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中华实验外科杂志 2010年第4期27卷 539-540页

作者：田少奇张积华王妍孙康夏长所张才龙于腾波青岛大学医学院附属医院关节外科 266000 青岛大学医学院附属医院查体中心 266000 青岛市妇女儿童医院妇产科

本实验旨在探讨从脐血（UCB）中分离培养间充质干细胞（MSCs）的成功率，并通过对影响其分离培养的相关因素进行研究，以期建立稳定的体外分离培养体系，从而为临床疾病治疗提供种子或载体细胞。

关键词：细胞分离培养间充质干细胞影响因素脐血相关因素体外分离载体细胞临床疾病

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大鼠胚胎视网膜祖细胞分离培养及其分化特性

解剖学杂志 2005年第3期28卷 249-251,F002页

作者：李艳佘振珏周国民复旦大学上海医学院解剖与组织胚胎学系上海200032

目的:建立大鼠胚胎视网膜祖细胞体外培养方法并观察其分化特性。方法:取孕18d大鼠胚胎,用无血清培养技术扩增视网膜祖细胞;用免疫细胞化学、扫描电镜与透射电镜技术对祖细胞的特性及诱导分化的细胞类型进行鉴定。结果:从胚胎大鼠视网膜... 详细信息

目的:建立大鼠胚胎视网膜祖细胞体外培养方法并观察其分化特性。方法:取孕18d大鼠胚胎,用无血清培养技术扩增视网膜祖细胞;用免疫细胞化学、扫描电镜与透射电镜技术对祖细胞的特性及诱导分化的细胞类型进行鉴定。结果:从胚胎大鼠视网膜神经部分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞球能表达Nestin并具有掺入BrdU的能力。诱导分化后的细胞表达,其中,Thy1.1+细胞最多,Opsin+细胞次之,GS+细胞较少,PKC+细胞少,Syntaxin+及Peripherin+细胞极少,不表达CalbindinD28K。结论:从胚胎大鼠分离的细胞具有自我增殖能力和多向分化潜能,属于视网膜祖细胞;诱导分化产生5种视网膜细胞,以节细胞最多,未见水平细胞。

关键词：大鼠胚胎细胞分离培养视网膜祖细胞 Calbindin 无血清培养技术体外培养方法免疫细胞化学诱导分化透射电镜技术 Nestin 多向分化潜能增殖能力胚胎大鼠视网膜神经 D-28K 视网膜细胞细胞类型扫描电镜传代培养

幼猪肺泡上皮和血管内皮祖细胞分离培养技术探讨

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幼猪肺泡上皮和血管内皮祖细胞分离培养技术探讨

作者：吴盼盼复旦大学

学位级别：硕士

研究背景肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡcells, AECⅡ)是肺泡上皮的祖细胞,能够变为Ⅰ型肺泡上皮细胞参与肺损伤修复,分泌肺泡表面活性物质(Pulmonary surfactant, PS)维持肺泡稳定性、防止肺泡萎陷、保持肺的顺应性,能... 详细信息

