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荧光标记类鼻疽菌的构建及其与宿主细胞相互作用的应用研究

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陆军军医大学学报 2022年第20期44卷 2105-2112页

作者：陈建高饶承龙刘文正吴潘王旭冉南栋琪杨文波毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038

目的构建类鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei,***)的荧光示踪载体,获得自发荧光的类鼻疽菌株,并对其与宿主相互作用的感染过程进行初步应用研究。方法采用基因重组技术,将绿色、红色和蓝色荧光蛋白(green/red/blue fluorescent protein... 详细信息

目的构建类鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei,***)的荧光示踪载体,获得自发荧光的类鼻疽菌株,并对其与宿主相互作用的感染过程进行初步应用研究。方法采用基因重组技术,将绿色、红色和蓝色荧光蛋白(green/red/blue fluorescent protein,GFP/RFP/BFP)基因分别重组到原核表达载体pUCP28T上,构建类鼻疽菌组成型荧光表达载体,并通过体外细菌培养观察外源性荧光蛋白的表达对细菌生长能力的影响,以及荧光标记细菌遗传稳定性的检测。通过炎症因子IL-8的检测评价荧光标记细菌对宿主细胞感染能力的变化。利用活细胞工作站观察类鼻疽菌被宿主细胞自噬体包裹的动态过程。结果构建了三种荧光标记的类鼻疽菌示踪载体,并且能在体外传代20代内稳定表达,且外源性荧光蛋白的表达不影响类鼻疽菌的生长和对宿主细胞的感染。同时,利用高分辨率活细胞成像系统观察到红色荧光标记的类鼻疽菌与宿主细胞GFP-LC3共定位的动态变化过程。结论本文成功构建了三种荧光标记的类鼻疽菌,以期为类鼻疽菌致病机制的研究、抗菌药物的筛选提供重要实用工具。

关键词：类鼻疽菌基因重组荧光标记自噬

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类鼻疽菌血清分型

微生物学报 1990年第5期30卷 393-396页

作者：韩藕儿李俐赵忠利军事医学科学院微生物流行病研究所

类鼻疽假单胞菌根据不耐热抗原的有无分为血清Ⅰ型和Ⅱ型。在没有标准血清情况下,用吸收试验,选出产不耐热抗原较好的菌株,用 Sephadex G-200纯化抗原制备Ⅰ型血清,用该血清对我国分离的68株及引进6株菌以琼脂扩散法,进行血清学分型。... 详细信息

类鼻疽假单胞菌根据不耐热抗原的有无分为血清Ⅰ型和Ⅱ型。在没有标准血清情况下,用吸收试验,选出产不耐热抗原较好的菌株,用 Sephadex G-200纯化抗原制备Ⅰ型血清,用该血清对我国分离的68株及引进6株菌以琼脂扩散法,进行血清学分型。结果表明:68株为血清Ⅰ型,3株为血清Ⅱ型菌,3株不稳定。上述结果与文献报道的一致。即血清Ⅰ型菌多存在于亚洲,血清型与菌株来源(环境、动物)无关,但与地理分布有关。

关键词：类鼻疽菌血清分型

类鼻疽菌通过诱导线粒体自噬促进其胞内存活的研究

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第三军医大学学报 2021年第9期43卷 806-812页

作者：夏瑀培胡治强饶承龙章美娟杨文波闫晶敏岳娟娟毛旭虎李倩陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038

目的探讨类鼻疽菌感染人单核细胞THP-1后诱导线粒体自噬对其胞内存活的影响。方法类鼻疽菌BPC006感染THP-1细胞后2 h,以未感染组作为对照,通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体结构变化,流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后不同时间点线... 详细信息

