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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 169-176页

作者：谭涅焦世铭丁艳朱成宇徐文岳陆军军医大学基础医学院病原生物学教研室重庆400038 重庆大学医学院重庆400044

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测... 详细信息

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况。将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17~19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40 nnmol/L,每孔500μl)的组别。经4%多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色IFKineTM荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况。取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BL/6小鼠,为CVF组;并设置C3-/-组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BL/6小鼠)。取10000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示。以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)10只、C3aR^(-/-)小鼠10只;1000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR^(-/-)小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)6只和C5aR^(-/-)小鼠6只,感染后3 d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止。采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析。正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验。结果PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81细胞株内扩增出C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和C5aR(374 bp)基因。Western blotting检测结果发现,两种细胞均有C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达。激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR^(-/-)小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR^(-/-)小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre^(+/+)C5aR^(flox/flox)小鼠和C5aR^(-/-)小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

关键词：疟原虫红外期肝细胞局部补体

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肝细胞内补体活化对疟原虫红外期发育影响的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年

作者：谭涅焦世铭丁艳朱成宇徐文岳陆军军医大学基础医学院病原生物学教研室重庆大学医学院

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法首先采用反转录PCR扩增和蛋白质免疫印迹分析观察C57BL/6小鼠来源的Hepa1-6细胞和人肝癌细胞来源的HepG2-CD81细胞内是否存在补体C3、C5,以及是否表达C3aR和C5aR。随后,将约氏... 详细信息

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法首先采用反转录PCR扩增和蛋白质免疫印迹分析观察C57BL/6小鼠来源的Hepa1-6细胞和人肝癌细胞来源的HepG2-CD81细胞内是否存在补体C3、C5,以及是否表达C3aR和C5aR。随后,将约氏疟原虫BY265-RFP子孢子与HepG2-CD81细胞孵育,在6、12或24 h后,利用激光共聚焦显微镜观察肝细胞局部补体C3、C5是否活化,以及纳虫空泡膜上是否表达C5aR。最后,观察活化的肝细胞局部补体及其受体在疟原虫红外期感染中的作用。先将小鼠分为对照组、眼镜蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)特异耗竭血清C3组和C3全基因敲除组,用伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA,***)子孢子攻击48 h后定量PCR查肝脏虫荷,观察系统性补体对疟原虫红外期感染的影响;尔后,用子孢子攻击C3aR全基因敲除小鼠和C5aR全基因敲除小鼠,制备血涂片查红内期出现时间,观察补体受体在疟原虫红外期感染中的作用;最后,再用约氏疟原虫BY265株(Plasmodium yoelii BY265,***265)子孢子攻击野生型小鼠(对照组)、C5aR全基因敲除小鼠和肝脏C5aR条件性敲除小鼠,查红内期出现时间,观察肝细胞局部补体受体在疟原虫红外期感染中的作用。结果 Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞内存在补体C3、C5及其受体C3aR、C5aR;子孢子感染能活化补体C3、C5,且活化的C3a、C5a、C5aR主要集中在纳虫空泡周围。***子孢子攻击后,野生型小鼠、CVF处理小鼠和C3全基因敲除小鼠的肝脏虫荷之间差异无统计学意义(P>0.05);C3aR全基因敲除小鼠和C5aR全基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);***265子孢子攻击后,对照组小鼠、C5aR全基因敲除小鼠和肝脏C5aR条件性敲除小鼠红内期出现时间差异无统计学意义(P> 0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

关键词：疟原虫红外期肝细胞局部补体

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瑞香素抗红外期疟原虫作用的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2001年第1期19卷 30-32页

作者：刘云光王琴美徐月琴倪齐珍倪奕昌中国预防医学科学院寄生虫病研究所世界卫生组织疟疾血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025

