属第一医院骨科辽宁省沈阳市110001 中国医科大学细胞生物实验室辽宁省沈阳市110001 辽宁省人民医院检验科辽宁省沈阳市110016

目的:克隆人端粒酶反转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)cDNA编码区,构建hTERT重组表达载体,用于延长组织工程种子细胞的寿命。方法:利用具有hTERT表达特异性标志(expressionspecifictag,EST)的商品化cDNA克隆,克隆hTERTcDNA编码区,选择Gateway基因克隆表达系统,将hTERT克隆到Gateway系统的入门载体后,通过LR重组反应,将hTERT分别构建到了天然状态表达载体pcDNA3.2-DEST表达载体和GFP报告基因pDEST53表达载体,同时进行了hTERT细胞定位研究和表达状态研究。结果:使用ESTcDNA克隆进行hTERTcDNA编码区基因克隆,获得了成功。构建了hTERT重组表达载体。克隆的hTERT编码区表达的hTERT蛋白成簇分布在细胞核内,重组的hTERT保持了天然hTERT的特性。结论:使用ESTcDNA克隆进行基因克隆,提供了一种快速进行基因克隆的方法。通过DNA序列分析和hTERT细胞内定位及表达分析,证实了克隆的hTERT编码区序列的正确性和生物学功能,为今后延长组织工程种子细胞的寿命奠定了基础。

关键词：人端粒酶反转录酶 cDNA编码区克隆重组表达载体组织工程种子细胞细胞寿命

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重建端粒酶活性延长人成纤维细胞寿命的研究

实验生物学报 2000年第2期33卷 129-140页

作者：汪铮易静李慧邓廉夫汤雪明上海第二医科大学细胞生物学实验室上海200025

正常人体细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短,当缩短至一定长度时细胞将停止增殖并衰老死亡。细胞中的端粒酶对端粒起着补足长度的作用。但端粒酶在正常体细胞中不表达,只在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中表达。最近已有将人端粒酶亚单位... 详细信息

正常人体细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短,当缩短至一定长度时细胞将停止增殖并衰老死亡。细胞中的端粒酶对端粒起着补足长度的作用。但端粒酶在正常体细胞中不表达,只在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中表达。最近已有将人端粒酶亚单位基因导入正常人体细胞而使细胞寿命延长的报道。本研究将人端粒酶催化亚基(hTERT)基因用电穿孔法转入正常人体成纤维细胞,筛选出阳性克隆后传代培养,确认外源性端粒酶基因表达和端粒酶活性的重建,证实细胞衰老延缓;同时,通过DNA整倍性和染色体核型分析,明确这些寿命延长的细胞并未发生恶性转化。目的在于通过在具有成骨潜能的成纤维细胞中重建端粒酶活性来延长它们作为骨修复种子细胞的寿命,并且对它们进一步用于临床的安全性进行考察。

关键词：骨修复成纤维细胞细胞寿命端粒酶 hTERT

酿酒酵母PMT1与PMT3双基因缺失对细胞寿命的影响

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生物技术通报 2018年第4期34卷 139-143页

作者：崔红晶周涛邱堃佩宋浩昌刘新光广东医科大学衰老研究所广东省医学分子诊断重点实验室东莞市衰老与抗衰老重点实验室东莞523808

研究蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase,PMT)家族中PMT3基因缺失,以及PMT1与PMT3双基因缺失对酵母细胞复制性寿命的影响。采用一步基因置换法构建PMT3基因缺失酵母菌株(pmt3Δ),基于基因同源重组的原理,构建PMT1和PMT... 详细信息

研究蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase,PMT)家族中PMT3基因缺失,以及PMT1与PMT3双基因缺失对酵母细胞复制性寿命的影响。采用一步基因置换法构建PMT3基因缺失酵母菌株(pmt3Δ),基于基因同源重组的原理,构建PMT1和PMT3双基因缺失酵母菌株(pmt1Δpmt3Δ);显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计酵母细胞复制性寿命。与野生型酵母细胞的平均复制性寿命(26代)比较,pmt3Δ菌株(24代,P>0.05)和pmt1Δpmt3Δ菌株(25代,P>0.05)的平均寿命均无明显变化,差异无统计学意义。酵母PMT3单基因缺失,以及PMT1和PMT3双基因缺失均不影响细胞的复制性寿命。

关键词：酿酒酵母细胞寿命出芽糖基化

人端粒酶逆转录酶基因的转染对牛耳成纤维细胞寿命及核移植的影响

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人端粒酶逆转录酶基因的转染对牛耳成纤维细胞寿命及核移植的影响

