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ROCK通过miRNA-92a作用KLF4促进血管平滑肌细胞增殖与迁移

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ROCK通过miRNA-92a作用KLF4促进血管平滑肌细胞增殖与迁移

作者：李采大连医科大学

学位级别：硕士

目的:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种严重危害人类生命和健康常见疾病,目前已成为发达国家人口死亡的主要原因之一。AS是由于各种刺激因素作用于动脉血管壁引起的炎症性疾病,是心脑血管病的主要诱因。然而AS在体内的具体发... 详细信息

目的:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种严重危害人类生命和健康常见疾病,目前已成为发达国家人口死亡的主要原因之一。AS是由于各种刺激因素作用于动脉血管壁引起的炎症性疾病,是心脑血管病的主要诱因。然而AS在体内的具体发生过程及原因还没有清楚地解释,因此探讨其具体发病机制对心血管疾病的防治和人类的身体健康有重大意义。动脉粥样硬化的发生发展过程与血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）功能的改变密切相关。VSMCs可以通过调节介质如血小板衍生生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF）刺激从血管壁的中向内膜迁移,这一改变是动脉粥样硬化斑块形成的重要步骤之一。Rho激酶（Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白酶家族,在VSMCs的迁移和增殖过程中发挥重要作用,其机制主要是通过调控微丝骨架组装和细胞的局部连接。然而,ROCK对AS发生过程中血管重构的调节机制尚未完全明确。以往研究已经证实,微小RNA（miRNA）与AS的发生有密不可分的联系。本研究拟通过培养人主动脉血管平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cells,AoSMCs）,大鼠胸主动脉平滑肌细胞（A7r5）和大鼠原代胸主动脉细胞来探索miRNAs对ROCK调控的血管平滑肌细胞增殖迁移的影响及机制。方法:（1）使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR）检测利用ROCK的抑制剂Y27632处理A7r5后mi RNA-92a的变化;（2）利用si RNA干扰技术,通过脂质体转染ROCK/siRNA（siROCK）,运用qPCR检测ROCK mRNA水平基因表达是否成功下调;（3）使用瞬时转染技术转染miR-92a模拟物（Pre-miR-92a）和抑制剂（AntimiR-92a）,在VSMCs中抑制或过表达,运用qPCR检测miR-92a是否成功上调或下调;（4）利用siRNA干扰技术,对miR-92a进行上调和下调后qPCR检测ROCK mRNA的表达水平变化;（5）分别采用Boyden Chamber和CCK-8检测miR-92a和ROCK对VSMCs迁移和增殖的影响;（6）利用CCK-8及Boyden Chamber方法检测miR-92a靶基因哺乳动物转录因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）对VSMCs增殖和迁移的影响;（7）运用Western blot检测ROCK的抑制剂Y27632处理VSMCs后KLF4的表达情况;（8）运用细胞免疫荧光技术分析miR-92a和ROCK对VSMCs细胞伪足伸出情况和KLF4表达情况。结果:（1）ROCK抑制剂Y27632使miR-92a的表达下调;（2）mi R-92a的模拟物和抑制剂对ROCK的表达量无明显影响;（3）Anti-miR-92a可抑制由PDGF诱导的A7r5细胞的增殖和迁移,而Pre-miR-92a可以促进A7r5细胞的增殖与迁移;（4）ROCK抑制剂Y27632可以抑制由PDGF诱导的A7r5细胞的增殖和迁移;（5）Pre-miR-92a可以恢复Y27632对VSMCs增殖和迁移的抑制作用;（6）KLF4可以抑制VSMCs的增殖和迁移;（7）Y27632使A7r5细胞中KLF4表达量增加;（8）在PDGF-BB刺激下,anti-miR-92a使KLF4表达量升高,并且抑制丝状伪足形成。siROCK也可使KLF4表达量升高,抑制丝状伪足形成;而pre-miR-92a可以部分抵消siROCK后的上述现象。结论:（1）ROCK和miR-92a均可以促进VSMCs的增殖和迁移;（2）ROCK通过调控miR-92a促进VSMCs的增殖和迁移;（3）ROCK通过miR-92a进而作用于KLF4,以调控PDGF-BB介导的VSMC增殖和迁移。