目的探讨类鼻疽菌感染人单核细胞THP-1后诱导线粒体自噬对其胞内存活的影响。方法类鼻疽菌BPC006感染THP-1细胞后2 h,以未感染组作为对照,通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体结构变化,流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后不同时间点线粒体膜电位的变化,全波长酶标仪检测感染后各时间点ATP含量变化;同时,通过Western blot和实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)分别检测感染后各时间点线粒体蛋白HSP60、TIM23和线粒体DNA mtCO1的变化,激光共聚焦显微镜观察线粒体与自噬小体共定位的情况;最后,分别通过线粒体自噬诱导剂CCCP和抑制剂Mdivi-1预处理后,检测各感染时间点胞内细菌载量的变化。结果类鼻疽菌感染THP-1细胞后2 h观察到宿主细胞线粒体超微结构受损,线粒体膜电位和ATP含量在各感染时间点均降低(P类鼻疽菌感染后线粒体结构和功能受损;Western blot检测显示HSP60和TIM23蛋白水平随感染时间延长而减少,同时Q-PCR检测也显示mtCO1基因水平随感染时间延长而减少,免疫荧光分析显示线粒体蛋白TIM23与自噬小体GFP-LC3共定位明显增多(P类鼻疽菌感染后诱导了线粒体自噬的发生;使用线粒体自噬诱导剂CCCP以及抑制剂Mdivi-1处理细胞后,与对照组比较,激活线粒体自噬类鼻疽菌胞内细菌载量增多(P菌载量降低(P类鼻疽菌感染THP-1细胞后引起宿主细胞线粒体结构和功能受损进而诱导线粒体自噬的发生,从而有利于类鼻疽菌的胞内存活。

关键词：类鼻疽菌 THP-1细胞线粒体线粒体自噬

类鼻疽菌诱导宿主细胞线粒体自噬促进其胞内增殖的机制研究

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类鼻疽菌诱导宿主细胞线粒体自噬促进其胞内增殖的机制研究

作者：夏瑀培中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,***）简称类鼻疽菌,是一种革兰阴性短杆菌,所致疾病称为类鼻疽。类鼻疽作为一种人畜共患的热带医学传染病,主要流行于澳大利亚北部、东南亚等地区,我国的广东、海南、香港、台湾等地也... 详细信息

