检索结果-南通市图书馆

CD107a及穿孔素蛋白检测对原发性噬血细胞综合征的诊断效能

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中华医学杂志 2022年第28期102卷 2161-2166页

作者：张嘉孙媛张蕊肖娟王晶石吴林宋悦王昭首都医科大学附属北京友谊医院血液科北京100050 北京京都儿童医院血液肿瘤中心北京102208 首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心北京100045

目的探讨及评价快速免疫学检测指标脱颗粒功能测定(CD107a)及穿孔素(Perforin)表达检测在判定原发性噬血细胞综合征[即原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(pHLH)]诊断中的效能。方法回顾性分析2015年4月至2020年6月由首都医科大学附属... 详细信息

目的探讨及评价快速免疫学检测指标脱颗粒功能测定(CD107a)及穿孔素(Perforin)表达检测在判定原发性噬血细胞综合征[即原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(pHLH)]诊断中的效能。方法回顾性分析2015年4月至2020年6月由首都医科大学附属北京友谊医院、北京京都儿童医院以及首都医科大学附属北京儿童医院三家医疗机构收治的295例行基因筛查的HLH确诊患者的病例资料,对比快速免疫学功能指标CD107a和Perforin表达与基因筛查的契合度,评价两项指标检测的灵敏度、特异度及阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV),并建立免疫功能学指标对判定pHLH的受试者工作特征(ROC)曲线,选取具有临床指导意义的cut‑off值。结果295例HLH患者中,男156例、女139例,年龄2个月~70岁,中位年龄18岁。CD107a检测在判定脱颗粒基因缺陷相关pHLH方面,ROC曲线下面积(AUC)为0.920(P10%在判断不涉及脱颗粒相关基因和基因筛查阴性的患者方面,准确度为81.6%。Perforin表达测定在判定家族性噬血细胞综合征2型(FHL2)方面,在基于实验室正常检测值(≥81%)情况下,该项检测的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为88.2%、64.2%、20.3%和98.1%。建立ROC曲线进一步优化cut‑off值,计算AUC为0.933(P<0.001),约登指数最大值对应的cut‑off值为62.34%,此时灵敏度仍保持在88.2%,特异度、PPV和NPV分别提升为91.5%,51.7%和98.7%。结论CD107a和Perforin测定对涉及细胞毒功能受损的pHLH具有较好的早期预判意义,选取适当的cut‑off值,可为临床精准诊断提供依据。

关键词：噬血细胞综合征脱颗粒功能测定穿孔素灵敏度特异度横断面研究

沙门氏菌噬菌体SM-p2内溶酶及穿孔素的生物信息学分析和克隆表达

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国食品学报 2022年第8期22卷 32-39页

作者：戚斌解天慧石慧西南大学食品科学学院重庆400715

沙门氏菌是常见的危害公共安全的食源性致病菌。内溶酶和穿孔素作为新型生物抑菌剂,是噬菌体编码的具有细菌裂解作用的功能蛋白。本文利用十聚寡核苷酸引物和PCR技术对噬菌体SM-p2的DNA进行随机扩增并确定穿孔素基因Hol 2和内溶酶基因Ly... 详细信息

沙门氏菌是常见的危害公共安全的食源性致病菌。内溶酶和穿孔素作为新型生物抑菌剂,是噬菌体编码的具有细菌裂解作用的功能蛋白。本文利用十聚寡核苷酸引物和PCR技术对噬菌体SM-p2的DNA进行随机扩增并确定穿孔素基因Hol 2和内溶酶基因Lys 2;使用生物学信息软件分析预测Lys 2和Hol 2的特性;利用大肠杆菌原核表达系统对Lys 2和Hol 2进行克隆表达。结果表明:噬菌体SM-p2是一种具有“穿孔素-内溶酶”裂解体系的双链DNA烈性噬菌体。经生物信息学分析发现,Hol 2是一种仅有一个跨膜结构的Ⅲ型穿孔素,Lys 2是一种没有跨膜结构肽聚糖水解酶。利用大肠杆菌表达系统成功表达了Lys 2和Hol 2,然而,穿孔素能直接裂解细菌细胞内膜,对感受态表达细胞产生毒害作用,导致Hol 2表达量较少。最终获得质量浓度为5.419 mg/mL的内溶酶Lys 2和2.191 mg/mL的穿孔素Hol 2。本研究成功表达了沙门氏菌噬菌体SM-p2的内溶酶和穿孔素,为SM-p2的抑菌研究奠定了分子基础。