关键词：动脉粥样硬化 VSMCs ROCK miR-92a 细胞增殖与迁移

糖蛋白Ⅰb-Ⅸ在真核细胞增殖迁移中的作用及机制研究

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糖蛋白Ⅰb-Ⅸ在真核细胞增殖迁移中的作用及机制研究

作者：李姝君苏州大学

学位级别：硕士

[目的]探究糖蛋白(Glycoprotein,GP)Ⅰb-Ⅸ在调控真核细胞增殖和迁移中的作用及其机制。[方法]首先通过流式分选在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中高表达GPⅠb-Ⅸ的1b9细胞和高表达在Ser-609位点突变的GPⅠb-Ⅸ的S609A细... 详细信息

[目的]探究糖蛋白(Glycoprotein,GP)Ⅰb-Ⅸ在调控真核细胞增殖和迁移中的作用及其机制。[方法]首先通过流式分选在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中高表达GPⅠb-Ⅸ的1b9细胞和高表达在Ser-609位点突变的GPⅠb-Ⅸ的S609A细胞,单细胞培养获得稳定表达的细胞株。通过Western Blot、流式细胞术和免疫荧光技术检测1b9细胞和S609A细胞中GPⅠb-Ⅸ的表达及亚细胞定位,确认细胞株的成功构建。通过吉姆萨染色和免疫荧光染色观察CHO、1b9和S609A三株细胞的形态及骨架蛋白排布的变化。通过CCK8法和平板克隆法检测细胞的增殖,碘化丙啶标记DNA检测细胞的周期综合分析GPⅠb-Ⅸ表达对细胞增殖能力的影响;通过Western Blot检测细胞周期蛋白表达情况,分析GPⅠb-Ⅸ表达影响细胞增殖的机制所在。通过划痕实验和Transwell实验检测GPⅠb-Ⅸ表达对细胞迁移和侵袭能力的影响,通过Western Blot检测细胞骨架相关蛋白的表达情况;使用LIM激酶(LIM kinase,LIMK)的抑制剂BMS-5和p21蛋白激活激酶(p21 activated kinase,PAK)抑制剂FRAX597处理三株细胞,通过Transwell实验观察细胞迁移能力的变化;Western Blot确定Cofilin的活性变化,进一步探讨GPⅠb-Ⅸ影响CHO细胞迁移的机制。[结果]通过流式分选、单克隆培养获得GPⅠb-Ⅸ高表达的1b9细胞株和高表达Ser-609位点突变GPⅠb-Ⅸ的S609A细胞株。GPⅠb-Ⅸ基因的转入使1b9细胞形态由CHO的细长梭形转变为扁球形,肌动蛋白骨架收缩,微管蛋白由膜边缘聚集到胞内;GPⅠb-Ⅸ突变基因的转入使S609A细胞形态趋于变圆,肌动蛋白骨架收缩但较1b9细胞有所伸展,微管蛋白较1b9细胞分散,均匀分布在胞质。GPⅠb-Ⅸ基因的转入抑制细胞的增殖能力,1b9细胞的增殖能力下降较S609A细胞更为显著;GPⅠb-Ⅸ基因的转入使细胞克隆形成能力受到抑制,克隆形成群落的体积显著减小,1b9细胞形成的克隆小群落数量较CHO和S609A显著增加;流式检测细胞周期的分布也发现高表达GPⅠb-Ⅸ使细胞在G1期和S期发生不同程度的周期阻滞,影响细胞正常的增殖活动,其中1b9细胞的周期阻滞更为明显。通过对细胞周期蛋白表达量的检测发现,GPⅠb-Ⅸ的高表达会抑制周期蛋白Cyclin D1、CyclinA2、Cyclin B1和CDK2的本底表达,最终阻碍细胞周期监测点的顺利通过,将周期阻滞在G1期和S期,从而抑制细胞的增殖。GPⅠb-Ⅸ基因的转入也会影响细胞的迁移能力,划痕实验和Transwell实验均证明高表达GPⅠb-Ⅸ后,1b9细胞的迁移能力较CHO细胞显著降低,但高表达突变GPⅠb-Ⅸ的S609A细胞的迁移能力较CHO细胞升高。在三株细胞中骨架相关蛋白cofilin的磷酸化表达水平也呈现出显著的差异,其中CHO细胞的p-cofilin的表达量非常低,1b9细胞中p-cofilin的蛋白含量较CHO细胞显著升高,而S609A细胞p-cofilin的表达量显著低于1b9细胞。使用Cofilin上游激酶LIMK1的抑制剂BMS-5和经典肌动蛋白调节激酶PAK1的抑制剂FRAX597处理细胞,Transwell结果显示,BMS-5和FRAX597均增强了 1b9细胞的迁移能力,减弱了 S609A细胞的迁移能力,但不影响CHO细胞的迁移能力。[结论]***Ⅰb-Ⅸ在CHO细胞中的高表达会影响细胞的形态和骨架蛋白的分布。***Ⅰb-Ⅸ在CHO细胞中的高表达通过降低周期蛋白的表达来抑制细胞的增殖和克隆能力。***Ⅰb-Ⅸ在CHO细胞中的高表达通过上调PAK1/LIMK1/Cofilin信号通路来抑制细胞的迁移和侵袭能力。

