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番茄镉响应组蛋白去甲基化酶基因SlJMJ2和SlJMJ12的功能验证

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番茄镉响应组蛋白去甲基化酶基因SlJMJ2和SlJMJ12的功能验证

作者：张润铭哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

镉(Cadmium,Cd)是一种重金属,是植物在生长发育过程中的非必要的元素,土壤中镉积累过多会影响植物的生长发育甚至通过植物来危害人体的生命健康。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄属的蔬菜作物,具有较高的营养价值和经济... 详细信息

镉(Cadmium,Cd)是一种重金属,是植物在生长发育过程中的非必要的元素,土壤中镉积累过多会影响植物的生长发育甚至通过植物来危害人体的生命健康。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄属的蔬菜作物,具有较高的营养价值和经济价值。然而,近年来由于肥料和农药的过量施用,导致栽培地土壤重金属的残留等问题日益突出,不仅会影响植物的生长发育还会影响人体生命健康。组蛋白去甲基化酶(JHDM)是一类只含有Jmj C结构域的蛋白家族,但目前对于组蛋白去甲基化酶基因对于盐碱胁迫响应的研究较多,对于重金属胁迫的研究较少。因此对组蛋白去甲基化酶对于番茄抵抗Cd胁迫的作用研究有重要意义。本试验结果表明:(1)克隆获得SlJMJ2和SlJMJ12基因的全长CDS,通过生物信息学分析表明,SlJMJ2全长2766 bp,编码921个氨基酸;分析蛋白质二级结构得知其中包含α-螺旋、β-转角、延伸链以及无规则卷曲,并且无规则卷曲较多并且为不稳定的疏水蛋白。SlJMJ12全长1041 bp,编码346个氨基酸,其蛋白质二级结构中无规则卷曲较多且为稳定的疏水性蛋白。(2)荧光定量PCR结果显示,SlJMJ2和SlJMJ12基因在番茄的不同组织中均有不同程度的表达其中。SlJMJ2在番茄老根中表达量最高,在主根中表达量最低,而SlJMJ12与SlJMJ2不同,在幼叶中的表达量最高,在花中的表达量最低。(3)对Cd(镉)、Hg(汞)、Cu(铜)、Pb(铅)胁迫下SlJMJ2和SlJMJ12在番茄根和叶中的表达量进行了分析,其中SlJMJ2在Hg及Cu胁迫在叶中表达量呈现下调的趋势,Cd、Pb胁迫下表达量上调,Hg以及Pb胁迫下在根中呈现上调趋势。其中SlJMJ12在Cd、Hg、Cu、Pb胁迫下在根和叶中的表达量均上调。(4)成功构建了SlJMJ2和SlJMJ12植物过表达载体,对转基因拟南芥及野生型拟南芥进行Cd胁迫后发现过表达拟南芥萌发率和根长高于野生型,突变体植株根长及萌发低于野生型且差异显著。对SlJMJ2和SlJMJ12转基因拟南芥及野生型拟南芥进行氮蓝四唑(NBT)染色,突变体拟南芥染色最深而过表达拟南芥受氧化损伤的程度最高。镉胁迫后过表达拟南芥的SOD、POD、CAT活性增加,MDA含量降低,叶绿素含量较高。(5)本文探究了金属转运蛋白相关基因(IRT1、ZIP1、ABCC、NARPM4)以及激素相关基因,其中包括SL(D14、BRC1、CCD7)、EBR(BIN2、BES1、BAK1)以及ABA(ABI2、ABI5、ABF2)。结果发现金属转运蛋白相关基因及激素相关基因在SlJMJ2和SlJMJ12过表达拟南芥中升高并且高于野生型,并且相关基因在突变体中的表达量低于野生型。

关键词：组蛋白去甲基化酶镉胁迫番茄 SlJMJ2 SlJMJ12

秀丽隐杆线虫的组蛋白去甲基化酶同源物参与DNA损伤反应

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秀丽隐杆线虫的组蛋白去甲基化酶同源物参与DNA损伤反应

作者：张晓娟天津大学

学位级别：硕士

组蛋白去甲基化酶与人的许多癌症有关,但尚未阐明它们对肿瘤发生的作用机制。最近很多实验室的研究支持组蛋白去甲基化酶在DNA损伤反应中的作用。例如,在秀丽隐杆线虫中,人类组蛋白去甲基化酶LSD1的同源蛋白SPR-5在DNA双链断裂修复中的... 详细信息