关键词：噬菌体基因克隆内溶酶穿孔素

IL-17D调控CD93^(+)CTL在肺脏肿瘤微环境中的杀伤功能及桔梗的促进作用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国免疫学杂志 2024年第5期40卷 925-930,938页

作者：杨雯越张庆国张珊王悦王丽姚成芳山东第一医科大学(山东省医学科学院)临床与基础医学院济南250117

目的:探讨IL-17D调控CD93^(+)CTL在肺脏肿瘤微环境(TME)中的杀伤功能及桔梗(PG)的促进作用。方法:采用PG或IL-17D处理小鼠肺脏B16黑色素瘤模型和对照小鼠,观察肺脏肿瘤克隆形成;应用单细胞测序、免疫荧光染色、流式细胞术等方法检测肿... 详细信息

目的:探讨IL-17D调控CD93^(+)CTL在肺脏肿瘤微环境(TME)中的杀伤功能及桔梗(PG)的促进作用。方法:采用PG或IL-17D处理小鼠肺脏B16黑色素瘤模型和对照小鼠,观察肺脏肿瘤克隆形成;应用单细胞测序、免疫荧光染色、流式细胞术等方法检测肿瘤小鼠肺脏IL-17D表达变化;采用单细胞测序、流式细胞术等方法分别检测各组小鼠肺脏CD93^(+)CTL含量、细胞表型和功能因子改变(包括CD107a、穿孔素、颗粒酶B、趋化因子CCL2、CXCL9及趋化因子受体CCR2、CXCR3等);利用EL4细胞系,采用Western blot、RT-PCR检测桔梗皂苷D对IL-17D及其转录调控因子NRF2表达的作用。结果:小鼠肺脏CD93^(+)CTL较CD93−CTL高表达穿孔素、CD107a等细胞毒性效应因子和趋化因子受体CXCR3、CCR2等,而颗粒酶B分泌能力无显著差异;小鼠肺脏肿瘤模型中,肺脏IL-17D表达及其CD93^(+)CTL含量明显下降(P<0.001);肿瘤小鼠经IL-17D回补实验,或经PG处理10 d后,肺脏IL-17D和CD93^(+)CTL比例和数量明显增多(P<0.05),肿瘤克隆明显减少。同时,肿瘤局部CD93^(+)CTL募集和功能相关细胞因子CCL2、CXCL9、IL-17D等表达明显上调。PG对IL-17D的上调作用在EL4细胞系体外实验中也得到了验证,桔梗皂苷D可显著上调EL4细胞IL-17D及其转录调控因子NRF2表达。结论:中药PG及其提取物可上调肺脏IL-17D表达,增强肺脏CD93^(+)CTL浸润和杀伤功能,拮抗肿瘤在肺脏的恶性进展,是PG改善肺脏TME的重要药理机制。

关键词：桔梗 IL-17D CD93 CTL 肺脏穿孔素

双氢青蒿素对非小细胞肺癌细胞诱导的CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫应答的影响

同方期刊数据库博看期刊评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

安徽医科大学学报 2024年第3期59卷 424-429页

作者：王南楠刘宇凌惠娟牛可朱亚玉陈礼文安徽医科大学第二附属医院检验科合肥230601 安徽医科大学第二附属医院输血科合肥230601

目的探讨青蒿素衍生物双氢青蒿素(DHA)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞诱导的CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫功能的调控作用。方法将NSCLC细胞系A549细胞分为二甲基亚砜(DMSO)对照组和DHA处理组;分别用DMSO和不同浓度的DHA(25、50和100μmol/L)处理A... 详细信息

目的探讨青蒿素衍生物双氢青蒿素(DHA)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞诱导的CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫功能的调控作用。方法将NSCLC细胞系A549细胞分为二甲基亚砜(DMSO)对照组和DHA处理组;分别用DMSO和不同浓度的DHA(25、50和100μmol/L)处理A549细胞,根据半抑制浓度(IC 50)选择最适浓度的DHA处理A549细胞0、24、48、72 h;CCK-8法和集落形成实验检测DHA对A549细胞增殖和集落形成能力的影响;密度梯度离心法分离健康个体外周血单个核细胞(PBMC),经黏附贴壁法去除单核细胞,随后与丝裂霉素C预处理的A549细胞按照10∶1比例共培养,2周后采用流式细胞术分别检测CD8^(+)T细胞比例及其穿孔素和颗粒酶B的表达水平。结果与对照组相比,25、50和100μmol/L DHA处理24 h后的A549细胞增殖的抑制率均升高(P穿孔素和颗粒酶B的CD8^(+)T细胞比例均更高(P<0.01)。结论DHA能够抑制NSCLC细胞生长,促进NSCLC细胞诱导的CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫应答。