关键词： GPⅠb-Ⅸ CHO 细胞增殖与迁移细胞骨架

DIPK2A通过PI3K/AKT通路促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

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DIPK2A通过PI3K/AKT通路促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

作者：张家萌中国医科大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是世界第二常见的恶性肿瘤,死亡率也非常高。在我国,肺癌的发病率和病死率都位居前列,是对人民生活质量和健康构成最大威胁的恶性肿瘤之一。然而,由于肺癌发病隐匿,不易察觉,临床观察发现约30.5%的患者在确诊时已处于晚期,导... 详细信息

目的:肺癌是世界第二常见的恶性肿瘤,死亡率也非常高。在我国,肺癌的发病率和病死率都位居前列,是对人民生活质量和健康构成最大威胁的恶性肿瘤之一。然而,由于肺癌发病隐匿,不易察觉,临床观察发现约30.5%的患者在确诊时已处于晚期,导致可用的治疗方法非常有限。此外,传统的治疗方法如手术、放疗和化疗,由于缺乏特异性,取得治疗效果的同时也会给患者带来很大的毒副作用,实际应用条件繁杂,治疗效果也有限。随着科学技术的不断发展,近年来出现了许多新兴治疗方法,如靶向治疗、基因治疗和免疫治疗等,但晚期非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）患者的5年生存率仍不高于5%,预后形势仍非常严峻。因此,识别新的早期诊断和预后标志物,更深入地了解肺癌发病机制并在此过程中寻找关键的信号靶点,对于NSCLC患者的诊断及临床治疗至关重要。DIPK2A（Divergent Protein Kinase Domain 2A,差异蛋白激酶结构域2A）是一种低氧和AKT诱导的干细胞因子,主要存在于内质网中。研究显示,DIPK2A能参与多种生物学进程的调控,如人类神经系统疾病、细胞内囊泡运输、自噬体-溶酶体融合等。数据库显示,DIPK2A的蛋白表达水平在许多肿瘤组织中都有升高,其中也包括肺癌。以往研究表明,DIPK2A可能成为IGF1R的配体,因此,我们推测DIPK2A可能与IGF1R及其下游的PI3K/AKT通路密切关联。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路是广泛存在于细胞中的重要信号转导通路,其主要功能是促进细胞增殖和抗凋亡。PI3K/AKT通路的异常激活是NSCLC发生和发展的重要机制,在癌细胞增殖、侵袭和转移进程中均发挥至关重要的作用。目前尚不完全清楚DIPK2A是否参与了PI3K/AKT通路的传导激活。本研究主要通过si RNA下调及过表达质粒上调等实验方法双向调控DIPK2A的表达,探讨DIPK2A在NSCLC增殖和迁移中的生物学功能及分子机制。此外,通过添加药物抑制PI3K/AKT通路,阻断该通路激活其下游抗凋亡因子从而抑制细胞凋亡,为肿瘤治疗研究开辟了新的思路。根据现有的细胞实验及动物实验,证实P13K抑制剂LY294002对肿瘤细胞的恶性表型能起到抑制作用。因此,本研究通过引入LY294002进一步明确DIPK2A在NSCLC中的作用通路,为寻找NSCLC临床治疗的新靶点和药物公司开发针对基因或通路的小分子靶向治疗药物提供事实和理论依据。研究方法:1、收集中国医科大学第一附属医院病理科存档的104例非小细胞肺癌石蜡标本。采用免疫组化S-P法检测肺癌组织及癌旁组织中的DIPK2A蛋白表达的差异,并分析DIPK2A在肺癌组织中的表达与临床病理特征的相关性。2、利用Kaplan-Meier在线分析DIPK2A与NSCLC患者临床预后之间的关系。3、为明确DIPK2A在非小细胞肺癌中的生物学功能,以DIPK2A表达量中等的A549和SK细胞系建立敲减或过表达DIPK2A的肺癌细胞模型,即通过DIPK2A特异性si RNA或PCMV6-DIPK2A质粒载体分别抑制或增强DIPK2A基因的表达,采用q RT-PCR和Western Blot检测转染效率。通过MTT实验检测肺癌细胞活力,集落形成实验测试细胞增殖能力,通过Transwell小室测试细胞迁移能力,明确DIPK2A在NSCLC细胞中的生物学功能。4、Western Blot实验检测PI3K、AKT、P-AKT蛋白及下游增殖相关蛋白Cyclins和CDKs,迁移相关蛋白Rho A、Rho C、CDC42等蛋白在DIPK2A基因敲减或过表达之后的表达变化。5、Real-time PCR检测DIPK2A基因双向操作之后DIPK2A、PI3K、AKT m RNA水平的变化,以确定DIPK2A是否通过在m RNA水平上调控PI3K/AKT信号通路影响下游蛋白水平的变化。6、内源性免疫共沉淀实验测定DIPK2A与PI3K、AKT蛋白是否存在相互结合。7、在初步确定DIPK2A在NSCLC细胞中发挥促癌作用依赖于PI3K/AKT通路后,设计了一个回复实验来进一步阐明此观点。在过表达DIPK2A的基础上加入PI3K通路抑制剂LY294002,观察其对细胞增殖、迁移能力的影响。同时我们观察了添加LY294002是否可以逆转DIPK2A过度表达对PI3K/AKT通路及其下游蛋白表达的影响。结果:1、DIPK2A在NSCLC中高表达,且与患者不良预后具有相关性。NSCLC石蜡标本的免疫组化检测结果显示,DIPK2A在NSCLC中高表达,其表达与NSCLC的分化程度、患者肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期具有显著相关性。2、通过Kaplan-Meier在线分析DIPK2A基因