研究背景肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡcells, AECⅡ)是肺泡上皮的祖细胞,能够变为Ⅰ型肺泡上皮细胞参与肺损伤修复,分泌肺泡表面活性物质(Pulmonary surfactant, PS)维持肺泡稳定性、防止肺泡萎陷、保持肺的顺应性,能够将肺泡上皮顶端膜面的钠、水转运至肺间质,并参加了肺对各种吸入有害物质及微生物的天然免疫等。AECⅡ仅占肺部细胞的15%,对肺组织或肺混合细胞的培养难以明确AECⅡ的具体功能。目前尚无具有全部AECⅡ功能的细胞系,AECⅡ的原代培养成为解决这一问题的重要手段。以往研究大多是对成年大鼠、小鼠和兔AECⅡ的分离培养研究,也有少量新生动物细胞分离培养报道,但细胞产量均较低,此外由于小动物生长发育周期及生理病理过程短,生理及解剖特点也不利于长期动物实验研究,对于人新生儿至婴幼儿期的生理和病理生理学研究适用性有限。本研究的目的是建立新生猪AECⅡ分离、纯化及鉴定方法,为AECⅡ的生物学特性研究及与AECⅡ有关的在体动物实验研究奠定基础。目的1、建立新生猪AECⅡ的分离、纯化及鉴定方法;2、观察AECⅡ的体外生长变化特点,明确其体外实验的最佳时间。方法1、取体重1000-1300 g足月新生猪肺,经气道灌入0.1%胰酶及不同浓度弹力蛋白酶与0.1%胰酶的混合酶溶液(40 u／ml elatase／0.1% trypsin、30 u／mlelatase/0.1% trypsin、20 u/ml elatase/0.1% trypsin) 37℃、20 min水浴消化,收集细胞、计数细胞产量及活力;2、采用percoll非连续密度梯度离心及免疫粘附法纯化(即panning法)细胞,计数细胞产量及活力;3、采用透射电镜法、碱性磷酸酯酶染色法鉴定AECⅡ;4、将细胞以4x105 cells／cm2接种于组织培养板,用DMEM低糖培养基(含10%胎牛血清、100 u／ml青霉素、0.1 g／ml链霉素)进行培养,每24 h换液,观察细胞生长变化情况。5、在相同的消化条件下：0.1%胰酶、37℃、20 min水浴消化条件下,对比研究免疫粘附法、percoll非连续密度梯度离心法纯化细胞后所获得大鼠、新生猪AECⅡ的产量、活力及纯度的差别。结果1、新生猪肺组织细胞的消化分离：30 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化肺组织后细胞产量(5.35±0.54)x106,而20 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化细胞产量为(3.16±0.94)x106,40 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化细胞产量为(3.09±0.86)x106,0.1%胰酶消化细胞产量为(2.76±0.65)x10+,30 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化细胞产量显著高于其他3组(P细胞产量为(37.97±27.98)x106,percoll非连续密度梯度离心法纯化细胞的产量(11.07±10.59)x106,前者明显高于后者;3、新生猪肺AECⅡ的培养：原代培养24 h,AECⅡ开始贴壁,细胞呈圆形、多角形,呈岛状分布。培养至48 h,细胞形态一致,为多角形。第3-4天细胞平展,连接成细胞单层,胞浆内有大量反差明显的小颗粒,细胞核明显。第5-7天,细胞内颗粒逐渐减少,胞浆空泡,细胞体积增大,边缘模糊。AECⅡ在原代培养24-96 h处于最佳状态,此阶段适合作体外实验研究。4、在相同消化、分离及纯化方法条件下,新生猪肺AECⅡ的纯化产量明显高于大鼠AECⅡ纯化产量。大鼠AECⅡ的percoll法纯化细胞产量显著高于免疫黏附法。新生猪AECⅡ的纯化,免疫粘附法产量则明显高于percoll法。纯化后大鼠AECⅡ的阳性率近90%,而新生猪AECⅡ的阳性率仅为70%左右。结论1、新生猪AECⅡ消化分离的最佳消化条件是：30 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶联合使用,37℃、20 min消化;免疫粘附法纯化新生猪AECⅡ优于percoll法;AKP染色法是简单、实用的AECⅡ鉴定方法,细胞染色阳性率与电镜鉴定结果一致,可用于新生猪AECⅡ的鉴定。2、AECⅡ体外研究的最佳时间为原代培养的第24-96 h。3、在消化条件及纯化方法相同的情况下,新生猪肺AECⅡ的纯化产量明显高于大鼠AECⅡ纯化产量,AECⅡ纯度可达70%左右,可用于进一步的体外实验研究。研究背景内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPC)是循环中骨髓来源的祖细胞之一，能分化为成熟血

关键词：肺泡上皮细胞细胞分离培养细胞鉴定内皮祖细胞密度梯度离心法贴壁选择法细胞培养

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胚胎干细胞分离培养的影响因素

解剖科学进展 1995年第3期1卷 202-208页

作者：赖良学郑瑞珍孙方臻秦鹏春解放军农牧大学中国科学院发育生物研究所东北农业大学生物工程系

ＥＳ细胞体外生长的环境要求极为苛刻，原则上应满足两个条件：①促进细胞的分裂增殖；②抑制细胞的分化。前者受到基本培养基、添加剂、血清和生长因子的影响，后者则涉及到动物早期胚胎的胚龄和饲养层细胞种类的选择、条件培养基和生... 详细信息

