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水稻空间诱变与重离子诱变萌发期耐盐突变体的筛选与鉴定

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华南农业大学学报 2024年

作者：赵哲罗增铜浦娜赵二生向松张波何林芮周楚翘郭涛肖武名华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心广东天弘种业有限公司

【目的】筛选萌发期耐盐突变体，为耐盐水稻新品种的创制与培育提供优异的种质资源。【方法】对优质籼稻品种‘航聚香丝苗’干种子进行空间诱变或重离子诱变处理，并对诱变后代进行耐盐突变体的定向筛选。将野生型（WT）‘航聚香丝苗’... 详细信息

【目的】筛选萌发期耐盐突变体，为耐盐水稻新品种的创制与培育提供优异的种质资源。【方法】对优质籼稻品种‘航聚香丝苗’干种子进行空间诱变或重离子诱变处理，并对诱变后代进行耐盐突变体的定向筛选。将野生型（WT）‘航聚香丝苗’种子用不同浓度NaCl进行处理，探索萌发期耐盐突变体筛选的适宜浓度，进而以发芽率为指标对5 205份M2诱变材料进行筛选，并在M3代进行验证。对野生型和突变体进行耐盐相关生理指标的测定与分析、农艺性状的考查；采用48个SSR标记对诱变后代与野生型的遗传相似性进行评估。【结果】萌发期耐盐突变体筛选的适宜NaCl浓度为340mmol/L，筛选得到12份萌发期耐盐突变体。生理指标测定结果显示，2个代表性突变体9-8和22-7的SOD、POD、CAT、APX活性均显著高于WT，MDA、H2O2和O2-含量均显著低于WT，耐盐突变体呈现出更强的抗氧化能力。农艺性状调查结果显示，突变体和野生型的农艺性状基本一致。SSR标记检测结果表明，野生型‘航聚香丝苗’与19-49、20-15、20-49、20-62、15-6、16-65、22-7、20-19、20-38均无SSR差异位点，与9-8、19-18、42-113的差异SSR位点均为1个。【结论】本研究筛选到12份萌发期耐盐突变体，与野生型‘航聚香丝苗’的遗传背景高度一致，对水稻抗盐新品种的培育及抗盐性遗传机理的研究具有一定的理论和实际意义。

关键词：水稻空间诱变重离子辐射 SSR标记突变体筛选

利用反义基因沉默策略构建水稻突变体库及突变体筛选

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华南农业大学学报 2004年第4期25卷 53-57页

作者：陈远玲张群宇简玉瑜杨跃生刘耀光华南农业大学遗传工程研究室广东广州510642

尝试利用鸟枪反义基因沉默策略构建水稻突变体库.利用水稻反义cDNA文库转化粳稻品种中花11,获得了来源于105块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织的1486个转化植株.随机选择来源于11个独立转化系的335个T0植株进行Hm离体叶片筛选,结果表明所有植株... 详细信息

尝试利用鸟枪反义基因沉默策略构建水稻突变体库.利用水稻反义cDNA文库转化粳稻品种中花11,获得了来源于105块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织的1486个转化植株.随机选择来源于11个独立转化系的335个T0植株进行Hm离体叶片筛选,结果表明所有植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假转化体.Southernblot分析结果表明T0植株大部分为单位点整合.T0及T1代转化植株均呈现了一些形态变异,如矮化、无分蘖或多分蘖、结实率降低、粒型或穗型改变、小穗结构改变等.利用Hm离体叶片筛选法对部分T1群体进行筛选,得到了1个变异性状与Hm抗性共分离的突变体,该突变体的变异表型为结实率比非转化对照下降约50%,每穗颖花总数比对照减少约40%,二者的总效应导致突变体单穗产量比对照约下降70%.

关键词：反义基因沉默策略水稻突变体库突变体筛选

油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

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中国油料作物学报 2021年第6期43卷 1115-1125页

作者：杨越寒张静杨龙吴明德李国庆湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室华中农业大学植物科学技术学院湖北武汉430070

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究***的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化(ATMT)油菜黑胫病菌***菌株Lb... 详细信息

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究***的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化(ATMT)油菜黑胫病菌***菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素:潮霉素B浓度为50μg/mL,转化受体(分生孢子)培养时间为15 d(20℃),浓度为2×10^(7-8)孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究***的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。