关键词：双氢青蒿素非小细胞肺癌肿瘤免疫 CD8^(+)T细胞穿孔素颗粒酶B

大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的表达及协同抑菌活性测定

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

动物医学进展 2024年第4期45卷 75-81页

作者：邹玲赵天祎王馨锐甄建瑜刘文华张灿青岛农业大学动物医学院山东青岛266109

为了确定大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的穿孔素(holin)与裂解酶(lysin1、lysin2)在裂解宿主菌过程中的协同作用,根据噬菌体swi2裂解系统的基因序列设计引物,搭桥PCR法分别扩增holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2基因,以pCol... 详细信息

为了确定大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的穿孔素(holin)与裂解酶(lysin1、lysin2)在裂解宿主菌过程中的协同作用,根据噬菌体swi2裂解系统的基因序列设计引物,搭桥PCR法分别扩增holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2基因,以pColdTF为载体,构建重组质粒pCold-holin-lysin1、pCold-holin-lysin2、pCold-lysin1-lysin2,在大肠埃希氏菌BL21中诱导表达,并测定各串联蛋白对大肠埃希氏菌BL21的菌内外裂解活性。结果表明,成功构建了噬菌体swi2裂解系统相关基因两两串联的重组质粒,并在原核系统中实现了holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2蛋白的可溶性表达。lysin1、lysin2具有天然的菌内和菌外裂解活性,而单独的holin未表现出任何抑菌活性;lysin1与lysin2、holin与lysin1之间无协同作用,而holin与lysin2之间存在协同作用,可以显著增强lysin2的菌内外裂解活性(P<0.05)。研究结果证明了lysin1和lysin2在噬菌体swi2增殖后期替代holin完成裂解宿主菌的过程,两者之间不存在协同作用,这将为进一步阐明噬菌体swi2的裂解机制提供参考。

关键词：噬菌体swi2 穿孔素裂解酶协同作用抑菌活性

乳腺癌患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及意义

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

实用医学杂志 2023年第22期39卷 2872-2877页

作者：庄赵为袁武梅任作东李上飞陈明贵曾妍石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832002 广东医科大学附属湛江中心医院精准医学检验实验室广东湛江524037

目的分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值,明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法应用流式细胞术检测108例乳腺癌... 详细信息

目的分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值,明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法应用流式细胞术检测108例乳腺癌和70例乳腺良性疾病患者样本中CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估各指标对乳腺癌的诊断效能,比较不同临床病理特征乳腺癌患者颗粒酶B和穿孔素的表达及治疗前后各指标的变化。结果乳腺癌患者T淋巴细胞亚群与NK细胞中颗粒酶B和穿孔素表达均高于对照组,差异均有统计学意义(P穿孔素阳性率的曲线下面积(AUC)大于0.5。CD3^(+)T细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P穿孔素表达明显高于无淋巴结转移组(P穿孔素表达高于治疗前(P穿孔素的表达对于诊断乳腺癌有一定的参考价值,且与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期有关,可辅助临床上乳腺癌的早期筛查、诊断及治疗效果评价。

关键词：乳腺癌 T淋巴细胞 NK细胞颗粒酶B 穿孔素分子分型

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

穿孔素在重度子痫前期发病中的作用

中华妇产科杂志 2011年第8期46卷 587-590页

作者：魏军李雪玲孙羽林琳刘彩霞中国医科大学附属盛京医院妇产科沈阳110004

目的探讨穿孔素（PFN）在重度子痫前期发病中作用。方法选择2007年12月-2009年6月在中国医科大学附属盛京医院产科住院分娩的重度子痫前期孕妇32例（重度子痫前期组）；选取同期健康孕妇32例作为健康妊娠组。应用逆转录（RT）PCR技术检... 详细信息

