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利用转座子插入测序技术筛选蛙源米尔伊丽莎白菌抗血清杀伤相关基因

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利用转座子插入测序技术筛选蛙源米尔伊丽莎白菌抗血清杀伤相关基...

作者：于子润华中农业大学

学位级别：硕士

米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)是一种临床条件致病菌,可感染蛙类,导致蛙暴发性歪头病,该病传染性强,致死率高,是危害我国养殖蛙类最主要的病害之一。研究表明,***可以引起菌血症,导致蛙脑膜炎,在血液中生存和增殖是其致病... 详细信息

米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)是一种临床条件致病菌,可感染蛙类,导致蛙暴发性歪头病,该病传染性强,致死率高,是危害我国养殖蛙类最主要的病害之一。研究表明,***可以引起菌血症,导致蛙脑膜炎,在血液中生存和增殖是其致病的关键。血清中含有多种杀菌和抑菌物质,目前关于***抗血清杀伤的机制尚不清楚。本研究以蛙源***代表菌株FL160902为研究对象,利用Mariner转座子构建了***转座子插入突变体文库,利用转座子插入测序技术筛选到了***抗血清杀伤相关基因,并对关键的基因进行了功能验证,本文主要研究结果如下:一、利用Mariner转座子构建了***转座子插入突变体文库。通过接合转移,将Mariner转座子插入到***基因组中;优化了供体菌和受体菌的接合转移条件,发现当洗脱液为Mg SO、供受体比为2:1、接合转移时间为4 h时,供受体菌的接合转移效率最高,达1.27×10,并在此条件下,通过多次供受体菌的接合转移,构建了***转座子插入突变体文库;随机挑选突变株,利用Tail-PCR检测突变株的转座子插入位点,结果显示,12个突变株的转座子插入位点随机分布在***基因组,表明文库质量良好。二、利用转座子插入测序技术筛选到了16个***抗血清杀伤相关基因。将构建的***突变体文库分别在BHI培养基和黑斑蛙血清中孵育,得到Input文库和Output文库;利用转座子插入测序技术检测到两个文库中转座子特异性插入位点的数量分别为39,361和33,960,分别破坏了基因组中1,829、1,725个基因;比对两个文库中单个基因被转座子插入次数的丰度,发现Output文库中有16个基因的转座子插入丰度明显下降(logFC白质折叠和伴侣蛋白类、胞内转运类、分泌和小泡运输类和基因功能未知类。三、验证了gene 1086和gene 1993在*** FL160902抗血清杀伤过程中的功能。利用同源重组法,构建了gene 1086(无机离子转运代谢类)和gene 1993(复制、重组和修复类)的基因缺失菌株;革兰氏染色及生长曲线测定结果显示Δgene 1086和Δgene 1993的菌株形态和生长性能与WT无明显差异;将三株菌分别与血清孵育2 h,利用菌落计数法比较细菌在血清中的存活数量。结果显示,相比于WT,Δgene 1086和Δgene 1993在血清中存活的数量分别减少了65.0%和24.5%;黑斑蛙攻毒实验结果表明,WT对蛙的致死率为70%,Δgene 1086和Δgene 1993对蛙的致死率分别为40%和20%;此外,组织载菌量检测结果和体内竞争实验结果表明,与WT相比,Δgene 1086和Δgene 1993在血液、肝、脾、肾和脑的定植能力显著下降。

关键词：黑斑蛙米尔伊丽莎白菌血清 Mariner转座子转座子插入测序技术

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牛蛙米尔伊丽莎白菌的分离、鉴定与特性分析

仲恺农业工程学院学报 2022年第2期35卷 8-14页

作者：刘春马杰孙菁阳林翰苏友禄江飚李薇施斐谭小红林蠡仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510225 广州市水产病害与水禽养殖重点实验室广东广州510225 仲恺农业工程学院健康养殖创新研究院广东广州510225

从广州番禺某养殖场患“歪头病”的牛蛙(Lithobates catesbeiana)体内脑组织中分离到1株致病菌MEYL-1.对分离菌株采用细胞形态学、生化特性分析结合16S rDNA和gyrB基因分子分析,判定所分离菌为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)... 详细信息