类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,***）简称类鼻疽菌,是一种革兰阴性短杆菌,所致疾病称为类鼻疽。类鼻疽作为一种人畜共患的热带医学传染病,主要流行于澳大利亚北部、东南亚等地区,我国的广东、海南、香港、台湾等地也是主要疫区,其临床表现为急性细菌性肺炎、弥漫性内脏脓肿和局部感染,伴随败血症时死亡率可高达40%。目前对于类鼻疽尚无特效药和有效疫苗,加之病程进展较快和疾病复发率高的治疗难点,因此深入研究其感染致病机制,将为类鼻疽的防控提出新的思路。线粒体自噬作为机体维持细胞稳态的重要调控手段,通过清除受损线粒体和其产生的副产物活性氧从而降低其可能引起的机体损伤。近年来越来越多研究发现病原体通过主动诱导线粒体自噬操纵宿主抗感染免疫反应,从而达到持续性感染的目的。作为一种兼性胞内寄生菌,类鼻疽菌感染能诱导线粒体自噬且在实现其感染和定植中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。为此,本论文重点探究了类鼻疽菌感染宿主细胞后诱导的线粒体自噬促进其胞内存活的生物学意义,并在此基础上从病原体与宿主互作层面,初步探讨了类鼻疽菌诱导线粒体自噬的分子机制。【研究目的】（1）探讨类鼻疽菌诱导宿主细胞线粒体自噬的生物学意义;（2）从病原体-宿主互作层面初步揭示类鼻疽菌诱导线粒体自噬的分子机制。【研究方法】（1）构建类鼻疽菌感染巨噬细胞模型,使用透射电镜、激光共聚焦显微镜观察线粒体超微结构;通过流式细胞术和全波长酶标仪检测线粒体功能障碍;通过q-PCR、Western-blot、电镜、激光共聚焦显微镜分析类鼻疽菌感染后诱导线粒体自噬的发生;胞内生存实验和流式细胞术分别检测类鼻疽菌的胞内增殖和活性氧产生。（2）采用siRNA、q-PCR、Western-blot、流式细胞术检测分析经典自噬途径与类鼻疽菌诱导的线粒体自噬的关系,以及对细菌胞内存活的影响;通过深度测序筛选宿主差异基因表达,分析类鼻疽菌感染宿主细胞前后内质网应激信号通路变化;生信分析预测筛选类鼻疽菌引起线粒体自噬的关键分子,采用同源重组技术构建其敲除菌株,并通过q-PCR、激光共聚焦观察其感染RAW264.7后线粒体自噬的改变。【研究结果】（1）类鼻疽菌感染后宿主细胞线粒体发生明显的结构形态损伤和功能严重受损、类鼻疽菌感染巨噬细胞后双层膜性囊泡结构包裹线粒体的细胞数量明显增多,感染细胞线粒体自噬小体数量明显增多,mtDNA拷贝数明显降低,线粒体分子伴侣蛋白HSP60和内膜蛋白TIM23表达明显下调。（2）类鼻疽菌通过诱导线粒体自噬促进宿主细胞内线粒体活性氧清除,增强线粒体自噬能提高巨噬细胞内类鼻疽菌载量,且类鼻疽菌诱导的线粒体自噬是通过减少活性氧来促进其胞内增殖的。（3）类鼻疽菌诱导的宿主细胞线粒体自噬依赖经典自噬途径,抑制宿主细胞ATG7、Beclin 1表达可干扰类鼻疽菌诱导的线粒体自噬过程,导致受损线粒体无法被清除并在胞内蓄积。（4）宿主差异表达基因筛选发现类鼻疽菌感染细胞后内质网应激信号通路表达均出现升高,细胞内质网应激激活。（5）生物信息学筛选类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统针尖蛋白BipD为类鼻疽菌诱导线粒体自噬的关键候选靶标,ΔbipD敲除株感染RAW264.7后mtDNA清除降低,诱导线粒体自噬能力明显受抑。【主要结论】（1）类鼻疽菌感染诱导宿主细胞线粒体自噬,线粒体结构和功能严重受损,并通过诱导线粒体自噬清除宿主细胞内活性氧来促进其胞内增殖;（2）类鼻疽菌感染宿主细胞内质网应激激活可能是线粒体自噬的上游调控因素,其Ⅲ型分泌系统针尖蛋白BipD可能介导了类鼻疽菌诱导的宿主细胞线粒体自噬。【创新性和研究意义】我们报道了类鼻疽菌可以诱导宿主细胞线粒体自噬现象及其通过清除线粒体活性氧有利于类鼻疽菌在胞内增殖的生物学意义,从病原体-宿主互作界面探讨了类鼻疽菌诱导线粒体自噬的分子机制,揭示了经典自噬和内质网应激在类鼻疽菌诱导的线粒体自噬中的调控作用,初步鉴定了BipD作为类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统针尖蛋白可能是该菌调控线粒体自噬的重要分子。该研究为深入阐明类鼻疽菌感染机理、制订类鼻疽防治的新策略提供了一定的理论和实验依据。

关键词：类鼻疽菌线粒体自噬内质网应激 BipD

类鼻疽菌Hcp1及外膜多糖的制备与免疫学性质研究

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类鼻疽菌Hcp1及外膜多糖的制备与免疫学性质研究

作者：章美娟中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)简称类鼻疽菌,属兼性胞内革兰氏阴性菌,主要存在于水源和土壤中,可通过多种途径(如呼吸道、消化道等)感染人和动物,引起一种称为类鼻疽(Melioidosis)的人兽共患病。类鼻疽的临床症状多样... 详细信息