ＥＳ细胞体外生长的环境要求极为苛刻，原则上应满足两个条件：①促进细胞的分裂增殖；②抑制细胞的分化。前者受到基本培养基、添加剂、血清和生长因子的影响，后者则涉及到动物早期胚胎的胚龄和饲养层细胞种类的选择、条件培养基和生长因子的运用以及其它类型细胞（如滋胚层细胞）的影响。不同动物胚胎在体内发育有不同特点，对体外生长的环境要求不同，针对不同动物，应采取相应的策略，才能建立起真正的ＥＳ细胞。

关键词：细胞分离培养细胞体外生长生长因子不同动物条件培养基抑制细胞细胞种类早期胚胎体内发育 ES细胞添加剂饲养层环境

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一种改良人骨髓间充质干细胞分离培养的方法

中国组织工程研究 2012年第45期16卷 8394-8397页

作者：刘继春胡红涛许国华蒋玉权徐宁叶晓健解放军第184医院骨科江西省鹰潭市335000 解放军第二军医大学附属长征医院骨科上海市200003

背景:分离培养鼠、兔骨髓间充质干细胞的科研实践较多,而组织工程临床实践大多以同种属种子细胞的科研为基础。目的:建立一种稳定、高效,满足临床和实验室需要的人骨髓间充质干细胞分离培养方法。方法:使用骨穿针于人髂前上棘处抽取骨... 详细信息

背景:分离培养鼠、兔骨髓间充质干细胞的科研实践较多,而组织工程临床实践大多以同种属种子细胞的科研为基础。目的:建立一种稳定、高效,满足临床和实验室需要的人骨髓间充质干细胞分离培养方法。方法:使用骨穿针于人髂前上棘处抽取骨髓和松质骨,用15mL培养体系冲洗松质骨并收集冲洗液,采用直接培养法,利用细胞贴壁性能初筛细胞;流式细胞仪检测细胞表面抗原(CD29、CD34、CD44、CD45、CD105),分别进行成骨、成脂肪诱导分化,在诱导过程中进行细胞形态学观察对干细胞进行初步鉴定。结果与结论:松质骨冲洗液直接培养法在培养第5天的时候出现细胞集落,细胞稳定表达CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45。成骨诱导20d后出现明显钙结节,茜素红染色呈红色结节。成脂诱导7d后脂滴明显形成,油红素O染色见大量脂质沉淀。结果可见采用松质骨冲洗液直接培养法可以从人松质骨中短时间内获得大量间充质干细胞,其具有良好的细胞形态,稳定表达的细胞抗原及成骨、成脂分化能力。

关键词：骨髓间充质干细胞细胞分离培养直接培养法改良分离培养方法细胞表面抗原成骨诱导科研实践

兔脂肪来源干细胞分离培养及向血管内皮细胞分化能力的研究

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兔脂肪来源干细胞分离培养及向血管内皮细胞分化能力的研究

人脂肪间充质干细胞分离培养及其生物学特性的实验研究

2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班

作者：刘琳张亚周云翟景梅曹戌苏州大学附属儿童医院苏州大学儿科医学研究所

目的研究兔脂肪来源干细胞体外分离培养及诱导分化为血管内皮细胞的生物学特性。方法选取清洁级新西兰大耳壮年白兔附睾处脂肪组织,采用胶原酶消化法和贴壁筛选法分离获得脂肪来源干细胞,体外传代培养扩增至第三代后加入血管内皮细胞生... 详细信息

目的研究兔脂肪来源干细胞体外分离培养及诱导分化为血管内皮细胞的生物学特性。方法选取清洁级新西兰大耳壮年白兔附睾处脂肪组织,采用胶原酶消化法和贴壁筛选法分离获得脂肪来源干细胞,体外传代培养扩增至第三代后加入血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合定向诱导兔脂肪来源干细胞分化,对兔脂肪来源干细胞和诱导后细胞进行普通光学显微镜镜和透射电镜下细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,免疫组织化学、免疫荧光及流式细胞仪检测其细胞表型。结果兔脂肪