组蛋白去甲基化酶与人的许多癌症有关,但尚未阐明它们对肿瘤发生的作用机制。最近很多实验室的研究支持组蛋白去甲基化酶在DNA损伤反应中的作用。例如,在秀丽隐杆线虫中,人类组蛋白去甲基化酶LSD1的同源蛋白SPR-5在DNA双链断裂修复中的作用已被广泛研究。另外,我们实验室的一项研究也表明,范可尼贫血通路与SPR-5共同调控H3K4me2的水平。秀丽隐杆线虫具有三种哺乳动物LSD1/2的同源蛋白,包括SPR-5、LSD-1和AMX-1,到目前为止组蛋白去甲基化酶AMX-1和LSD-1尚未得到很好研究。本课题我们研究了组蛋白去甲基化酶AMX-1和LSD-1在DNA损伤修复和检查点中的功能。我们发现AMX-1在胚胎细胞、肠细胞和鞘细胞中表达,缺乏AMX-1的表达可激活DNA损伤检查点。此外,AMX-1对于链间交联损伤的敏感性是必须的,AMX-1可以调控H3K4me2甲基化的水平。对于另一个同源蛋白LSD-1,我们发现lsd-1突变体种系中高水平的细胞凋亡依赖于介导DNA损伤的CEP-1/p53,另外LSD-1对于维持正常生育能力非必不可少。我们的研究首次证明了两种新型组蛋白去甲基化酶与DNA损伤修复和检查点之间的联系,我们相信研究的结果数据有助于阐明组蛋白去甲基化酶在肿瘤发生中的作用。

关键词：组蛋白去甲基化酶秀丽隐杆线虫 DNA损伤反应

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组蛋白去甲基化酶在发育和再生医学的研究

现代生物医学进展 2016年第4期16卷 789-792页

作者：陈素珠李汉梁王冰梅福建师范大学福建福州350108

表观遗传学调控在器官发育以及再生医学中是重要的研究内容,而组蛋白的甲基化修饰属于表观遗传学调控机制之一并且成为近年来研究的热点内容。处于不同甲基化状态下的组蛋白,能影响多种分子对其的识别和结合,在转录起始、转录效率和转... 详细信息

表观遗传学调控在器官发育以及再生医学中是重要的研究内容,而组蛋白的甲基化修饰属于表观遗传学调控机制之一并且成为近年来研究的热点内容。处于不同甲基化状态下的组蛋白,能影响多种分子对其的识别和结合,在转录起始、转录效率和转录后加工等多个层面调控相关基因的表达。而哺乳动物的器官发育与细胞重编程都与基因选择性表达密切相关,因此组蛋白甲基化状态在基因选择性表达中扮演着重要角色。本文概述了组蛋白去甲基化酶的分类以及组蛋白不同甲基化状态下对于基因的表达的调控,同时总结了组蛋白去甲基化酶在维持胚胎干细胞的多分化潜能和IPS细胞重编程效率方面的作用以及组蛋白去甲基化酶基因的缺失与相关器官发育的影响。最后探讨了组蛋白甲基化修饰酶在推动发育生物学与再生医学研究进展方面的潜能。

关键词：表观遗传组蛋白去甲基化酶发育再生

维生素C促进根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶KDM2B和KDM5C表达的研究

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口腔医学研究 2015年第5期31卷 466-469,474页

作者：王月君刘大勇范志朋贾智天津医科大学口腔医院牙体牙髓科天津300070 首都医科大学附属北京口腔医院

目的:研究维生素C是否具有调节根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶相关基因表达的功能。方法:利用不同剂量的维生素C刺激人根尖牙乳头间充质干细胞;采用qRT-PCR(real time reverse transcriptionpolymerase chain reaction,实时定... 详细信息

目的:研究维生素C是否具有调节根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶相关基因表达的功能。方法:利用不同剂量的维生素C刺激人根尖牙乳头间充质干细胞;采用qRT-PCR(real time reverse transcriptionpolymerase chain reaction,实时定量RT-PCR)在mRNA水平检测组蛋白去甲基化酶相关基因的表达。结果:qRT-PCR结果显示组蛋白去甲基化酶KDM2B(Lysine(K)-specific demethylase 2B)和KDM5C(Lysine(K)-specific demethylase 5C)在10μmol/L维生素C刺激后2、4和8h表达明显升高,其表达升高程度与维生素C的作用具有时依赖性;qRT-PCR结果显示与未刺激组相比,5、10和20μmol/L维生素C在作用8h后都能促进KDM2B和KDM5C的表达,其表达升高程度与维生素C的作用具有剂量依赖性的关系。结论:在根尖牙乳头间充质干细胞中维生素C可以促进组蛋白去甲基化酶KDM2B和KDM5C的表达。