目的　研究瑞香素 (DPNT)抗红外期疟原虫的作用。方法　于ICR小鼠腹腔注射约氏疟原虫子孢子后 0 5h灌胃给药 ,连续 4d。不同剂量的DPNT及DPNT伍用伯氨喹 (PQ)的抗疟作用 ,分别以d7ICR小鼠阴性率及d1 1 或d1 2 ICR小鼠每千个红细胞被原... 详细信息

目的　研究瑞香素 (DPNT)抗红外期疟原虫的作用。方法　于ICR小鼠腹腔注射约氏疟原虫子孢子后 0 5h灌胃给药 ,连续 4d。不同剂量的DPNT及DPNT伍用伯氨喹 (PQ)的抗疟作用 ,分别以d7ICR小鼠阴性率及d1 1 或d1 2 ICR小鼠每千个红细胞被原虫感染数作评价 ,并观察DPNT对ICR小鼠血红蛋白浓度的影响。结果　DPNT的剂量范围为每天 10～ 10 0mg/kg ,连服 4d ,d7原虫阴性小鼠数及d1 1 红细胞被感染程度与对照组相比其差异均无显著性 ;DPNT每天 5 0mg/kg和每天PQ5mg/kg配伍组的d7小鼠阴性率与PQ每天 10mg/kg组相当。ICR小鼠DPNT每天 5 0mg/kg组与对照组血红蛋白浓度在d8天有差异。结论　DPNT单独用药 ,无明显抗红外期疟原虫作用 ,但DPNT每天 5 0mg/kg与PQ每天 5mg/kg伍用的抗疟效果与PQ每天 10mg/kg相当。DPNT在短期内可致小鼠贫血。

关键词：瑞香素约氏疟原虫子孢子红外期

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伯氏疟原虫红外期体外培养的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1991年第1期9卷 28-30页

作者：严汉英杨彬潘伟娜刘学丽南京药物研究所药理室

本文报告在国内首次建成了胚肺细胞-伯氏疟原虫红外期体外培养系统.用胰酶消化法自人工流产胎儿分离出胚肺细胞后,建立Elu 8801细胞株。斯氏按蚊叮咬伯氏疟原虫ANKA株感染的昆明小鼠18～21d后,在无菌条件下解剖出唾腺,制备子孢子悬液,... 详细信息

本文报告在国内首次建成了胚肺细胞-伯氏疟原虫红外期体外培养系统.用胰酶消化法自人工流产胎儿分离出胚肺细胞后,建立Elu 8801细胞株。斯氏按蚊叮咬伯氏疟原虫ANKA株感染的昆明小鼠18～21d后,在无菌条件下解剖出唾腺,制备子孢子悬液,接种于单层培养的胚肺细胞。培养48h后,可见红外期裂殖体。72h后,部分裂殖体内已形成成熟的裂殖子,将培养上清经腹腔接种健康小鼠,可使之感染疟疾并可经血传感染其它小鼠。用第2代感染小鼠血饲喂按蚊,蚊体内可产生子孢子。表明本室建立的人胚肺细胞林对***株易感染,并能支持其红外期发育成熟,产生有感染力的红外期裂殖子。

关键词：伯氏疟原虫红外期体外培养

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约氏疟原虫红外期体外培养及影响因素的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1997年第6期15卷 340-340页

作者：陈孙孝黄复生王兴相况明书曹晓东第三军医大学寄生虫学教研室重庆630038

目的 :Wistar大鼠原代肝细胞 -约氏疟原虫红外期体外培养及若干因素的初步探讨。方法 :体外培养。结果 :用 15%小牛血清培养基培养原代肝细胞 ,培养密度为 2万 /孔 ,孔径为 16mm,接种约氏疟原虫子孢子后培养 4 8h,获得红外期疟原虫 ( EE... 详细信息