目的探讨穿孔素（PFN）在重度子痫前期发病中作用。方法选择2007年12月-2009年6月在中国医科大学附属盛京医院产科住院分娩的重度子痫前期孕妇32例（重度子痫前期组）；选取同期健康孕妇32例作为健康妊娠组。应用逆转录（RT）PCR技术检测两组孕妇外周血单个核细胞中PFNmRNA表达水平，并与平均动脉压进行相关性分析。免疫组化方法检测两组孕妇蜕膜组织中PFN蛋白的表达。结果（1）PFNmRNA表达：重度子痫前期组孕妇外周血单个核细胞中PFNmRNA表达水平为1．19±0．31，健康妊娠组为0．82±0．28，重度子痫前期组PFNmRNA表达水平明显高于健康妊娠组，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。（2）相关性分析：重度子痫前期组孕妇平均动脉压为（133±5）mmHg（1mmHg=0．133kPa），重度子痫前期组孕妇外周血单个核细胞中PFNmRNA表达水平与平均动脉压呈显著正相关（r=0．701，P=0．000）。（3）PFN蛋白表达：PFN蛋白主要表达于蜕膜组织淋巴细胞及蜕膜间质细胞的胞质中。重度子痫前期组孕妇PFN蛋白阳性表达率（84％，27／32）明显高于健康妊娠组（53％，17／32）。两组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论重度子痫前期孕妇外周血及蜕膜组织中PFN表达水平明显升高，PFNmRNA表达水平与平均动脉压呈显著正相关，提示PFN可能参与了重度子痫前期的发病过程。

关键词：穿孔素先兆子痫蜕膜白细胞,单核

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和穿孔素的克隆表达及抗菌活性研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和穿孔素的克隆表达及抗菌活性研究

作者：喻鑫婷安徽医科大学

学位级别：硕士

目的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人类常见的条件致病菌,金黄色葡萄球菌感染者往往病情较重、死亡率较高。近年来金黄色葡萄球菌的耐药率不断增高,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌... 详细信息