从广州番禺某养殖场患“歪头病”的牛蛙(Lithobates catesbeiana)体内脑组织中分离到1株致病菌MEYL-1.对分离菌株采用细胞形态学、生化特性分析结合16S rDNA和gyrB基因分子分析,判定所分离菌为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola).采用菌株MEYL-1人工回归感染,显示健康牛蛙注射1×10^(8)CFU·mL^(-1)的分离菌株可复制自然发病相似的“歪头”、“白内障”等症状,并且患病蛙中再分离到的致病菌与感染菌株相同.综合理化特性分析、基因分子鉴定、回归感染实验可基本判定所患歪头病牛蛙病原为MEYL-1(米尔伊丽莎白菌).对19种常用药物敏感分析发现分离株MEYL-1对其中4种药物敏感,7种药物中度敏感,对另外8种药物耐受.本研究通过对“歪头病”的牛蛙菌株的分离鉴定和药物敏感试验,明确了米尔伊丽莎白菌是引起其患病的病原,研究结果将为米尔伊丽莎白菌病的致病机制研究及牛蛙歪头病的防治提供参考依据.

关键词：牛蛙米尔伊丽莎白菌分类鉴定回归感染

白纹伊蚊共生伊丽莎白菌分布特征及对蚊卵孵化和幼虫生长的影响

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热带医学杂志 2024年第8期24卷 1109-1114,I0001页

作者：夏骜顾玲赵永俏张梅花李菊林梁成吴竞瑶杨蒙蒙朱国鼎唐建霞南京医科大学公共卫生学院江苏南京211166 国家卫生健康委员会寄生虫病预防和控制技术重点实验室江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室江苏省血吸虫病防治研究所江苏无锡214064

目的分析伊丽莎白菌在白纹伊蚊不同发育阶段、组织及现场种群中的分布,并研究其对蚊卵孵化以及幼虫生长的影响。方法从实验室白纹伊蚊中分离伊丽莎白菌,通过扫描电镜、理化反应以及进化树分析,综合鉴定菌属。绝对定量法检测伊丽莎白菌... 详细信息

目的分析伊丽莎白菌在白纹伊蚊不同发育阶段、组织及现场种群中的分布,并研究其对蚊卵孵化以及幼虫生长的影响。方法从实验室白纹伊蚊中分离伊丽莎白菌,通过扫描电镜、理化反应以及进化树分析,综合鉴定菌属。绝对定量法检测伊丽莎白菌在白纹伊蚊不同发育阶段、组织以及现场种群的分布情况。水中添加该细菌,分为对照组、抗生素组、白纹伊蚊-3(AdeAl-3)组和抗生素+AdeAl-3组,观察不同组别蚊卵孵化率、幼虫生存率及化蛹率的变化。结果从不同发育阶段白纹伊蚊体内分离一株细菌AdeAl-3,鉴定为米尔伊丽莎白菌。AdeAl-3在白纹伊蚊蛹和幼虫含量丰富,在成蚊中较少,不同发育阶段含量差异有统计学意义(F=18.11,P白纹伊蚊肠中,在唾液腺和卵巢均有分布但含量较少,不同组织间的含量差异有统计学意义(F=588.70,P白纹伊蚊种群中存在AdeAl-3。AdeAl-3组蚊卵孵化率、幼虫生存率与对照组差异均无统计学意义(χ^(2)=0.06、0.01,P均>0.05);对照组、AdeAl-3组和抗生素+AdeAl-3组这三组间的幼虫化蛹率差异有统计学意义(χ^(2)=7.22,P伊丽莎白菌株AdeAl-3在白纹伊蚊种群中普遍存在,对蚊卵孵化、幼虫生存无显著影响,可明显提高幼虫化蛹率,具有作为工程细菌的潜在价值。