关键词：维生素C 组蛋白去甲基化酶根尖牙乳头间充质干细胞 KDM2B KDM5C

脂多糖促进牙周膜间充质干细胞组蛋白去甲基化酶HR表达的研究

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口腔医学研究 2018年第6期34卷 648-652页

作者：张琛姚睿范志朋天津医科大学天津300070 天津市口腔医院儿童口腔科天津300041 首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所全牙再生及口腔组织功能重建北京市重点实验室北京100050

目的:脂多糖是否对牙周膜间充质干细胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs)中组蛋白去甲基化酶相关基因表达存在调控功能。方法:利用不同剂量的脂多糖对牙周膜干细胞进行刺激处理;在mRNA水平利用实时定量RT-PCR(real time reverse ... 详细信息

目的:脂多糖是否对牙周膜间充质干细胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs)中组蛋白去甲基化酶相关基因表达存在调控功能。方法:利用不同剂量的脂多糖对牙周膜干细胞进行刺激处理;在mRNA水平利用实时定量RT-PCR(real time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测组蛋白去甲基化酶相关基因的表达。qRT-PCR结果显示HR(hairless homolog)基因在脂多糖刺激后24h和48h结果显示,能促进HR的表达,其表达升高的水平与脂多糖刺激时间有相关性。1、5和10mg/L脂多糖在作用48h后都能促进HR的表达,其表达升高的水平与脂多糖刺激剂量有相关性。10μg/mL脂多糖抑制牙周膜干细胞体外矿化能力。结论:在牙周膜干细胞中脂多糖对牙周膜干细胞组蛋白去甲基化酶HR的表达有促进作用。

关键词：脂多糖组蛋白去甲基化酶牙周膜干细胞 Hairless 骨向分化

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

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北京口腔医学 2013年第5期21卷 241-244页

作者：付晓茹杜娟范志朋首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所全牙再生及口腔组织功能重建北京市重点实验室北京100050 北京市丰台区铁营医院

目的研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响。方法成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化。逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究。碱性磷酸酶活性... 详细信息

目的研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响。方法成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化。逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究。碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力。实时定量RTPCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达。过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。结论组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能。

关键词：组蛋白去甲基化酶牙髓干细胞成骨成牙本质分化 FBXL11

月季组蛋白去甲基化酶RcJMJ12和RcJMJ36在花器官发育中的功能解析

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月季组蛋白去甲基化酶RcJMJ12和RcJMJ36在花器官发育中的功能解析

作者：李蓉云南大学

学位级别：硕士

‘绿萼’是中国古老月季最重要的种质资源之一,具有特异的花器官表型,表现为花瓣、雄蕊、雌蕊萼片状,而其恢复材料的花器官表型在适温及高温之间会发生转变,是研究月季花发育机制的极好材料。本研究以‘绿萼’及其恢复材料为试验材料,... 详细信息