目的 :Wistar大鼠原代肝细胞 -约氏疟原虫红外期体外培养及若干因素的初步探讨。方法 :体外培养。结果 :用 15%小牛血清培养基培养原代肝细胞 ,培养密度为 2万 /孔 ,孔径为 16mm,接种约氏疟原虫子孢子后培养 4 8h,获得红外期疟原虫 ( EEF) ,其肝细胞感染率达 0 .0 35%±0 .0 13% ;接近成熟的 EEF直径达 4 0 .3× 31.6μm,有 10 0多个核 ,其 EEF可达 4 - 10个 / cm2 。经0 .0 1%乙二胺四乙酸 ( EDTA)洗脱肝细胞 ,离心 ,腹腔接种小鼠 ,第 7d血检原虫阳性。肝细胞密度为 0 .4万 /孔、 4万 /孔组及 10 %小牛血清组均未见 EEF。结论 :用含 15%小牛血清培养基、培养密度为 2万 /孔的 Wistar大鼠原代肝细胞较适合约氏疟原虫红外期的发育。

关键词：约氏疟原虫红外期体外培养

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IL-6对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响

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中国人兽共患病杂志 1999年第4期15卷 68-70页

作者：郝宏兴黄复生况明书段建华第三军医大学寄生虫学教研室

目的观察ＩＬ－６对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响。方法子孢子（Ｓｐ）接种前２ｈ给Ｗｉｓｔａｒ大鼠腹腔注射１００００ＵｒＨｕＩＬ－６，４２ｈ后活杀、常规制肝切片，观察Ｓｐ发育率，外期原虫（ＥＥＦ）直径。大鼠在接种Ｓ... 详细信息

目的观察ＩＬ－６对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响。方法子孢子（Ｓｐ）接种前２ｈ给Ｗｉｓｔａｒ大鼠腹腔注射１００００ＵｒＨｕＩＬ－６，４２ｈ后活杀、常规制肝切片，观察Ｓｐ发育率，外期原虫（ＥＥＦ）直径。大鼠在接种Ｓｐ前３ｈ、０．５ｈ分别经尾静脉注射１００００Ｕ、３００００ＵｒＨｕＩＬ－６，经肠系膜静脉灌注２８万Ｓｐ，１ｈ后制备肝脏样品，用电镜观察结果。结果与对照组比较，１００００ＵｒＨｕＩＬ－６对约氏疟原虫Ｓｐ发育率没有显著影响，但ＥＥＦ直径明显变小。Ｓｐ接种１ｈ后肝细胞内可见形态退变的Ｓｐ。结论ＩＬ－６作为一种免疫效应分子可抑制大鼠体内约氏疟原虫ＥＥＦ的发育。

关键词：约氏疟原虫红外期超微结构白细胞介素6 大鼠

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约氏疟原虫红外期体外培养的研究

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动物学杂志 1995年第3期30卷 1-3页

作者：宋建勋冯崇英管文格赵洪雯重庆第三军医大学寄生虫学教研室

通过药物二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌，取肝癌白色结节用胶原酶消化，体外培养建立肝癌细胞系，筛选出对约氏疟原虫子孢子敏感的大鼠肝癌细胞系，建立了大鼠肝癌细胞──约氏疟原虫体外培养系统。约氏疟原虫子孢子接种单层培养... 详细信息

通过药物二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌，取肝癌白色结节用胶原酶消化，体外培养建立肝癌细胞系，筛选出对约氏疟原虫子孢子敏感的大鼠肝癌细胞系，建立了大鼠肝癌细胞──约氏疟原虫体外培养系统。约氏疟原虫子孢子接种单层培养的肝癌细胞，４８ｈ可见红外期裂殖体，７２ｈ后将培养细胞胰酶消化，消化下的细胞及培养上清一并离心，悬液接种健康小鼠，可使之感染疟疾。

关键词：钕约氏疟原虫红外期体外培养

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γ－干扰素对大鼠体内约氏疟原虫子孢子入侵及红外期发育的影响