关键词：白纹伊蚊米尔伊丽莎白菌蚊卵孵化幼虫生长

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米尔伊丽莎白拮抗菌的分离及抑菌作用研究

饲料研究 2023年第5期46卷 76-81页

作者：王莹罗祖豪刘敏陈腾丽罗心诚王麒林轶杨亚珍长江大学生命科学学院湖北荆州434025 骏益逸农生态科技有限公司湖北荆州434025

试验旨在丰富米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola,EMI)的防治方法,筛选对伊丽莎白菌具有拮抗作用的菌株。采用稀释涂布法对蚓粪中的EMI拮抗菌进行分离,通过形态学观察、生理生化特征分析、16S rRNA基因序列分析确定了分离菌株LM-... 详细信息

试验旨在丰富米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola,EMI)的防治方法,筛选对伊丽莎白菌具有拮抗作用的菌株。采用稀释涂布法对蚓粪中的EMI拮抗菌进行分离,通过形态学观察、生理生化特征分析、16S rRNA基因序列分析确定了分离菌株LM-7的分类地位;研究拮抗菌株LM-7对EMI的最佳抑菌条件及其抑菌活性物质。结果显示,LM-7为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus),在PDA培养基上对EMI的抑菌效果最佳,圈径比为11.13。LM-7胞内含有聚酮合酶基因PKS-Ⅰ、PKS-Ⅱ和非核糖体多肽合成酶基因(NRPS),抑菌活性成分与非核糖体多肽和聚酮类次级代谢产物有关,其抑菌活性物质主要存在于细胞的胞外分泌物中。研究表明,LM-7菌株可作为防治EMI的备选菌株,其发酵液具有开发为新颖结构活性化合物的潜力。

关键词：米尔伊丽莎白菌拮抗菌分离抑菌作用

牛蛙源伊丽莎白菌流行情况、生物学特性及致病性研究

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牛蛙源伊丽莎白菌流行情况、生物学特性及致病性研究

作者：马杰仲恺农业工程学院

学位级别：硕士

伊丽莎白菌病是危害我国养殖牛蛙最主要的病害之一,该病典型症状为歪头、白眼、红腿等。目前蛙类伊丽莎白菌病相关研究较少,研究其流行规律、生物学特性和致病性,对于该病的防治具有十分重要的意义。本研究对2020年11月-2022年10月广东... 详细信息

伊丽莎白菌病是危害我国养殖牛蛙最主要的病害之一,该病典型症状为歪头、白眼、红腿等。目前蛙类伊丽莎白菌病相关研究较少,研究其流行规律、生物学特性和致病性,对于该病的防治具有十分重要的意义。本研究对2020年11月-2022年10月广东省养殖牛蛙伊丽莎白菌病流行情况进行调查,并对分离的伊丽莎白菌株进行生物学特性、致病性研究,主要研究内容和结论如下:1.广东省牛蛙伊丽莎白菌病流行情况分析。本研究于2020年11月-2022年10月对广州、汕头、惠州、清远等地牛蛙场进行病害调查,共采集样本62批,发现病蛙以细菌感染为主（69.8%）,分离病原菌181株,其中伊丽莎白菌（Elizabethkingia sp.）占比最高（22.65%）,其次为气单胞菌（Aeromonas sp.）(16.57%)和不动杆菌（Acinetobacter sp.）(12.71%)、链球菌（Streptococcus sp.）(12.71%)。分离的伊丽莎白菌中除了常见的米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）外,还首次分离到按蚊伊丽莎白菌（Elizabethkingia anophelis）。2.伊丽莎白菌的生物学特性研究。对分离的米尔伊丽莎白菌代表菌株MEYL-1和按蚊伊丽莎白菌代表菌株AWYL-1进行生物学特性研究,两株菌形态、生长特性、pH的耐受能力和胞外产物活性均相似;AWYL-1没有溶血性,而MEYL-1具有β-溶血性;MEYL-1比AWYL-1对盐度的耐受能力强;19种抗生素耐药性检测发现MEYL-1、AWYL-1菌株分别对5种与3种药物敏感,对11种药物和15种药物耐药性较强。3.伊丽莎白菌实时荧光定量PCR检测方法的建立。本研究建立的gyrB TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法标准曲线为（y=-3.3293x+39.609,R=0.9998）具有较好的线性关系,最低可以检测到42 copies/μL的基因拷贝,同时与常见的8种病原无扩增反应。对68份临床病样检测发现,建立的方法比普通PCR检测方法更具准确性。另外,利用该检测方法无创伤采集牛蛙口腔、肛门粘液检测的结果与组织采样检测结果一致,表明无创检测方法可用于牛蛙养殖过程中病原的监测。4.伊丽莎白菌致病性研究。致病力检测发现两株菌均对牛蛙蝌蚪有较强的毒力,感染后出现腹胀腹水、肛门发红等症状;两株菌感染牛蛙死亡率均随着病原的浓度升高而升高,高浓度组死亡率分别达到80%和100%,MEYL-1感染牛蛙出现与自然发病相似的白眼、歪头等症状,AWYL-1感染牛蛙也出现与自然发病相似的全身充血、发红等症状。两种菌感染牛蛙肝、肾、脾、心脏等内脏器官均出现炎症,MEYL-1感染牛蛙脑和眼组织具有严重的病理损伤。组织载量检测发现肝和脑是MEYL-1主要感染部位;肝和肾是AWYL-1菌株主要定植组织。本研究综合症状、病理分析、菌载量变化把米尔伊丽莎白菌病病程分为初期、中期和晚期三个阶段,为牛蛙养殖过程中伊丽莎白菌病的诊断与防控提供了理论依据。