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)简称类鼻疽菌,属兼性胞内革兰氏阴性菌,主要存在于水源和土壤中,可通过多种途径(如呼吸道、消化道等)感染人和动物,引起一种称为类鼻疽(Melioidosis)的人兽共患病。类鼻疽的临床症状多样,包括难治性肺炎、坏疽以及致死性败血症等,治疗周期长,费用高,且存在较高的复发率。鉴于类鼻疽菌极易传播、致死率高、耐药性强,且目前尚无有效的疫苗,已被WHO列为B类生物恐怖剂,严重危害人类健康。调查结果显示在全球范围内,类鼻疽病的诊断严重不足。目前,针对类鼻疽菌的实验室诊断方法(如细菌学培养、分子生物学方法和蛋白组学方法等)均存在一定的局限性,且没有商业化、可靠的类鼻疽菌快速诊断方法应用于临床,因此,建立一种简便快速的诊断方法迫在眉睫。ELISA是一种标准的血清学检测方法,也是进一步发展快速检测方法的基础。已有研究报道显示类鼻疽菌溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulated protein 1,Hcp1)的表达水平在其感染宿主的过程中会显著升高,并且能够与类鼻疽患者血清发生强烈的抗原抗体反应,这提示我们该蛋白可诱导机体产生特异性抗体,具有作为血清学诊断抗原的潜在应用价值。基于此,本研究采用DNA重组技术,通过原核表达的方式获得了分子量大小为18 k Da左右的高纯度重组Hcp1(recombinant Hcp1,r Hcp1)蛋白。进一步,我们对r Hcp1蛋白的免疫学性质进行了初步的研究:首先以r Hcp1蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA实验检测抗血清效价,结果显示r Hcp1蛋白表现出较强的免疫原性,刺激动物产生的抗体效价可达1:512 000。接着利用免疫印迹实验、免疫荧光实验对r Hcp1蛋白及其抗血清的特异性进行研究,结果显示r Hcp1蛋白能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合,而与来自疫区阴性血清(未感染类鼻疽菌体检者的血清)不发生结合,二者差异极显著;r Hcp1抗血清仅与类鼻疽不同临床菌株发生特异性结合反应,而与其他病原菌不发生反应,说明r Hcp1蛋白具有较强的特异性。据此,我们初步认为r Hcp1可以作为类鼻疽血清学诊断的候选抗原靶标。类鼻疽菌表面含有丰富的多糖,包括脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、荚膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)等,这些外膜多糖作为重要的毒力因子,在类鼻疽菌的致病机制和免疫调节中发挥着重要的作用,具有作为诊断抗原和疫苗候选抗原的潜能。由于类鼻疽菌可以表达多种LPS和CPS,而截至目前,尚无关于我国类鼻疽菌临床分离株表面多糖的相关报道,对其外膜多糖抗原类型及其生物学功能尚不清楚。基于此,本研究对不同临床菌株进行了外膜多糖的纯化、结构表征和免疫原性研究。首先采用分步提取的方式获得了不同类鼻疽菌临床菌株的胞外多糖,并利用离子交换层析和分子筛层析进行分离纯化,高效凝胶渗透色谱鉴定结果显示纯化后的三种抗原成分BPC004-BPPI-b1、BPC006-BPPI-b1和BPC010-BPPI-b1组成相对均一,分子量大小均分别为931 k Da,640 k Da和546 k Da。进而利用GC-MS、甲基化分析、FT-IR和1D/2D NMR进行精细结构的表征,结果显示BPC004-BPPI-b1的结构为[3)-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→3)-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→]重复单元组成的线性多糖链;BPC006-BPPI-b1主要由[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)-2Me-a-L-6d Talp-1→]构成;BPC010-BPPI-b1的结构与BPC006-BPPI-b1基本相同。进一步,对这三种多糖抗原的免疫学性质以及抗原结构对其免疫活性的影响进行了初步研究:首先采用间接ELISA法对多糖抗原的免疫原性和免疫反应性进行了研究,结果显示三种糖抗原均具有较好的免疫原性,且能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合反应,而与疫区阴性血清不发生结合反应。接着采用间接ELISA法对多糖抗原的抗血清与不同临床菌株的交叉反应情况进行了研究,结果显示抗血清可与本研究中所选取的80%临床菌株发生交叉反应,推测本文所表征的[3)-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→3)-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→]和[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)-2Me-a-L-6d Talp-1→]两种抗原可能在类鼻疽菌的血清学诊断和疫苗开发方面都具有较大的应用价值。最后利用FT-IR、免疫印迹及竞争性ELISA法对多糖抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫原性

关键词：类鼻疽菌 rHcp1蛋白外膜多糖结构鉴定免疫原性

类鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性研究

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类鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性研究

作者：任春艳第三军医大学

学位级别：硕士

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌)是一种革兰阴性杆菌,主要存在于水或土壤中,可经由呼吸道吸入、消化道摄入、皮肤侵入等方式进行传播,主要侵犯人体肺部,可引起以肺炎、肺部空洞及肺部脓肿为特点的类鼻疽病... 详细信息