关键词：油菜黑胫病菌农杆菌介导遗传转化 T-DNA插入诱变突变体筛选

酶标仪在稻米表观直链淀粉含量测定及突变体筛选中的应用

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核农学报 2004年第3期18卷 183-185页

作者：朱小杨沈圣泉陈文岳舒庆尧浙江大学原子核农业科学研究所浙江杭州310029

探索了 96孔全自动酶标仪 (SpectraMax 1 90 ,Sunnyvale,USA)在稻米表观直链淀粉含量(AAC)测定中的应用效果。实验以IR2 4、Iri371、Z41 3、KMD1、秀水 1 1共 5个品种为材料 ,以农业部部颁标准为参照 ,样本处理后不作定容稀释而直接在 9... 详细信息

探索了 96孔全自动酶标仪 (SpectraMax 1 90 ,Sunnyvale,USA)在稻米表观直链淀粉含量(AAC)测定中的应用效果。实验以IR2 4、Iri371、Z41 3、KMD1、秀水 1 1共 5个品种为材料 ,以农业部部颁标准为参照 ,样本处理后不作定容稀释而直接在 96孔酶标板上进行显色 ,测定OD值 ,根据标样获得的回归等式计算待测样本的AAC。结果表明 ,酶标法与国标法测得的精度无显著差异。利用这一体系 ,对 1 5 0 0余份协青早B的M3 (收自M2 单株 )种子进行了AAC突变体筛选及后代跟踪研究 ,获得了 1份中等AAC( 1 6%左右 )突变体ZXY1 6。该方法操作简便易行。

关键词：酶标仪稻米性状表观直链淀粉含量测定突变体筛选

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烤烟EMS诱变后代高香气突变体筛选

作物杂志 2019年第1期 68-74页

作者：杨欣玲姚倩平文丽马一琼王宝林贾国涛杨永锋崔红河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450000 河南省农业科学院烟草研究所/黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南许昌460001 河南农业大学烟草学院河南郑州450002

为筛选高香气且品质较优的烤烟后代,以中烟100为材料,采用EMS诱变技术对中烟100种子进行处理,筛选出2个叶面腺毛密度大的突变体材料,通过田间试验,对其叶面腺毛密度、叶面化学成分、烤后化学成分、香气物质含量和感官质量评吸等指标进... 详细信息

为筛选高香气且品质较优的烤烟后代,以中烟100为材料,采用EMS诱变技术对中烟100种子进行处理,筛选出2个叶面腺毛密度大的突变体材料,通过田间试验,对其叶面腺毛密度、叶面化学成分、烤后化学成分、香气物质含量和感官质量评吸等指标进行评估,并与正常中烟100后代和NC89进行对照。研究结果表明,EMS-2诱变株系腺毛密度最大,为65.55个/mm^2,分别是中烟100(37.19个/mm^2)和NC89(56.06个/mm^2)的1.8和1.2倍;叶面化学成分分析结果表明,EMS-1诱变株系西柏烷类和烷烃类含量最多,分别为57.18、5.16mg/m^2,EMS-2突变株系蔗糖酯类物质分泌较旺盛,含量最多,为0.33mg/m^2;烤后样化学成分分析结果表明,EMS-2突变株系化学成分含量较协调,且香气成分含量最多,达到890.32μg/g,分别比中烟100和NC89增加34.5%和29.0%;结合对诱变后代的感官评价,得出结论:诱变株系综合品质较好,可提高烟叶质量,EMS-2综合品质最好,可以作为待选株系进行下一步品种选育。

关键词：烤烟 EMS诱变技术腺毛密度化学成分香气物质突变体筛选

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拟南芥耐逆突变体筛选

拟南芥耐逆突变体筛选

作者：姜翠茹山东师范大学

学位级别：硕士

植物生存的环境是不断变化的,为了生长发育和繁殖产生后代,针对不同的环境因子会以不同的方式加以感受、识别,并作出相应的生理反应,最终适应环境。若环境变化太剧烈,超出了植物正常生长发育所能忍受的限度,就会对植物产生胁迫。植物逆... 详细信息