关键词：非小细胞肺癌细胞增殖与迁移 DIPK2A PI3K/AKT LY294002

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中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 2024年第7期 0193-0197页

作者：黄群欢倪晓鸽陶春林上海市奉贤区中心医院上海201400

分析WARS1通过免疫相关基因STAT1调控在卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)当中的增殖与侵袭的作用机制。方法将上海市奉贤区中心医院、江苏省常州市妇幼保健院以及金华市妇幼保健院在2012-2017年收治的174例患者,共收集108例浆液性卵巢癌样本... 详细信息

分析WARS1通过免疫相关基因STAT1调控在卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)当中的增殖与侵袭的作用机制。方法将上海市奉贤区中心医院、江苏省常州市妇幼保健院以及金华市妇幼保健院在2012-2017年收治的174例患者,共收集108例浆液性卵巢癌样本。按照WARS1的表达情况分为高表达组与低表达组,分析不同组别在分类、年龄、病理级别、淋巴结转移以及临床分期上存在的差异。使用RT-PCR及WB技术在mRNA及蛋白水平检测上皮性卵巢癌性葆艾CAOV3、OV429、OVCAR3、OVCAR5、OVCAR8、A2780、SKOV3及ES2中的WARS1表达情况,选择表达量较高的细胞株进行稳转敲低,表达量较低的细胞株进行稳转过表达,对稳转敲低及过表达的效率进行验证。将干扰效率最佳的siRNA对上皮性卵巢细胞癌进行干扰,鉴定敲低及过表达的WARS1细胞功能,使用CCK及克隆实验检测其中的细胞增殖能力,使用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,使用Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭能力。借助TGGA数据库对基因集进行富集分析,明确WARS在卵巢癌生物学功能影响的分子机制。结果分类、浆液性卵巢癌淋巴结转移、浆液性卵巢癌临床分期与其密切相关(P增殖能力有明显的降低,经过克隆形成实验的稳转敲低之后,卵巢癌细胞增殖能力降低。经过Transwell实验敲低WARS1之后,卵巢癌细胞的迁移能力、侵袭能力降低。经过凋亡实验之后,发现卵巢癌细胞凋亡能力升高。通过富集分析发现,WARS1会对P13K/AKT/mTOR信号通路有促肿瘤的作用。结论 WARS1在卵巢癌当中为高表达,与患者的不良预后有密切关系,可能会在未来成为浆液性卵巢癌的潜在治疗靶点。