作者：隋丽娜西北农林科技大学

学位级别：硕士

由于成纤维细胞具有有限的分裂次数,在50PDs左右进入衰老阶段,80PDs左右进入危机阶段,细胞凋亡。所以成纤维细胞这种“短暂”的寿命,是无法满足转基因核移植的要求的,限制了在科研和实际当中的应用。作为转基因核移植的供体细胞,至少要... 详细信息

由于成纤维细胞具有有限的分裂次数,在50PDs左右进入衰老阶段,80PDs左右进入危机阶段,细胞凋亡。所以成纤维细胞这种“短暂”的寿命,是无法满足转基因核移植的要求的,限制了在科研和实际当中的应用。作为转基因核移植的供体细胞,至少要能存活到45PDs以上,这样才能保证外源基因在细胞内的整合和正常表达,以及其它为核移植的所作的前期准备工作的顺利完成。本试验将携带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因和人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）目的基因的质粒PEGFPC1-hTERT通过脂质体转染法转入牛耳成纤维细胞,并考察其寿命以及对核移植的影响,为生产转基因动物做准备。 1、用含10%血清DMEM培养液培养牛耳成纤维细胞,通过脂质体Lipofactamine 2000将外源端粒酶逆转录酶基因hTERT转入牛耳成纤维细胞,用荧光显微镜观测EGFP的表达,用600 ug/mL G418筛选获得阳性克隆,然后换为含300 ug/mL G418的培养液继续培养使阳性克隆得到扩增。 2、获得的阳性克隆提取RNA,设计特异性引物进行RT-PCR反应,经电泳分析在443bp处出现目的条带,未转染的细胞无目的条带。转染后的12代（TN12）和22代（TN22）细胞端粒酶活性检测均呈阳性,未转染的细胞无端粒酶活性。 3、测定阳性细胞12代（TN12）和22代（TN22）以及阴性细胞12代（N12）和22代（N22）的生长曲线与群体倍增次数进行比较。群体倍增指数分别为4.14±0.13, 3.27±0.09,3.14±0.06, 2.06±0.05, TN22与N12差异不显著（p＞0.05）,TN12和N22与各组均差异显著（p＜0.05）。结果显示阳性细胞生长速度明显高于未转染的阴性细胞,寿命延长,但只越过了衰老期（50PDs左右）,没有越过危机期（80PDs左右）,不能永生化。经流式细胞仪检测,阳性细胞凋亡率明显降低,核型正常。 4、用55PDs阳性细胞（TN14）与21PDs的阴性细胞（N7）长满瓶皿后分别做供体细胞进行核移植,比较卵裂率,囊胚率和囊胚细胞数。结果两者的卵裂率,囊胚率差异均不显著（p＞0.05）,但是阳性细胞的囊胚细胞数有所减少与阴性细胞差异显著（p＜0.05）。

关键词：牛耳成纤维细胞人端粒酶逆转录酶基因细胞寿命核移植

细胞寿命与分裂能力无关吗?——关于一道课后技能训练题的思考

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中学生物教学 2020年第28期 49-50页

作者：程结南安徽省望江县第二中学 246200

以人教版《生物·必修1·分子与细胞》第6章第3节一道课后技能训练题为例,就其答案中细胞寿命与分裂能力之间的对应关系进行讨论,指出原题表格中的数据只能反映细胞寿命与细胞能否分裂无关,而不能笼统地描述为细胞寿命与分裂能力无关。

关键词：细胞寿命分裂能力增殖寿命

固本健脑液对人胚肺二倍体成纤维细胞寿命及LPO含量的影响

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湖北中医杂志 1998年第6期20卷 52-53页

作者：王平刘玲袁德培湖北中医学院 430061

固本健脑液系以恩施州道地中药材──中国板党为主，辅以健脾、补肾、安神、化瘀等中药加工而成的复方制剂。本实验观察了固本健脑液对人胚肺二倍体成纤维细胞传代次数（寿命）及过氧化脂质（LPO）含量的影响．结果表明；20～200ppm的... 详细信息

固本健脑液系以恩施州道地中药材──中国板党为主，辅以健脾、补肾、安神、化瘀等中药加工而成的复方制剂。本实验观察了固本健脑液对人胚肺二倍体成纤维细胞传代次数（寿命）及过氧化脂质（LPO）含量的影响．结果表明；20～200ppm的固本健脑液能显著延长细胞寿命和降低细胞LPO的含量．且明显优于维生素E对照组的治疗作用。

关键词：固本健脑液胚肺成纤维细胞细胞寿命 LPO