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌)是一种革兰阴性杆菌,主要存在于水或土壤中,可经由呼吸道吸入、消化道摄入、皮肤侵入等方式进行传播,主要侵犯人体肺部,可引起以肺炎、肺部空洞及肺部脓肿为特点的类鼻疽病,还可导致皮肤、肾脏、肝脏等多器官脓肿,严重者还可能发展为急性败血症而导致死亡。类鼻疽作为一种新发现传染病,诊断困难、致病性强、临床用药治疗困难,并且潜伏期较长,流行地区死亡率高达40%;其流行区域主要分布在南、北纬二十度内,涵盖新加坡、澳大利亚、越南、柬埔寨、马来西亚、老挝、泰国东北部等地区以及我国香港、台湾、广东、海南等地区,越来越多的证据表明它是一种正在全球扩散的人兽共患传染病,目前尚无批准使用的有效类鼻疽疫苗,因此亟待加强类鼻疽的相关研究。毒力因子在细菌致病过程中发挥重要作用,类鼻疽菌的毒力因子主要有III型分泌系统、VI型分泌系统、荚膜多糖、鞭毛、菌毛、群体感应分子、脂多糖等。2011年被发现的类鼻疽伯克霍尔德菌致死因子1(Burkholderia lethal factor 1,BLF1),由bpsl1549基因编码,结构类似于大肠杆菌的细胞毒力因子CNF1-C,主要通过抑制e IF4A解旋酶的活性干扰蛋白质的翻译起始阶段,引起肌动蛋白细胞骨架的改变,并最终导致宿主细胞死亡。类鼻疽的死亡率较高,而BLF1作为类鼻疽菌第一个被发现的致死因子,其重要性不言而喻,获取该毒素对研究其致病机制以及指导类鼻疽的诊断和防治具有重要意义。近年来,随着蛋白合成抑制剂在抗肿瘤治疗方面的效果逐渐被认可,人们对蛋白质翻译起始因子e IF4A的抑制剂在靶向抗肿瘤治疗中应用的关注度也越来越高。BLF1作为潜在的eIF4A解旋酶活性抑制剂,能够抑制蛋白质的合成。那么我们可以设想,如果将该毒素递送至肿瘤细胞后,毒素是否具有广谱杀伤肿瘤细胞的作用呢?目前国内外尚无相关的研究报道。本研究的主要目的是通过基因工程技术重组表达BLF1(rBLF1)蛋白,并初步研究BLF1对肿瘤细胞的杀伤作用,为该蛋白在抗肿瘤治疗中的应用提供依据。方法:1.以BPC006菌株的全基因组DNA为模板,PCR扩增bpsl1549基因,目的基因与pGEX-6P-2载体质粒同时进行BamHI/Xho I双酶切,酶切产物经回收、连接后转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,氨苄抗性LB平板筛选阳性克隆,双酶切及DNA测序验证。***诱导阳性重组子表达GST-BLF1融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白并经PSP酶酶切后获得rBLF1蛋白。以纯化rBLF1蛋白免疫新西兰兔,制备抗BLF1血清,并通过Western blot及ELISA法鉴定。3.A549细胞模型中,通过CCK-8实验研究目的蛋白的细胞毒性效应及抗体阻断作用。不同浓度r BLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,观察小鼠生存率。结果:1.从类鼻疽菌基因组DNA中PCR得到了编码BLF1的目的基因,并通过p GEX-6P-2载体成功构建了高效表达BLF1的工程菌株。2.经过二步亲和层析得到了分子量为23kD的高纯度r BLF1,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1:1 280000,Western blot鉴定在目的蛋白位置处出现特异印迹条带。***1蛋白能明显杀伤A549细胞,抗体可有效阻断其杀伤作用。***1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率随蛋白剂量的增加而升高,同时正常小鼠对低剂量BLF1表现出一定的耐受性。结论:重组表达了具有生物活性的rBLF1,该蛋白具有明显杀伤A549肿瘤细胞的作用,同时能够导致小鼠死亡,但表现出一定耐受性。以上结果为进一步研究类鼻疽菌的致病机制、寻找有效防治手段以及开发该毒素在抗肿瘤中的应用奠定了基础。

关键词：类鼻疽菌毒力因子细胞毒性

NR1D2介导的脂噬在类鼻疽菌胞内持续性感染中的作用机制研究

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NR1D2介导的脂噬在类鼻疽菌胞内持续性感染中的作用机制研究