植物生存的环境是不断变化的,为了生长发育和繁殖产生后代,针对不同的环境因子会以不同的方式加以感受、识别,并作出相应的生理反应,最终适应环境。若环境变化太剧烈,超出了植物正常生长发育所能忍受的限度,就会对植物产生胁迫。植物逆境胁迫通常主要指非生物胁迫,包括高温、低温、氧化胁迫、干旱、高盐及低钾胁迫。土壤盐碱化是影响农作物生长和增产的最主要的环境因素,导致大量农作物减产,因此对植物耐盐机理的研究以及耐盐作物品种的培育是十分重要的。由于对植物耐盐性调控网络的了解还不很清楚,因此尚需进一步寻找植物基因组中与耐盐有关的基因,并研究这些基因的功能。本研究从三种不同的T-DNA激活标签突变体库中筛选耐盐及盐敏感突变体,以期对植物耐盐机制的阐述提供理论基础。三种不同的激活标签突变体库分别为:普通的功能获得型激活标签突变体库,激活标签质粒载体为pSKI015,选择标记为除草剂抗性;β-雌二醇诱导的激活标签突变体库,激活标签质粒载体为pER16,其上有XVE表达系统,选择标记为卡那霉素抗性;功能获得型激活标签突变体库,激活标签质粒载体为pSKI074,选择标记为卡那霉素抗性。对普通的功能获得型激活标签突变体库和β-雌二醇诱导的激活标签突变体库共5000个株系进行了耐高盐突变体的筛选,筛选盐浓度为200 mmol/L NaCl,筛选指标为在这种胁迫下野生型拟南芥幼苗根的生长受到明显抑制,恰好不发生弯曲,最终得到3株可以遗传到T2代的突变体,但是表型不能继续遗传给下一代。对功能获得型激活标签突变体库共1000个株系分别进行了耐低钾高盐与低钾低盐敏感突变体的筛选,低钾培养基中钾离子含量为40μmol/L,筛选盐浓度分别为150 mmol/L和50 mmol/L NaCl,筛选指标为:低钾培养基中150 mmol/L NaCl浓度是使野生型拟南芥幼苗不发生弯根的初始盐浓度;低钾培养基中50 mmol/L NaCl浓度是使野生型拟南芥幼苗弯根程度最大的盐浓度,没得到能够稳定遗传的低钾耐高盐与低钾低盐敏感突变体。尽管最终没能得到稳定遗传的突变体,可是本论文的工作却为进一步筛选其他突变体植株提供了重要参考。

关键词：拟南芥耐盐激活标签突变体库突变体筛选

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紫花苜蓿耐铝毒突变体筛选的研究

紫花苜蓿耐铝毒突变体筛选的研究

作者：潘小东西南农业大学

学位级别：硕士

为适应我国南方畜牧业发展的需要,在南方地区也已经开始种植了紫花苜蓿。但是,南方土壤普遍偏酸性,土壤中的活化铝对紫花苜蓿产生严重毒害,致使紫花苜蓿在我国南方大面积推广受到限制。长期的实践证明培育耐铝毒紫花苜蓿品种是解决这一... 详细信息

为适应我国南方畜牧业发展的需要,在南方地区也已经开始种植了紫花苜蓿。但是,南方土壤普遍偏酸性,土壤中的活化铝对紫花苜蓿产生严重毒害,致使紫花苜蓿在我国南方大面积推广受到限制。长期的实践证明培育耐铝毒紫花苜蓿品种是解决这一问题的最佳选择。许多研究表明,苜蓿属植物中缺乏耐铝毒较强的种质资源,因而通过常规育种较难获得耐铝毒强的品种。因此,采用现代生物技术把耐铝毒基因导入或启动其耐铝毒沉默基因表达将是最有可能获得耐铝毒紫花苜蓿品种的方法。本研究在总结前人经验的基础上,尝试从紫花苜蓿单细胞培养中筛选耐铝毒突变体的方法,为紫花苜蓿耐铝毒育种提供一种新的途径。本研究以我校育成的紫花苜蓿新品系“西农1号”作为材料探索并建立其离体再生体系。以田间植株的叶片为外植体,对7种愈伤组织诱导培养基进行筛选,发现培养基G(BMS+2、4-D5+KT3+BA0.2+水解乳蛋白1000)和F(SH+2,4-D5+KT1+硫酸钾4.35g/L+肌醇100mg/L+脯氨酸1000mg/L)有较高的愈伤组织诱导率,分别为41.2%和40.8%;将培养基G和F诱导出的愈伤组织分别转入6种不同分化培养基中,结果表明:从培养基F诱导的愈伤组织在分化培养基F(MSO)的分化率最高,达53.3%;将从分化培养基F中长出的小苗剪断插入6种不同生根培养基中进行生根比较,20天后观察到在生根培养基C(1/2MS+蔗糖15g/L)的生根率最高,达42.3%。本研究对紫花苜蓿悬浮细胞培养体系进行了探索。将培养基F上培养20天诱导出的愈伤组织接入液体培养基F中培养25天并测定其细胞浓度,结果表明:在第10-20天细胞浓度增加较快,在第22天达到峰值6.4×10个/ml;在添加四个不同肌醇浓度对悬浮细胞培养的影响中,添加1000mg/L的肌醇可以显著提高紫花苜蓿悬浮细胞浓度;在悬浮细胞培养的继代培养过程中,发现第4次继代的活细胞数所占比例最高,达89.9%。通过本研究得出紫花苜蓿悬浮细胞培养的最佳方案:液体培养基为SH+2,4-D5+KT1+硫酸钾(4.35g/L)+肌醇(1000mg/L)+脯氨酸(1000mg/L),培养周期为22天左右,起始继代间隔为3天,继代4次后继代间隔为5-7天。本研究还对紫花苜蓿耐铝毒突变体的筛选从以下几个方面进行了探索。将“西农1号”诱导出的愈伤组织块置于不同铝毒水平(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mM/L的AlCl)诱导培养基上培养30天,发现AlCl 0.4mM/L以上培养基的愈伤组织显著褐化,细胞坏死;将愈伤组织置于不断增加铝毒浓度的诱导培养基上继代驯化培养,结果表明:在AlCl浓度为0.3mM/L以下培养的愈伤组织没有失去分化能力。将培养好的悬浮细胞置于不同铝毒水平(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mM/L的AlCl)平板培养基上,发现AlCl浓度为0.3mM/L的培养基上形成的细胞团数(2.33个/培养皿)与浓度为0.2mM/L和0.4mM/L的培养基上形成的细胞团数相比,达显著水平。研究结果认为,紫花苜蓿耐铝毒突变体的细胞筛选适宜