关键词：卵巢癌细胞增殖与迁移侵袭作用色氨酰tRNA合成酶1

RNA干扰HMGB1基因对食管鳞癌细胞X线照射后增殖与迁移能力影响

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中华放射肿瘤学杂志 2019年第12期28卷 933-938页

作者：杨兴肖张雪原邹乃祎马鸣祝淑钗河北医科大学第四医院感染科石家庄050011 河北医科大学第四医院放疗科石家庄050011 河北医科大学第四医院检验科石家庄050011

目的RNAi技术干扰人食管鳞癌细胞中HMGB1基因表达,观察X线照射后细胞增殖活性、迁移和存活能力及细胞周期分布.方法RT-PCR和Western blot法检测HMGB1 mRNA和蛋白表达;分别采用MTS和Transwell方法检测食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30细胞增... 详细信息

目的RNAi技术干扰人食管鳞癌细胞中HMGB1基因表达,观察X线照射后细胞增殖活性、迁移和存活能力及细胞周期分布.方法RT-PCR和Western blot法检测HMGB1 mRNA和蛋白表达;分别采用MTS和Transwell方法检测食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30细胞增殖活性和迁移能力;克隆形成实验检测各组细胞的存活能力;流式细胞术检测照射后各组的细胞周期分布.结果照射组ECA109、KYSE30细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平较未照射组明显增加(P细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低(P细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和NC组(P细胞的放射敏感性明显增加(P细胞数明显降低(P细胞中HMGB1的表达,降低了细胞增殖和迁移能力,通过诱导照射后G0/G1期阻滞增加了放射敏感性.

关键词： HMGB1基因细胞增殖与迁移细胞周期放射敏感性

成骨细胞分泌的网钙结合蛋白1（RCN1）促进肺癌NCI-H1299与NCI-H460细胞的增殖和迁移

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成骨细胞分泌的网钙结合蛋白1（RCN1）促进肺癌NCI-H1299与NCI-H4...

作者：付海静厦门大学

学位级别：硕士

肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,近年来肺癌的发病率和死亡率均居全世界癌症之首。肺癌患者的早期症状不明显,诊断相对困难。多数肺癌患者发现时已是晚期,而肺癌晚期患者容易发生骨转移。研究表明,肿瘤骨转移与骨微环境有密切的关系,骨... 详细信息

肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,近年来肺癌的发病率和死亡率均居全世界癌症之首。肺癌患者的早期症状不明显,诊断相对困难。多数肺癌患者发现时已是晚期,而肺癌晚期患者容易发生骨转移。研究表明,肿瘤骨转移与骨微环境有密切的关系,骨骼中富含生长因子的环境有助于原发性肿瘤细胞向骨或骨髓迁移,为肿瘤细胞生存和生长提供了独特的微环境。在骨组织的细胞中,成骨细胞被证明是重要的肿瘤骨转移的参与者,其分泌的许多特异性蛋白在肿瘤细胞骨转移过程中起到重要作用。已有的文献表明网钙结合蛋白1(Reticulocalbin 1,RCN1)在肿瘤细胞增殖与迁移过程中发挥重要作用,但是其是否参与骨转移的过程尚且缺乏研究。本课题计划通过探讨成骨细胞是否能够通过分泌RCN1,进而调控肺癌细胞的增殖与迁移,初步明确RCN1在肺癌骨转移中的意义。首先,培养人与大鼠成骨细胞,获得条件培养基并处理肺癌NCI-H1299与NCI-H460细胞株,通过MTT,集落形成,RT-PCR,Transwell和WB等实验检测肺癌细胞增殖和迁移指标。随后,通过蛋白质非标定量技术(Label free)检测人与大鼠成骨细胞条件培养基的主要成分,并对其进行蛋白聚类分析,结果发现条件培养基中网钙结合蛋白1(Reticulocalbin 1,RCN1)的蛋白水平较高;梯度离心获取成骨细胞外泌体并WB方法检测外泌体相关特征指标与RCN1的表达状况;TCGA数据库推断RCN1的表达水平与肺癌患者的生存率间的关系;敲低成骨细胞内RCN1的培养基培养肺癌细胞,检测肺癌细胞内RCN1的表达变化等实验,确定RCN1在成骨细胞培养基调控肺癌细胞增殖与迁移中的表达意义。在上述实验基础上,肺癌细胞中敲低或过表达RCN1,检测肺癌细胞的增殖和迁移指标,并初步探讨肿瘤细胞内RCN1可能的作用机制;成骨细胞的培养基是否能够部分缓解肺癌细胞敲低RCN1对增殖与迁移的影响。此外,裸鼠左腿胫骨进行体内成瘤实验,小动物成像检测敲低RCN1的肺癌细胞在骨髓腔内的生长情况。我们的研究结果表明:(1)成骨细胞的条件培养基可以促进肺癌细胞的增殖和迁移。(2)成骨细胞的条件培养基中RCN1的蛋白水平相对较高,并存在于外泌体中;敲低RCN1的成骨细胞的培养基不能促进肺癌细胞的RCN1表达。(3)在肺癌细胞中敲低RCN1,可以抑制肺癌细胞的增殖与迁移;过表达RCN1可以促进肺癌细胞的增殖与迁移;敲低RCN1提高肺癌细胞的内质网应激和细胞自噬水平;成骨细胞条件培养基可部分缓解肺癌细胞内敲低RCN1对细胞增殖与迁移的促进作用。(4)敲低RCN1的肺癌细胞抑制其在裸鼠胫骨骨髓腔内肿瘤生长,但目前只有预实验结果,需要进一步的动物实验进行验证。通过上述实验,我们证实成骨细胞分泌的RCN1能够促进肺癌细胞的增殖和迁移;RCN1通过调节肺癌细胞中内质网应激和自噬水平,调控其增殖和迁移能力。据此推测,靶向成骨细胞的RCN1可能成为干预肺癌骨转移的新治疗选择。

关键词：成骨细胞肺癌细胞网钙结合蛋白1 细胞增殖与迁移

KCTD1在肝细胞癌增殖迁移和血管生成中的作用及调控机制

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KCTD1在肝细胞癌增殖迁移和血管生成中的作用及调控机制

作者：陈丽湖南师范大学

学位级别：硕士

肝癌是世界上第二大致死性恶性肿瘤,主要由肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,i CCA)组成。目前,主流的治疗手段——分子靶向治疗对大多数HCC和i CCA患者的疗效有限。同时,越来越多... 详细信息

肝癌是世界上第二大致死性恶性肿瘤,主要由肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,i CCA)组成。目前,主流的治疗手段——分子靶向治疗对大多数HCC和i CCA患者的疗效有限。同时,越来越多的研究发现,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与肿瘤血管生成及肿瘤发生发展有着密切的联系。钾离子通道蛋白四聚体1(potassium channel tetramerization domaincontaining 1,KCTD1)是一个含有BTB结构域的基因,是钾离子通道蛋白四聚体家族(The family of potassium channel tetramerizationdomain,KCTD)的成员之一,研究表明KCTD1与癌症发生发展的一些重要基因有关,但其在HCC中的具体分子机制以及潜在的临床意义尚不明确。本研究通过免疫组织化学实验(immunohistochemistry,IHC)和蛋白质印迹实验(western blot,WB)检测了人肝癌组织和几种HCC细胞系中KCTD1的表达;此外,采用MTT法、克隆形成实验、Transwell实验、血管生成实验和裸鼠皮下成瘤及尾静脉肿瘤转移等实验方法,观察KCTD1对HCC细胞的增殖、迁移、侵袭、致瘤能力和对靶向药物索拉非尼(sorafenib)敏感性的影响;同时也检测了KCTD1对人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞的增殖、迁移和血管生成的影响。结果发现,KCTD1在肝癌组织与肝癌细胞系中高表达,且KCTD1的表达量与HCC组织级别成正相关;KCTD1过表达在体内外均可促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而KCTD1的下调可抑制这些作用;并且,敲低KCTD1可增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。此外,过表达KCTD1可增强HUVEC细胞的增殖、迁移和血管生成的能力。进一步的实验结果表明,KCTD1可以通过促进VEGF的信号传导,影响VEGF/HIF1-α信号通路相关基因的表达,从而调节HCC细胞的生长和转移。因此,本文研究表明,KCTD1作为一个癌基因在HCC的发生发展的过程中起着重要的作用,为肝癌的靶向治疗提供了新的研究策略。KCTD1也可作为HCC患者临床检测、治疗和预后的潜在标志物,为肝癌研究提供新的思路。