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第三军医大学学报 1994年第1期16卷 13-15页

作者：秦晓红王兴相况明书第三军医大学基础部寄生虫学教研室

用葡萄球菌肠毒素Ａ刺激体外培养的大鼠脾细胞所获得的γ－干扰素（ＩＦＮ－γ），于接种约氏疟原虫子孢子前５ｈ静注于Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内，子孢子接种４２ｈ后肝内红外期（ＥＥＦ）数量显著减少，其子孢子发育率仅为对照组的７％～... 详细信息

用葡萄球菌肠毒素Ａ刺激体外培养的大鼠脾细胞所获得的γ－干扰素（ＩＦＮ－γ），于接种约氏疟原虫子孢子前５ｈ静注于Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内，子孢子接种４２ｈ后肝内红外期（ＥＥＦ）数量显著减少，其子孢子发育率仅为对照组的７％～２０％，但ＥＥＦ的大小及成熟度均未受影响。大鼠接种子孢子后２ｈ给ＩＦＮ－γ，则红外期的密度、子孢子发育率及红外期大小，成熟度均与对照组无明显差异。将子孢子与ＩＦＮ－γ共孵４０ｍｉｎ，然后超速离心洗脱ＩＦＮ－γ后再接种于大鼠，则红外期的密度、大小、成熟度也均类似于对照组。结果提示：ＩＦＮ－γ的抗疟作用并非是针对子孢子或红外期本身，而是通过修饰枯否氏细胞活性，减少入侵肝细胞的子孢子数来表达的。

关键词：疟原虫红外期干扰素大鼠发育

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疟原虫红外期体外培养及其研究进展

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国外医学（寄生虫病分册） 1990年第3期17卷 101-106页

作者：黄复生王兴相第三军医大学寄生虫学教研室

1966年珠鸡疟原虫(***)红外期的组织培养获得成功后,至1979年Strome才将伯氏疟原虫(***)子孢子成功地感染培养的肝细胞,此后4种人疟原虫的红外期培养也相继获得成功,目前培养技术已逐渐标准化,对疟原虫红外期的研究应用具有重要的意义,... 详细信息

1966年珠鸡疟原虫(***)红外期的组织培养获得成功后,至1979年Strome才将伯氏疟原虫(***)子孢子成功地感染培养的肝细胞,此后4种人疟原虫的红外期培养也相继获得成功,目前培养技术已逐渐标准化,对疟原虫红外期的研究应用具有重要的意义,特别是在人疟原虫的某些研究方面可代替昂贵的动物模型。本文综述近年来疟原虫红外期体外培养技术及有关因素,重点介绍疟原虫红外期培养技术,该技术已广泛应用于其红外期疟原虫的生物学特性、超微结构、免疫学和药物、理化因素对其影响等方面的研究。

关键词：疟原虫红外期体外培养

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抗疟药对体外猴疟原虫和诺氏疟原虫红外期的作用

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国际医学寄生虫病杂志 1990年第2期 77-78页

作者：殷静雯

疟原虫进入肝实质内是其生活史中一个不可缺少的阶段。鉴于间日疟和卵形疟可于初次感染后数月复发,因此,研究抗疟药对肝期疟原虫的作用有重要意义。子孢子由吸血感染猴疟原虫或诺氏疟原虫的恒河猴的蚊内取得。猴疟原虫巴氏亚种和猴疟原... 详细信息

疟原虫进入肝实质内是其生活史中一个不可缺少的阶段。鉴于间日疟和卵形疟可于初次感染后数月复发,因此,研究抗疟药对肝期疟原虫的作用有重要意义。子孢子由吸血感染猴疟原虫或诺氏疟原虫的恒河猴的蚊内取得。猴疟原虫巴氏亚种和猴疟原虫柬埔寨株的子孢子源于斯氏和德氏按蚊。诺氏疟原虫H株的子孢子从德氏按蚊内分离。按蚊血餐12～22天后,无菌解剖

关键词：猴疟原虫恒河猴猕猴诺氏疟原虫抗原虫药抗疟药裂殖体红外期

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