关键词：牛蛙米尔伊丽莎白菌按蚊伊丽莎白菌流行病学调查生物学特性 TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法致病性

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蛙类歪头、破头与白眼综合征病原分析

浙江农业学报 2022年第8期34卷 1617-1625页

作者：李旭东刘永涛杨先乐杨移斌艾晓辉河南省水产技术推广站河南郑州450008 中国水产科学研究院长江水产研究所湖北武汉430223 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

为探明湖北、福建等主养区一系列蛙疾病的发病原因,从具有典型歪头、破头与白眼等症状的蛙脑部和内脏器官分离到40株优势菌。经16S rRNA基因序列比对,发现40株优势菌均与米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)同源。经生理生化鉴定... 详细信息

为探明湖北、福建等主养区一系列蛙疾病的发病原因,从具有典型歪头、破头与白眼等症状的蛙脑部和内脏器官分离到40株优势菌。经16S rRNA基因序列比对,发现40株优势菌均与米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)同源。经生理生化鉴定、系统发育分析发现,这40株优势菌存在遗传差异,宿主和区域是影响亲缘关系的重要因素,并判定菌株典型株QW08为米尔伊丽莎白菌。回归感染实验证实QW08为蛙类歪头、破头与白眼病的病原菌。组织病理学观察显示,米尔伊丽莎白菌感染黑斑蛙可引起其全身多脏器与组织损伤,脑、肠道、肝、脾与肾等组织器官损伤极其严重,主要病理变化表现为变性、坏死和炎症反应,致多组织器官功能障碍而引起感染蛙死亡。药敏特性分析显示,分离株QW08仅对氟苯尼考高度敏感,对其余19种抗生素表现出不同程度的耐药。研究结果为蛙类该病防控提供了理论依据。

关键词：蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定病理药敏特性

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黑斑蛙歪头病的病原菌分离鉴定及其感染病理分析

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水产学杂志 2023年第1期36卷 36-43页

作者：刘益莎王荣华梁丹符艳纯张润春陈中元罗玉双杨星湖南文理学院生命与环境科学学院水生动物重要疫病分子免疫技术湖南省重点实验室常德市农业生物大分子研究中心湖南常德415000 常德市畜牧水产事务中心湖南常德415000 贵州省农业科学院水产研究所贵州贵阳550025

本研究从具有典型歪头病症状的濒死黑斑蛙(Rana nigromaculata)肝脏中分离到一株优势菌HJS0526,以确定常德地区黑斑蛙歪头病的病原菌及分析其致病机理。通过细菌形态学、生理生化分析、16S rDNA序列比对确定HJS0526菌株为米尔伊丽莎白菌... 详细信息