关键词： KCTD1 HCC 索拉非尼细胞增殖与迁移血管生成

TMEM125通过PI3K/AKT通路抑制非小细胞肺癌的增殖与迁移过程

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TMEM125通过PI3K/AKT通路抑制非小细胞肺癌的增殖与迁移过程

作者：李乐尧中国医科大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是一个全球性的恶性肿瘤,其发生率在世界各地都处于领先地位,而且死亡率极高。中国的肺癌患病率是所有恶性肿瘤中最高的,严重威胁我国居民的健康生活。由于肺癌的发病潜伏期较长,而且往往难以被发现,根据临床观察,有30.5%的患... 详细信息

目的:肺癌是一个全球性的恶性肿瘤,其发生率在世界各地都处于领先地位,而且死亡率极高。中国的肺癌患病率是所有恶性肿瘤中最高的,严重威胁我国居民的健康生活。由于肺癌的发病潜伏期较长,而且往往难以被发现,根据临床观察,有30.5%的患者在发现时已处于晚期,这严重阻碍了治疗的有效性。传统的手术、放疗和化疗等方法的特异性不强,在起到治疗效果的同时,会对患者造成较大的毒副作用,而且实际使用条件复杂,治疗效果受到一定的限制。虽然近年来靶向治疗、基因组疗法和免疫学疗法等新兴方法已经被广泛应用,但是晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的五年生存率仍然不足5%。因此,通过发掘新的早期诊断和预后标记,研究肺癌的发生机理,并且找到重要的信号靶点,对于NSCLC早期病患的诊断和治疗有着重大意义,可以为病患带来更好的疗效,并有效地改善患者的生活质量与生存时间。跨膜蛋白125(TMEM125)是跨膜蛋白家族成员,跨膜蛋白(TMEM)又称整体膜蛋白,是膜蛋白的重要组成部分。被归类为TMEM的膜蛋白必须嵌入或横跨生物膜的至少一个区段。由于其结构和分布特点,TMEMs表现出独特的生物功能。越来越多的研究表明,TMEM的异常表达与肿瘤的发生、发展、转移及免疫调节有着密切的关系。TMEM125蛋白由219个氨基酸(aa)组成,基因定位于1p34.2。TMEM125在34-56aa、66-83aa、114-136aa与146-168位置有四个跨膜螺旋结构。TMEM125在肿瘤中的作用与其机制目前尚不明确。通过在NSCLC细胞系中转染TMEM125过表达质粒和siRNA对TMEM125的表达进行双向调控,我们首次发现TMEM125具有抑制NSCLC细胞增殖与迁移的作用,然而,TMEM125发挥这种作用的具体机制尚不明确。PI3K/AKT通路是一种广泛存在于细胞内的信号传导机制,它可以促进细胞的生长和抑制坏死,异常激活的PI3K/ATK通路在NSCLC的发生和发展过程中发挥着不可替代的作用,它可以调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,从而影响患者的预后。我们通过对过表达TMEM125的肺癌细胞系进行转录组测序和生物信息学分析,结果发现TMEM125与PI3K/AKT通路的关系密切,TMEM125可能通过负向调控PI3K/ATK通路活性发挥抑制NSCLC肺癌细胞系的作用。为了验证该假说,我们拟在肺癌石蜡标本中检测TMEM125的表达并统计其与临床病理因素的关系,并且在NSCLC细胞系中,通过应用TMEM125过表达载体,siRNA和PI3K/AKT通路的抑制剂双向调控TMEM125的表达以及PI3K/AKT通路的活性,以验证TMEM125是否通过PI3K/AKT通路发挥抑制NSCLC细胞的增殖和迁移。本研究将丰富NSCLC发生发展的分子机制,为TMEM125未来成为NSCLC的临床治疗新靶点提供理论基础和实验依据。研究方法:1、应用免疫组织化学染色,对113例非小细胞肺癌石蜡切片标本进行TMEM125蛋白表达测定,并采用卡方检验等统计学方法,对其与临床病理因素进行相关分析。2、应用基于TCGA的UALCAN数据库分析TMEM125 mRNA在肺癌中的表达水平。应用Kaplan-Meier生存曲线对TMEM125表达水平和NSCLC病人临床预后关系进行分析。3、通过转染过表达pEGFP-N1-Homo TMEM125质粒载体和特异性siRNA双向调控TMEM125基因的表达后,通过集落形成实验与MTT实验检测NSCLC细胞的增殖能力,通过Transwell迁移实验和划痕实验检测NSCLC细胞的迁移能力。4、对TMEM125过表达细胞进行转录组测序,并对测序结果进行KEGG富集分析以寻找TMEM125潜在的作用靶点与通路。5、通过Western Blot实验检测EMT相关蛋白、PI3K/AKT通路中的关键蛋白以及它们下游的增殖相关蛋白Cyclin D1和p21、p27在TMEM125基因干扰或过表达后的表达水平变化。6、在干扰TMEM125后应用PI3K通路抑制剂PKI-402,抑制PI3K/AKT通路的活性后检测PI3K/AKT通路及其下游蛋白表达,以及NSCLC细胞的增殖与迁移。结果:1、免疫组化检测显示TMEM125在NSCLC组织中低表达,且其表达水平与肿瘤的病灶大小、肿瘤的低分化、淋巴结转移以及TNM分期负相关。TMEM125的低表达与肺癌患者的不良预后相关。2、经Kaplan-Meier生存曲线分析发现,TMEM125的低表达与肺癌患者的不良预后正相关。3、在NSCLC细胞系中过表达TMEM125后,MTT和克隆形成实验显示NSCLC细胞的增殖能力下调,而siRNA干扰TMEM125的表达后可以明显的上调NSCLC的增殖能力。Transwell迁移实验和划痕实验结果显示,过