‘绿萼’是中国古老月季最重要的种质资源之一,具有特异的花器官表型,表现为花瓣、雄蕊、雌蕊萼片状,而其恢复材料的花器官表型在适温及高温之间会发生转变,是研究月季花发育机制的极好材料。本研究以‘绿萼’及其恢复材料为试验材料,以花器官发育正常的‘月月粉’作为对照,通过花粉培养和自交试验,对其花器官表型和育性进行鉴定;通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)测序方法,对H3K27me3组蛋白(组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰)在高温时的‘绿萼’及其恢复材料花器官中的相关调控基因进行分析;利用RT-q PCR技术对组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12、Rc JMJ36基因及高温响应因子HSFA2在高温处理不同时间及不同组织部位的‘绿萼’及其恢复材料中的表达进行分析;进一步构建病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体并侵染‘月月粉’,对沉默植株进行表型鉴定及RT-q PCR分析,初步探索组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36基因在月季花器官发育中的功能。主要研究结果如下:1.采用花粉液体培养及自花授粉的方法,分析了‘绿萼’恢复材料的花器官表型和花粉育性。结果表明,‘绿萼’恢复材料在适温下(20-25℃)表型与‘月月粉’基本一致,花瓣、雌蕊及雄蕊发育正常;其花粉萌发率和结果率分别为23.99%和35.00%,育性基本恢复。2.利用染色质免疫共沉淀技术,以H3K27me3为目的蛋白,进行了Ch IP测序。结果表明,样本数据的比对效率和unique read比例均达到85.00%左右,在‘绿萼’中富集到的Peaks数量高于其恢复材料,但二者Peaks长度差异不大;富集到的Peaks主要分布于基因间区,且Peaks相关基因主要位于启动子转录起始位点的下游;H3K27me3组蛋白修饰过程基因参与的功能在‘绿萼’及其恢复材料中不完全相同,‘绿萼’恢复材料中被H3K27me3修饰的基因参与生物过程和细胞组分的更多,参与分子功能的较少;在‘绿萼’及其恢复材料中共有8条相同的KEGG信号通路;在Peaks可能的motif中高温响应因子HSFA2的富集明显且有较高相关性。3.利用荧光定量PCR技术,首先对不同高温处理时长的‘绿萼’及其恢复材料中Rc JMJ12、Rc JMJ36和HSFA2基因的表达进行分析,结果表明:‘绿萼’及其恢复材料在经过高温(30℃)处理后,其嫩芽中的Rc JMJ12、Rc JMJ36和HSFA2表达水平均呈下降趋势。然后,以‘绿萼’为对照,分析了Rc JMJ12、Rc JMJ36及HSFA2三个基因在适温(20℃)和高温(30℃)下的‘绿萼’恢复材料中的表达情况。结果表明:三个基因在高温处理下‘绿萼’恢复材料花器官中的表达水平与‘绿萼’基本一致。4.分别构建组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36的VIGS载体,用‘月月粉’进行侵染,通过嫁接得到沉默植株后进行荧光定量PCR检测和表型鉴定。结果表明,30个嫁接芽共有17个成活,成活率约为56.67%;获得由p TVR2-Rc JMJ12和p TVR2-Rc JMJ36沉默植株共8株,侵染效率为47.10%;在沉默植株中组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36的基因表达水平显著下降,且与对照植株相比,沉默植株的花瓣、雌蕊及雄蕊数量增多。研究结果不仅为揭示月季组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36基因在‘绿萼’花器官发育中的功能提供理论依据,而且为月季花器官萼片化发育的分子机制提供新思路,同时也为独特花型的月季新品种选育奠定了基础。

关键词：月季‘绿萼’ 组蛋白去甲基化酶花器官发育荧光定量PCR VIGS技术

MRL/1pr狼疮鼠CD4+T细胞组蛋白去甲基化酶谱的研究

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MRL/1pr狼疮鼠CD4+T细胞组蛋白去甲基化酶谱的研究

作者：黄葳中南大学

学位级别：硕士

研究MRL／lpr狼疮鼠CD4+T细胞中组蛋白去甲基化酶表达水平。SPF级18周龄MRL/lpr狼疮鼠10只,另10只野生型MRL/MPJ小鼠为正常对照组,采用Realtime RT-PCR法检测CD4+T细胞中已知共13种组蛋白去甲基化酶LSD1, JMJD3, UTX, JMJD2A, JMJD2B, J... 详细信息

研究MRL／lpr狼疮鼠CD4+T细胞中组蛋白去甲基化酶表达水平。SPF级18周龄MRL/lpr狼疮鼠10只,另10只野生型MRL/MPJ小鼠为正常对照组,采用Realtime RT-PCR法检测CD4+T细胞中已知共13种组蛋白去甲基化酶LSD1, JMJD3, UTX, JMJD2A, JMJD2B, JMJD2C, JMJD2D, JARID1A, JARID1B, JARID1C, JARID1D, JHDM1和JHDM2A的mRNA表达水平。Western blot检测JMJD3, JHDM1, JHDM2A, JMJD2B蛋白表达水平。与野生型MRL/MPJ小鼠相比,MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞JMJD2A, JMJD2B, JMJD2D, JARID1C, JARID1D, JHDM1的mRNA显著降低(P=0.026,P=0.006,P=0.003,P=0.002,P=0.019,P=0.028),JMJD3和JHDM2A的mRNA显著增高(P=0.049,P=0.049),而JMJD2C, JARID1A, JARID1B, UTX及LSD1的表达水平无明显变化(P>0.05)。此外,MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞中JMJD3和JHDM2A的蛋白表达水平与野生型MRL/MPJ小鼠相比升高(其中JMJD3的表达差异具有显著性P=0.036,JHDM2A的表达有差异但是没有显著性P=0.161),而JMJD2B, JHDM1蛋白表达水平显著降低(P=0.050,P=0.041)。狼疮鼠模型CD4+T细胞组蛋白去甲基化酶表达异常。