作者：唐梦灵西南大学

学位级别：硕士

类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌）感染引起的一种热带医学疾病,广泛流行分布于东南亚和澳洲北部等地,我国海南、台湾、香港等地也为主要的疫源地。类鼻疽临床表现形式多样,除了引起亚临床感染... 详细信息

类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌）感染引起的一种热带医学疾病,广泛流行分布于东南亚和澳洲北部等地,我国海南、台湾、香港等地也为主要的疫源地。类鼻疽临床表现形式多样,除了引起亚临床感染、局部的脓肿外,还可导致重症肺炎和急性败血症等,死亡率高达40%。由于类鼻疽菌耐药性强,培养易等特点,早在2006年美国CDC就将其列为I类生物战剂。随着研究的深入,大量的证据表明类鼻疽可能是一种人畜共患疾病。尤其是近些年一些非疫源地也相继出现了类鼻疽病例的报道,如南非、中东等地,我国2008年在北京奥运会期间和2014年在江苏镇江分别发生过一起输入性的类鼻疽病例。再加上国际交流和合作的更加频繁,“一带一路”的建设,海南国际旅游岛的开发以及南海海洋利益维护和主权安全保障已上升至国家战略要求,因此迫切需要深入研究类鼻疽菌感染致病的机理,寻找临床治疗的新策略。类鼻疽菌作为一种胞内寄生、严重危害公共安全的细菌,其逃逸宿主免疫造成的持续性感染是其致病的关键。类鼻疽菌能够快速地侵入宿主体内各类细胞,并使感染细胞发生融合,为自身的复制和传播创造条件,这些被感染的细胞不仅是类鼻疽菌的寄居场所,还给其提供能量和营养物质。近年来,一些研究发现在病原菌感染与免疫过程中,宿主脂质代谢和病原菌相互作用,并为病原菌感染和复制提供能量。在结核杆菌感染早期宿主细胞甘油三酯释放的脂肪酸和甾醇是结核杆菌休眠期间的唯一碳源;在肝炎病毒装备和复制进程中脂质代谢是其必不可少的能量来源。近期课题组在类鼻疽菌感染肺上皮细胞A549逃逸宿主清除机制中观察到宿主细胞脂肪代谢发生明显异常变化,脂质严重蓄积。但是这种脂质代谢的异常表现与类鼻疽菌的感染有什么关系、在其逃逸免疫中发挥什么作用、对其致病有什么生物学意义等问题尚不清楚。众所周知,脂质代谢参与细胞许多重要的生命活动,为各种细胞器形成、扩展、收缩等动态改变以及细胞内质网蛋白质降解等提供所需能量。而近年来研究发现细胞内的脂质还可以通过自噬体转运至溶酶体进行分解,此过程称为脂噬作用。脂噬作为自噬的一种亚进程,被报道与多种细菌、病毒等微生物的致病和感染密切相关。李倩博士2015年在Autophagy上曾报道过类鼻疽菌感染A549细胞早期,通过诱导MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上调,进而实时、连续地抑制其靶基因ATG10表达,负性调控自噬,从而影响宿主细胞的免疫清除,促进其胞内存活。那么,脂质代谢的异常与类鼻疽菌感染引起的自噬过程受抑有什么关系呢?而类鼻疽菌是否是通过自噬作用调节脂质代谢,从而影响细菌在胞内的增殖复制,并导致持续性感染的呢,仍有待阐明。为了探究类鼻疽菌感染过程中,自噬对脂质代谢的调控作用对类鼻疽菌胞内生存的影响,我们首先建立了类鼻疽菌感染A549细胞模型,通过透射电镜、Western Blot、激光共聚焦检测了类鼻疽菌感染的A549细胞脂质代谢和自噬水平变化情况,发现类鼻疽菌感染肺上皮细胞A549后脂质严重蓄积,脂滴堆积,脂质代谢关键分解酶活性降低;同时细胞内AKT-mTOR自噬通路明显受抑。其次,我们进一步验证了自噬与脂质代谢的关系。在药物激活或抑制自噬、siRNA干扰等条件下,通过Western Blot、激光共聚焦观察A549细胞脂质代谢情况,发现激活自噬会明显促进细胞内脂质代谢;细菌胞内计数实验发现A549细胞清除胞内类鼻疽菌的能力明显增强。接着,为了找寻类鼻疽菌是如何通过自噬调控脂质代谢的线索,我们通过类鼻疽菌感染A549细胞后表达谱芯片的筛选,利用生物信息学分析软件Cluster3.0和Tree View对脂质代谢相关基因进行了聚类分析和预测,结果发现NR1D2mRNA表达明显上调。NR1D2（Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2）是孤儿核受体家族成员,具有配体激活的功能。已有文献报道NR1D2不仅能够调节参与代谢功能的基因,如脂质代谢和炎症反应相关基因,还能可以作为诱导自噬的重要信号,与自噬信号通路中关键蛋白LC3、Beclin-1等相互作用,实现对自噬的调节。因此,为了探究在类鼻疽菌感染A549细胞过程中NR1D2是否介导自噬调节了脂质代谢,我们首先利用RT-PCR和Western Blot实验分析确证在类鼻疽菌感染A549细胞后NR1D2的表达水平明显升高。其次,我们构建了NR1D2干扰质粒,发现类鼻疽菌感染宿主细胞后干扰NR1D2的表达明显减少A549细胞中脂滴的蓄积,促进宿主细胞脂质代谢和β-氧化的速率;同时我们还观察到自噬信号通路的关键分子LC3、Beclin-1也伴随NR1D2的抑制而上调。进一步,在抑制自噬水平的条件下,干扰NR1D2表达,通过共聚焦实验发现即使干扰