关键词：细胞分离培养分化能力内皮细胞生长因子

来源： cnki会议评论

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国际医药卫生导报 2010年第19期16卷 2315-2319页

作者：匡世军郑有华张志光中山大学光华口腔医学院附属口腔医院口腔颌面外科广州510055

目的探索人脂肪间充质干细胞（adipose tissue—derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）分离培养的方法及体外扩增的条件，观察ADMSCs的生物学特性。方法以腹部手术患者皮下脂肪组织为材料，采用I型胶原酶消化法及贴壁法分离培养ADM... 详细信息

目的探索人脂肪间充质干细胞（adipose tissue—derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）分离培养的方法及体外扩增的条件，观察ADMSCs的生物学特性。方法以腹部手术患者皮下脂肪组织为材料，采用I型胶原酶消化法及贴壁法分离培养ADMSCs，在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中贴壁培养，倒置显微镜观察，流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106的表达，透射电镜及扫描电镜下观察ADMSCs超微结构，流式细胞仪测定细胞周期。结果原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。CD29、CD44、CD105均呈阳性表达，阳性率分别为95.3％、98．6％和86．5％；而CD31、CD34、CD106阳性率分别为3．5％、2．6％、1．3％。透射电镜观察显示ADMSCs表现出早期幼稚细胞形态的特点，流式细胞仪检测显示84．8％的细胞处于G0/G1期。结论酶消化法能有效地从人脂肪组织分离培养人ADSCs，细胞生长稳定，增殖能力活跃，为今后ADMSCs的分离培养提供了更简单有效的方法。

关键词：脂肪间充质干细胞细胞分离培养干细胞

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脐带间充质干细胞分离培养及诱导分化研究

中华实验外科杂志 2014年第5期31卷 1154-1154页

作者：汤佳城蔡秀军梁霄王一帆刘敬华刘小龙浙江省腔镜技术研究重点实验室浙江大学医学院附属邵逸夫医院杭州310016

脐带中富含的间充质干细胞具有多向分化潜能。本研究旨在比较不同分离方法对脐带间充质干细胞（UCMSC）形态学影响，探讨其向成骨、成脂及肝样细胞分化的能力。

关键词：脐带间充质干细胞细胞分离培养诱导分化多向分化潜能细胞分化形态学

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脐带间充质干细胞分离培养及其定向分化研究

中华实验外科杂志 2012年第8期29卷 1630-1630页

作者：卢兆桐李福泉王玉波济南军区总医院心胸外科 250031

间充质干细胞（MSC）能够自我增殖，多向分化，且具有免疫调节等功能，在人类白细胞抗原（HLA）并不匹配的情况下输注同种异体MSC，一般不会引起宿主的免疫反应，使MSC作为临床治疗的一种手段成为可能。脐带中获取MSC，来源广泛，取材... 详细信息

间充质干细胞（MSC）能够自我增殖，多向分化，且具有免疫调节等功能，在人类白细胞抗原（HLA）并不匹配的情况下输注同种异体MSC，一般不会引起宿主的免疫反应，使MSC作为临床治疗的一种手段成为可能。脐带中获取MSC，来源广泛，取材方便，且征得家属同意，不涉及伦理问题。本研究旨在建立脐带MSC的富集方法，观察其生物学特性，为临床MSC的大量应用提供基础。

关键词：间充质干细胞细胞分离培养定向分化脐带人类白细胞抗原临床治疗生物学特性多向分化

成人牙周韧带干细胞分离培养及其定向分化的实验研究

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中华口腔医学杂志 2005年第5期40卷 382-382页

作者：张玉峰程祥荣杨雪超蓝菁武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室 430079

干细胞(stem cell)是指具有高度增殖和自我更新能力,及多向分化潜能的细胞.在机体发育过程中,可存在处于不同分化等级的干细胞.我们对牙周韧带干细胞进行分离、培养,并进行脂肪化及矿化诱导,为进一步研究提供实验依据。

关键词：细胞分离培养定向分化牙周韧带实验研成人自我更新能力多向分化潜能干细胞发育过程