目的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人类常见的条件致病菌,金黄色葡萄球菌感染者往往病情较重、死亡率较高。近年来金黄色葡萄球菌的耐药率不断增高,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）的出现,导致临床治疗越来越困难,除了科学合理使用现有抗菌药物,寻求新的补充或替代策略是亟待解决的临床问题之一。20世纪80年代以来,为应对全球范围内抗菌素耐药的严峻形势,古老的噬菌体疗法再次引起研究者的关注,多项基础与临床研究显示了良好的应用前景,为耐药菌的治疗提供了新思路和新策略。除了传统的噬菌体疗法,以裂解酶为代表的噬菌体衍生物的研究也受到了广泛关注,拓展了噬菌体治疗的技术方法,提高了临床应用的可行性。在本课题组前期研究鲍曼不动杆菌噬菌体和肺炎克雷伯菌噬菌体及其解聚酶的基础上,以临床分离的一株多重耐药性金黄色葡萄球菌Sa35为宿主菌,从解放军总医院第五医学中心南院区未经处理的污水中分离到一株裂解性噬菌体IME522,对其裂解酶及穿孔素基因编码的蛋白进行预测和生物信息学分析、克隆表达和抗菌活性研究,为耐药性金黄色葡萄球菌感染的噬菌体相关治疗提供理论依据。方法以金黄色葡萄球菌噬菌体IME522为研究对象,首先使用Pfam数据库、NCBI保守域数据库（CDD）、Signal P 4.0 Server、CLC Genomics Workbench 3.6.1、TMHMM Server v.2.0等软件对ORF4进行生物信息学分析和功能预测。然后用PCR方法扩增噬菌体IME522的裂解酶（ORF4）基因,通过同源重组无缝克隆技术与PET-28a表达载体构建重组质粒。诱导裂解酶蛋白表达,SDS-PAGE与Western blot鉴定裂解酶分子大小,点板法初步验证裂解酶活性,亲和层析法纯化蛋白。对裂解酶进行体外杀菌实验,比较裂解酶对对数期与平台期细菌的杀菌能力,测定不同温度、p H值对裂解酶活性的影响,通过点板法测定裂解酶裂解谱,结晶紫染色和扫描电镜观察裂解酶对金黄色葡萄球菌Sa35生物被膜的清除能力,棋盘法测定裂解酶与万古霉素联合杀菌的最小抑菌浓度,时间杀菌试验测定裂解酶与万古霉素联合杀菌的速率,评估裂解酶对红细胞的溶血作用及对人体细胞的毒性作用。双链DNA噬菌体通常使用穿孔素-裂解酶（holin-endolysin）裂解系统来实现对细菌宿主的裂解。对编码穿孔素蛋白的基因进行预测,然后对穿孔素进行生物信息学分析、克隆及蛋白表达,测定穿孔素在诱导过程中对大肠杆菌BL21（DE3）生长速度与活力影响,Western blot验证穿孔素蛋白分子大小,点板法、涂板计数和刃天青染色测定穿孔素对金黄色葡萄球的抗菌作用,并对穿孔素与裂解酶的裂解谱进行比较。结果蛋白结构与功能分析裂解酶包括CHAP、酰胺酶两个催化结构域和一个SH3b结合结构域。重组裂解酶经过SDS-PAGE与Western blot验证其大小正确,并且可以在铺有金黄色葡萄球菌Sa35的双层琼脂平板上形成透明晕环,具有良好的抗菌活性,将该裂解酶被命名为LysP4。LysP4对金黄色葡萄球菌Sa35有很强的杀菌作用,可以减少对数期菌3 log CFU/m L,减少平台期细菌约2 log CFU/m L。LysP4在p H 5.0-10.0,温度16-40℃裂解活性较强。金黄色葡萄球菌Sa35生物被膜形成能力较强,结晶紫染色和扫描电镜观察到LysP4可以有效清除生物被膜而杀死细菌。LysP4对红细胞的溶血作用及对人体细胞的毒性实验表明,LysP4不会导致红细胞溶血,也不会对胚肾细胞、肺癌细胞的生长造成影响。LysP4与万古霉素联合杀菌结果显示最小抑菌浓度分别由单独作用的64μg/m L,2μg/m L降低为4μg/m L,0.5μg/m L,时间杀菌曲线表明协同杀菌效果更好,减少细菌数量4 log CFU/m L,而单独的LysP4（4μg/m L）只减少细菌数1 log CFU/m L,单独的万古霉素（0.5μg/m L）没有杀菌作用。蛋白结构分析穿孔素与穿孔素家族蛋白Phage＿holin＿1有很高同源性,存在2个疏水性跨膜结构区域,属于II类穿孔素。穿孔素在诱导表达时会导致大肠杆菌BL21（DE3）的生长停滞甚至裂解。点板法、刃天青染色、涂板计数验证穿孔素蛋白对金黄色葡萄球菌Sa35有裂解活性,将该穿孔素命名为HolP3。测定穿孔素HolP3和裂解酶LysP4的裂解谱,7种不同MLST分型（1、22、25、59、239、398、509）的金黄色葡萄球菌,只有239这一种MLST分型不能被裂解,其他6型均能裂解。10株伪中间型葡萄球菌,穿孔素裂解5株,裂解酶裂解10株。13株表皮葡萄球菌,穿孔素裂解8株,裂解酶裂解7株。穿孔素可以裂解血清型O16:H48的大肠杆菌,裂解酶不能裂解大肠杆菌。结论1.本研究以金黄色葡萄球菌噬菌体IM

关键词：金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶穿孔素

水稻白叶枯病菌OP2家族噬菌体X2的“穿孔素-内溶素”裂解系统鉴定及其功能研究

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

水稻白叶枯病菌OP2家族噬菌体X2的“穿孔素-内溶素”裂解系统鉴定...

作者：吴志峰浙江大学

学位级别：硕士

稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病害是水稻最重要的细菌性病害,威胁着水稻安全生产。噬菌体作为细菌在自然界的天敌,能够高效地裂解宿主细菌,这为水稻白叶枯病的绿色防控提供了新途径。目... 详细信息

稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病害是水稻最重要的细菌性病害,威胁着水稻安全生产。噬菌体作为细菌在自然界的天敌,能够高效地裂解宿主细菌,这为水稻白叶枯病的绿色防控提供了新途径。目前噬菌体的溶菌机制多认为与其裂解系统紧密相关,主要依靠内溶素和穿孔素这两个关键蛋白来完成对细菌的裂解,但不同噬菌体的裂解机制也存在差异,例如大部分噬菌体的内溶素转运输出需依赖穿孔素,但在某些情况下,内溶素也可依靠自身的跨膜结构独立完成转运输出,这些现象揭示了噬菌体裂解机制的多样性和复杂性。虽然近年来越来越多的白叶枯病菌噬菌体被分离和特征化,但整体上对其裂解系统及其机制仍缺乏足够了解。本论文在实验室前期成功分离并鉴定水稻白叶枯病菌OP2家族噬菌体X2的基础上,开展了“穿孔素-内溶素”裂解系统的鉴定及其作用机制研究,取得了以下主要结果:首先,我们成功鉴定和特征化了水稻白叶枯病菌OP2家族噬菌体X2的“穿孔素-内溶素”裂解系统。在前期测定噬菌体X2基因组的基础上,生物信息学分析发现噬菌体X2存在编码裂解相关蛋白X2-Lys(内溶素)和X2-Hol(穿孔素)的序列,X2-Lys的保守功能域分析显示其属于类内溶素蛋白的超家族成员,蛋白跨膜结构和信号肽预测显示该蛋白不存在跨膜结构域和信号肽,暗示其需要穿孔素的帮助以分泌到细胞周质;X2-Hol的跨膜结构域预测结果显示其包含两个跨膜结构域,N端和C端均位于细胞膜外,具有II型穿孔素的典型特征;原核表达结果显示单独表达X2-Lys和X2-Hol能抑制细菌生长,细菌在600 nm处的光密度值(Optical density,OD)分别减少3.8%和10.3%,而共表达X2-Lys和X2-Hol严重抑制细菌生长(OD减少70.0%)。电子显微镜观察结果显示单独和共同表达X2-Lys和X2-Hol的菌株形态均会发生变化,单独表达时细菌分别从短杆状变为球状和长杆状,而共表达菌株的细胞膜出现皱缩,胞内物质密度降低,菌株颜色明显变浅;β-半乳糖苷酶活性检测也显示共表达菌株比单独表达菌株呈现更显著的颜色变化,说明了对细胞膜更加严重的破坏。总之,上述生物信息学和生物学实验结果明确了噬菌体X2采用经典的“穿孔素-内溶素”双组份系统来执行裂解功能。其次,我们阐明了噬菌体X2内溶素X2-Lys和穿孔素X2-Hol的作用机制。通过Ni-NTA树脂纯化X2-Lys蛋白,蛋白质免疫印迹结果显示为单一条带,表明得到了纯化的X2-Lys蛋白;X2-Lys表现出体外溶菌效果,可使细菌数量在15分钟之内减少约40.9%,可能的机制是内溶素在外膜通透剂的帮助下,可与肽聚糖结构域直接接触,导致细菌的裂解;通过提取重组菌株28a-Hol的膜蛋白,蛋白质免疫印迹结果显示存在单一的条带,说明穿孔素X2-Hol定位于膜上,膜上的X2-Hol条带大小约为细胞质中穿孔素单体的2倍,结合上述“穿孔素-内溶素”双组份系统的特征化结果,推断穿孔素X2-Hol可能在膜上形成二聚体,进而形成孔洞,促进内溶素X2-Lys穿过细胞内膜,来发挥其水解细菌肽聚糖层的作用。最后,我们发现跨膜结构域(Transmembrane domain,TMD)在内溶素跨内膜转运中具有重要的功能。实验室前期的研究表明,TMD通过Sec分泌系统促进内溶素的易位;我们通过基因工程在内溶素X2-Lys上加了一段TMD,发现TMD也可以帮助X2-Lys不依赖穿孔素实现裂解细菌,提高内溶素X2-Lys的释放效率,导致细菌有效的裂解(12 h细菌OD减少50.8%);此外,在大肠杆菌中表达穿孔素蛋白或者有TMD的内溶素均会引起细菌的形态变化,导致了菌体细胞变长,而单独表达不带TMD的内溶素却不会。由此我们推断TMD在裂解系统中可能具有双重功能:一个是跨膜转运,另一个是抑制细胞分裂。本研究在鉴定OP2家族噬菌体“穿孔素-内溶素”裂解系统的基础上,解析了其裂解水稻白叶枯病菌的机制,发现同一种内溶素可以同时通过依赖穿孔素和非依赖穿孔素的机制输出,丰富了噬菌体的裂解机制,对于噬菌体在水稻细菌病害防控上的应用也有着重要的意义。

关键词：噬菌体裂解系统内溶素穿孔素跨膜结构域双重功能