关键词：非小细胞肺癌 TMEM125 细胞增殖与迁移 PI3K/AKT EMT

miR-376c-3p通过靶向谷氨酸受体相互作用蛋白1影响乳腺癌细胞的增殖和迁移

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江苏大学学报（医学版） 2021年第5期31卷 380-385页

作者：王超高雨婷刘子瑶李涛王晶哲刘璐谢岩孙晓春江苏大学医学院江苏镇江212013

目的:探讨miR-376c-3p在乳腺癌中的表达水平、生物学功能及分子调控机制。方法:通过实时荧光定量PCR检测乳腺上皮MCF-10A细胞及乳腺癌细胞中miR-376c-3p表达水平;然后,用miR-376c-3p mimic转染乳腺癌MCF-7与MDA-MB-231细胞,用平板克隆... 详细信息

目的:探讨miR-376c-3p在乳腺癌中的表达水平、生物学功能及分子调控机制。方法:通过实时荧光定量PCR检测乳腺上皮MCF-10A细胞及乳腺癌细胞中miR-376c-3p表达水平;然后,用miR-376c-3p mimic转染乳腺癌MCF-7与MDA-MB-231细胞,用平板克隆实验、划痕实验以及Transwell实验分别检测其增殖与迁移能力。利用Starbase数据库预测miR-376c-3p的下游靶基因,并通过蛋白质印迹实验进行验证。结果:与人乳腺上皮MCF-10A细胞相比,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-376c-3p表达水平显著降低(P细胞增殖(P均细胞迁移能力;通过生物信息学预测分析,结果显示miR-376c-3p可以与谷氨酸受体相互作用蛋白1(glutamate receptor interacting protein 1,GRIP1)结合,且蛋白质印迹实验证实过表达miR-376c-3p可以抑制乳腺癌细胞GRIP1表达,同时波形蛋白表达水平明显下调,E-钙黏蛋白表达明显上调。结论:在乳腺癌细胞中,miR-376c-3p表达下调;在体外,过表达miR-376c-3p可显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,可能通过靶向GRIP1调节乳腺癌细胞上皮间质转化进程。

关键词： miR-376c-3p 谷氨酸受体相互作用蛋白1 乳腺癌上皮间质转化细胞增殖与迁移