本研究从具有典型歪头病症状的濒死黑斑蛙(Rana nigromaculata)肝脏中分离到一株优势菌HJS0526,以确定常德地区黑斑蛙歪头病的病原菌及分析其致病机理。通过细菌形态学、生理生化分析、16S rDNA序列比对确定HJS0526菌株为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)。人工感染HJS0526菌株14 d后,实验组歪头症状出现率达90%以上,死亡率高于50%,感染症状和自然发病症状基本一致。药物敏感试验结果表明,菌株HJS0526对环丙沙星和氟苯尼考高度敏感,金银花和鱼腥草醇提取液对HJS0526菌株具有极好的抑制效果;组织病理学研究结果显示,HJS0526菌株感染造成黑斑蛙全身多组织器官功能障碍,特别是肝、脾、肾和肺等组织严重损伤,表现为明显充血、出血及细胞变性、坏死。米尔伊丽莎白菌对黑斑蛙具有高致病性,感染后可导致黑斑蛙多组织器官功能损伤而死亡。本研究结果可为预防和控制常德地区由米尔伊丽莎白菌引起的黑斑蛙歪头病提供科学依据。

关键词：黑斑蛙米尔伊丽莎白菌致病性组织病理学

黑斑蛙“歪头病”病原菌的分离鉴定及全基因组测序分析

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黑斑蛙“歪头病”病原菌的分离鉴定及全基因组测序分析

作者：秦振阳四川农业大学

学位级别：硕士

蛙类歪头病是一种以头部歪斜、眼球白内障、运动失调为典型症状的蛙类疾病,该病致死率高、传播迅速、连年发生、用药效果不佳,严重威胁蛙类养殖业。不同研究者从具有该类症状的病蛙中分离出至少9种具致病力的细菌,其中脑膜炎败血伊丽莎... 详细信息

蛙类歪头病是一种以头部歪斜、眼球白内障、运动失调为典型症状的蛙类疾病,该病致死率高、传播迅速、连年发生、用药效果不佳,严重威胁蛙类养殖业。不同研究者从具有该类症状的病蛙中分离出至少9种具致病力的细菌,其中脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)最多见。本研究从湖南岳阳发生歪头病的黑斑蛙脑部、眼球、肝脏、卵巢等多处组织器官分离到一株革兰阴性杆菌,经回归试验确认其致病性,通过细菌形态、生理生化特性、16s rDNA基因构建系统发育树等传统方法,认为其为脑膜炎败血伊丽莎白菌,但经全基因组测序,比对物种鉴定相关的非冗余蛋白质数据库(NR,Non-Redundant Protein Database),证实其为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)。扫描电镜显示,菌体表面常具一凹陷,不同菌体之间有桥状结构连接,菌体平均大小1.72±0.6μm×0.48±0.7μm,透射电镜下可见菌体明显分三层。病原菌在BHI液体培养基,28℃、160r/min的培养条件下,第17h起进入平台期。该病原对对美福仙、链霉素、强力霉素、阿奇霉素、麦迪霉素、氟苯尼考、利福平等7种药物敏感。自然发病蛙的组织病理学观察显示:肝细胞肿大,多空泡出现,变性坏死;有心外膜炎;脑细胞轻度水肿,有炎症灶;眼球视杆视锥层细胞变性溶解;其他组织未见明显异常。这是病蛙歪头、运动失调、出现白内障的组织病理学基础。最后,本研究对米尔伊丽莎白菌分离株HNW1681进行了全基因组测序和分析,概览了其基因组基本情况,挖掘了其基因组中关于病原生存、致病、抗性产生、进化等多方面的基因信息并选取重点做了初步解读。通过以上研究,证实米尔伊丽莎白菌为引起本次黑斑蛙歪头病的病原,传统鉴定手段不能清晰区别米尔伊丽莎白菌和脑膜炎败血伊丽莎白菌。首次报道了本菌的透射电镜和扫描电镜观察结果。通过大体症状和病理学观察的联合解读,描述了其心脏、肝脏、脑、眼等不同程度的病理变化,揭示了该病各类症状的病理基础。在基因组研究中揭示出的病原特性,进一步揭示了该病原的致病机理。