关键词：系统性红斑狼疮 MRL/lpr小鼠组蛋白去甲基化酶 CD4+ T细胞

水稻组蛋白去甲基化酶JMJ703与染色质变构因子CHR729的相互作用及功能研究

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水稻组蛋白去甲基化酶JMJ703与染色质变构因子CHR729的相互作用及...

作者：叶怡然华中农业大学

学位级别：硕士

在真核生物中,染色质包含了绝大部分的遗传物质。它是由DNA缠绕着组蛋白八聚体形成的核小体串联而成。基因的表达调控是一个极其复杂的过程,需要多种表观修饰因子的参与。而这些表观修饰就是发生在染色质上的DNA和组蛋白的共价修饰。组... 详细信息

在真核生物中,染色质包含了绝大部分的遗传物质。它是由DNA缠绕着组蛋白八聚体形成的核小体串联而成。基因的表达调控是一个极其复杂的过程,需要多种表观修饰因子的参与。而这些表观修饰就是发生在染色质上的DNA和组蛋白的共价修饰。组蛋白甲基化是一种重要的表观修饰,其中H3K4me3作为基因激活的标志在植物的生长发育和环境胁迫过程中起到重要的作用。染色质变构因子可以保证染色质结构的灵活性,可以在特定条件下发生空间上的改变,从而影响基因的表达和调控。此外,染色质变构因子可以结合组蛋白修饰,并影响全基因组的组蛋白修饰水平。因此,染色质变构因子与表观修饰因子之间的关系在调控基因的表达并维持生物体的正常生命活动中起到了至关重要的作用。水稻是中国最主要的粮食作物,也是经典的单子叶模式植物,目前对水稻中的染色质变构因子的功能以及与其他组蛋白修饰因子之间的相互作用机制还不是十分得清楚。本研究以一个水稻染色质变构因子CHR729为对象,探讨了CHR729在调节基因表达中的功能以及调控染色质结构中的功能。此外,本研究还筛选到了与CHR729互作的甲基化酶JMJ703,探寻了JMJ703在调控可诱导基因表达中的功能以及其与CHR729之间的关系。主要研究结果如下:1.构建了chr729互补材料,发现chr729突变体互补植株的株高、叶片颜色的表型都得到了恢复。说明我们以前观察到的chr729突变体的表型与CHR729的缺失直接相关。***729调控着一系列的转录因子。在chr729突变体、chr729互补材料及野生型材料中,发现CHR729可以调控AP2、MADS-box、NAC、C3HC4、WRKY等参与胁迫反应的转录因子的表达发生了改变,这可能说明CHR729参与水稻生物胁迫和非生物胁迫过程。3.利用微球菌核酸酶实验发现在chr729突变体中受CHR729调控的基因的核小体密度较野生型紧密。说明CHR729通过调节核小体密度来完成对基因的调控表达。***703和CHR729基因都是组成型表达的基因,这说明它们存在时间和空间上相互作用的可能性。酵母双杂交结果表明CHR729和JMJ703在酵母体内相互作用,通过分段截短的方法进一步发现JMJ703蛋白1-139aa的肽段可以与CHR729蛋白的ATP酶结构域中791-1046aa结合。体外Pull down实验也验证了两者的相互作用。5.利用茉莉酸甲酯(me-JA)处理野生型和JMJ703超表达材料和JMJ703-GR的材料均发现对JA诱导敏感的P450和TPS的表达明显地受到了抑制,而JA诱导野生型和CHR729超表达材料结果显示P450和TPS的表达并没有明显变化,这可能由于它们并不是CHR729直接调控的下游基因。***703chr729双突变体的材料表型显示出偏向chr729突变体的表型,并且更为严重,且细胞色素氧化酶(CKX)基因的上升表达可能是引起发育更加异常的原因之一。

关键词：组蛋白去甲基化酶染色质变构因子表观调控水稻