关键词：紫花苜蓿耐铝毒突变体筛选植株再生

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拟南芥镉敏感突变体筛选与鉴定

拟南芥镉敏感突变体筛选与鉴定

作者：匡璐江苏师范大学

学位级别：硕士

工农业发展带来的镉(Cadmium,Cd)污染严重影响着植物的生长发育以及人类的身体健康。目前人们了解到植物主要通过转运蛋白将镉或者是含镉的复合物转运进入植物的液泡进行区隔化,其中植物螯合肽(phytochelatins,PCs)与Cd形成PC-Cd复合物... 详细信息

工农业发展带来的镉(Cadmium,Cd)污染严重影响着植物的生长发育以及人类的身体健康。目前人们了解到植物主要通过转运蛋白将镉或者是含镉的复合物转运进入植物的液泡进行区隔化,其中植物螯合肽(phytochelatins,PCs)与Cd形成PC-Cd复合物,并被ABCC1转运进液泡的解毒方式是拟南芥中已知最为主要的解毒机制。然而是否存在PC途径之外的机制目前人们仍然知之甚少,为了阐明这个问题,本课题进行了以下研究:(1)为了排除PC途径的影响,利用拟南芥At PCs突变体Δpcs作为背景材料,通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变构建了质量较高的突变体库,在11.5μM的Cd Cl条件下在M2代中筛选到了一个镉胁迫敏感突变体csm1(cadmium-sensitive mutant1)。(2)将csm1与Ler-0生态型作为亲本进行杂交得到的F1代,然后再自交得到F2代。对F2代进行At PCS1的基因型鉴定,将At PCS1基因型为纯合突变体的F2代再自交一代得到F3代,单株收种,如F3群体在11.5μM Cd Cl培养基上根长发生明显分离,则可判断为F2亲本个体的csm1为杂合状态。对分离的F3群体个体取样,构建两个极端表型个体样品的DNA混合池,进行高通量测序。(3)运用Mapping-by-Sequencing(MBS)的方法对控制突变体性状的关键基因进行定位,将两个DNA池之间的SNP-index进行相减求得差值ΔSNP-index,将?SNP-index显著偏离0的SNP位点作为候选位点,两池之间的ΔSNP-index大于阈值的染色体区域,为2号染色体的16.5M-19.7M,即为候选区域。(4)得到的候选区间中,在第19338733的位点上产生了G-A突变,位于At SPL1的第二个外显子上,该位点测序深度为44次,AF为0.818181818,SNP置信度较高,因SPL1为ABA途径及胁迫响应相关转录因子,故猜测At SPL1或为候选基因。(5)外源施加11.5μM Cd Cl后At SPL1 T-DNA插入突变体(spl1)主根长较于Col-0更短,故认为在有镉环境下At SPL1的突变可引起拟南芥主根变短;外源施加11.5μM Cd Cl后,csm1体内ABA途径与At SPL1相关的基因At RAP2.6、At LEA14、At LTI30的相对表达量上调,说明csm1的突变可影响拟南芥ABA途径相关基因的表达;并且在11.5μM Cd Cl培养条件下,spl1体内镉的累积量高于Col-0,因此初步推测At SPL1可能为候选基因。(6)对正常培养条件以及11.5μM Cd Cl培养条件下培养的Δpcs及csm1取样提取RNA进行测序并对数据进行GO富集分析,发现在外源施加镉时,csm1体内突变引起的根部转录水平发生变化的基因,主要富集于ABA途径。本研究旨在通过筛选镉超敏感型拟南芥突变体,开展对镉吸收的转运机理及相应胁迫反应等相关研究,探索重金属镉在植物体内的转运积累机制,为选育抗镉作物品种、减少重金属污染、保障食品安全提供新的视角。