关键词：米尔伊丽莎白菌全基因组测序黑斑蛙分离鉴定

柑橘精油对米尔伊利莎白菌的抗菌活性与机理研究

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柑橘精油对米尔伊利莎白菌的抗菌活性与机理研究

作者：钟为铭湖南农业大学

学位级别：硕士

在高密度蛙类养殖环境中,蛙类脑膜炎作为一种暴发快和死亡率高的疾病,严重影响我国蛙类养殖的发展。近些年,经过对蛙类脑膜炎病原菌的鉴定和人工感染试验,确定米尔伊丽莎白菌为蛙类脑膜炎的主要病原菌。同时米尔伊丽莎白菌还是一种含有... 详细信息

在高密度蛙类养殖环境中,蛙类脑膜炎作为一种暴发快和死亡率高的疾病,严重影响我国蛙类养殖的发展。近些年,经过对蛙类脑膜炎病原菌的鉴定和人工感染试验,确定米尔伊丽莎白菌为蛙类脑膜炎的主要病原菌。同时米尔伊丽莎白菌还是一种含有多种耐药基因的细菌,因此滥用抗生素可能会引起细菌耐药性问题。柑橘精油是一种具有抗细菌,抗真菌,抗氧化能力的天然植物提取物,且不易产生细菌耐药性,因此具有作为潜在抗菌药物的开发价值。本研究通过分析柑橘精油的成分,针对其主要化学成分进行抗菌活性试验,并筛选出芳樟醇进行抗菌机理研究,主要研究结果如下:1.采用水蒸馏法进行柑橘精油的提取。通过气相色谱-质谱分析得出柑橘精油成分组成。其中7种化学物质成分含量大于1%,分别是柠檬烯(70.25%),γ-松油烯(7.90%),β-月桂烯(5.00%),α-蒎烯(3.90%),β-松油烯(1.71%),α-松油醇(1.51%)和芳樟醇(1.03%)。2.药物敏感试验结果表明,米尔伊丽莎白菌芳对樟醇和γ-松油烯高度敏感,该菌对α-蒎烯和柠檬烯中度敏感和β-月桂烯对该菌低敏感。芳樟醇的抑菌直径最大,为42.37±0.36 mm。最小药物抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小药物杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)结果表明,芳樟醇、α-蒎烯、柠檬烯和γ-松油烯的MIC分别为0.1928 g/ml、0.0851 g/ml、0.6811 g/ml和0.6812 g/ml,MBC分别为0.3856 g/ml、0.0851 g/ml、2.7246 g/ml和1.3624 g/ml。3.通过抗菌动力学试验探究芳樟醇对米尔伊丽莎白菌生长的影响,结果表明芳樟醇浓度越高对细菌生长的抑制能力越强。通过细胞活性测定方法测定细菌细胞的存活率,当药物浓度越高,药物致死时间越短。当芳樟醇浓度为0.5×MIC时,为药物对米尔伊丽莎白菌的半数致死浓度。4.荧光显微镜和扫描电镜观察结果可得,米尔伊丽莎白菌细胞膜的保护功能被药物破坏,细胞物质运输紊乱。同时随着药物处理时间的增加,细菌细胞膜完整性破坏越严重。表明芳樟醇通过改变细胞膜的保护功能从而使细菌死亡。5.利用转录组学技术探讨芳樟醇对米尔伊丽莎白菌的抗菌机理,结果表明芳樟醇处理组与对照组的差异表达基因共有392个,其中304个基因表达下调,188个基因表达上调。米尔伊丽莎白菌对芳樟醇应答的表达基因的GO数据库分为三大类,分别为生物学过程8个,细胞成分2个,分子功能10个。其中细胞过程、新陈代谢、细胞结构、催化活性和结合具有代表性。共有93个变化基因被注释到32个KEGG通路中。KEGG通路中基因注释最多的是氨基酸代谢途径,除此之外被注释的代谢途径还包括能量代谢等。

关键词：柑橘精油米尔伊丽莎白菌抗菌活性芳樟醇抗菌机理