关键词：类鼻疽菌脂噬持续性感染 NR1D2

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类鼻疽菌特异抗原的制备与应用(报道Ⅰ)

中国人兽共患病学报 1986年第4期 11-13页

作者：李俐段桂琴古惠英陆振豸军事医学科学院微生物流行病研究所广州军区军马防治研究所

为解决在类鼻疽疫源地军马感染鼻疽或类鼻痘的鉴别诊断,用马鼻疽抗血清交联于亲和层析柱去除类鼻疽抗原中的共同成份而获得特异抗原,经生化及免疫学鉴别,认为该抗原是糖蛋白,分子量为30.000～40.000,双相扩散和免疫电泳上与马鼻疽菌无交... 详细信息

为解决在类鼻疽疫源地军马感染鼻疽或类鼻痘的鉴别诊断,用马鼻疽抗血清交联于亲和层析柱去除类鼻疽抗原中的共同成份而获得特异抗原,经生化及免疫学鉴别,认为该抗原是糖蛋白,分子量为30.000～40.000,双相扩散和免疫电泳上与马鼻疽菌无交叉,免疫家兔皮内注射出现变态反应。对内蒙鼻疽马和海南类鼻疽马点眼试验,前者无反应,后者出现反应,说明此抗原特异性较强,可以达到鉴别两种菌感染的目的。

关键词：抗原类鼻疽菌家兔特异性反应亲和层析柱类鼻疽伪鼻疽人畜共患病马鼻疽

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类鼻疽菌的诊断靶标——重组BsaL蛋白

第三军医大学学报 2017年第17期39卷 F0002-F0002页

类鼻疽菌作为一种具有生物威胁的病原菌，广泛肆虐在东南亚及澳大利亚北部等地，并随着环境微生态的改变和极端气候条件的增多呈扩散之势。我国海南正是类鼻疽的主要流行区域，且在福建、广东、广西等地都有过人类鼻疽感染的报道，病死... 详细信息

类鼻疽菌作为一种具有生物威胁的病原菌，广泛肆虐在东南亚及澳大利亚北部等地，并随着环境微生态的改变和极端气候条件的增多呈扩散之势。我国海南正是类鼻疽的主要流行区域，且在福建、广东、广西等地都有过人类鼻疽感染的报道，病死率很高。随着国际交往的增加，输入性的类鼻疽也不断被报道，人间传播的可能性也依然存在。类鼻疽临床表现多样，在临床上极易误诊和漏诊，初诊误诊率几乎100％，尤其是在类鼻疽非流行区域。

关键词：类鼻疽菌 L蛋白 Bsa 非流行区域重组靶标诊断临床表现