关键词：拟南芥镉突变体筛选 MBS

拟南芥下胚轴向光弯曲不敏感突变体筛选及相关基因克隆

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拟南芥下胚轴向光弯曲不敏感突变体筛选及相关基因克隆

作者：赵筱薇河南大学

学位级别：硕士

植物体为更好适应自然环境,在其长期进化过程中形成诸多适应外界环境的能力。其中向光性反应就是为更多获得光源的一种适应反应。蓝光受体向光素的发现,为深入研究蓝光诱导的向光性信号转导机制提供新的途径。向光素PHTO1、PHOT2感受蓝... 详细信息

植物体为更好适应自然环境,在其长期进化过程中形成诸多适应外界环境的能力。其中向光性反应就是为更多获得光源的一种适应反应。蓝光受体向光素的发现,为深入研究蓝光诱导的向光性信号转导机制提供新的途径。向光素PHTO1、PHOT2感受蓝光后,与其下游信号蛋白NPH3和RPT2相互作用,调节生长素运输载体AUX1和PIN1的活性及定位、从而使拟南芥黄化苗下胚轴向光侧和背光侧中生长素分布不均匀,导致向光弯曲。但是蓝光信号如何调节向光弯曲的机制尚不完全清楚。本实验以蓝光受体phot1突变体为材料,通过0.3%乙酰甲基磺酸（EMS）诱变,应用100μmol ms的单侧蓝光处理12 h,对其M2代幼苗进行大规模的筛选。获得3株潜在突变体,分别命名为sph1 （slow phototropic hypocotyl 1）向光性迟缓突变体、lph1（littery phototropic hypocotyl 1）向光性杂乱突变体以及dph1（deletion phototropic hypocotyl 1）向光性缺失突变体.研究发现,与phot1突变体相比,sph1突变体除在100μmol ms单侧蓝光刺激下向光弯曲反应迟缓之外,其在25μmol ms红光下部分失去负向重力性,1μmol ms的蓝光可以恢复这种现象。将sph1突变体与Ler杂交,观察F1代和F2代的表型分离比,证实sph1为单基因隐性突变。通过图位克隆,将其定位在MSF3 BAC上,经测序发现该突变体在At2G18790.1基因DNA序列的第3482bp发生了点突变,由原来G变为A,蛋白质序列分析后发现,由于三联子密码GCC突变为ACC,因此第1096个氨基酸发生突变,即由丙氨酸突变为苏氨酸,因此可以推测点突变所造成的蛋白质序列的变化会直接导致其向光反应迟缓。以phot1突变体为对照材料,对sph1突变体进行一系列的表型鉴定,观察它们在生长发育方面的差异。结果显示营养生长时期sph1突变体较phot1突变体相比,其叶片狭小、叶柄较长且逆时针螺旋排列、幼苗茎较长,同时气孔开度和密度较低、失水较慢、叶片温度较高,但其最终结实量同phot1突变体无明显差异。其原因可能是sph1突变体通过较长的叶柄逆时针螺旋排列、相对较长的茎等多种方式调节避荫反应,使其叶片根据光线调整位置从而最大限度获得光能,进行光合作用,积累能量,最终对结实量无影响。对于lph1和dph1突变体,通过与Ler杂交后F1代和F2代表型分离比,证实lph1和dph1同样为单基因隐性突变。目前已将lph1粗定位在拟南芥第五条染色体的底部,dph1粗定位在第四条染色体的中部。以上研究结果表明,SPH1、LPH1、DPH1可能参与调控向光素介导的强蓝光向光弯曲的信号转导,但具体机制有待进一步研究。

关键词：蓝光向光素向光弯曲突变体筛选图位克隆