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西洋参种子休眠解除与萌发分子机理研究

西洋参种子休眠解除与萌发分子机理研究

作者：孙同玉北京协和医学院

学位级别：硕士

西洋参为多年生草本植物,具有广泛的药理活性和药用价值。西洋参主要通过种子繁殖,但种子具有深度休眠的特性,需要温度层积解除休眠。目前西洋参种子休眠与萌发的分子机制尚不明确。赤霉素和脱落酸是调控种子休眠与萌发的关键激素。为... 详细信息

西洋参为多年生草本植物,具有广泛的药理活性和药用价值。西洋参主要通过种子繁殖,但种子具有深度休眠的特性,需要温度层积解除休眠。目前西洋参种子休眠与萌发的分子机制尚不明确。赤霉素和脱落酸是调控种子休眠与萌发的关键激素。为研究其作用规律,本研究采用6种生长调节剂（赤霉素GA3、赤霉素GA4+7、脱落酸、氟啶酮、多效唑、烯效唑）处理西洋参种子。阴干种子进行高温20℃层积、裂口种子低温4℃层积,每隔30d取样计算胚率;在形态休眠初期、中期、解除期、生理休眠初期、中期、解除期分别取样,用酶联免疫法（ELISA）检测其内源激素GA和ABA含量。研究发现GA3、GA4+7可以缩短生理后熟时间,且处理后生理休眠期内源ABA含量低于对照组。通过分析转录组数据,对125个与植物激素代谢和休眠解除与萌发相关的基因进行半定量PCR,其中23个基因表现出良好的特异性,在种子层积初期（0d）表达量较低或不表达。筛选出与激素和休眠解除相关基因10个（NCED、ZEP、DELLA、 GIGANTE、GA2ox、GA20ox、GA3ox、KAO、CYP707A、DRM）进行荧光定量PCR。研究发现GA合成关键基因GA20ox、GA3ox、KAO在生理后熟期的表达高于形态后熟期,GA3、GA4+7处理后GA合成基因表达量低于对照组。对西洋参种子中GA分解代谢基因PqGA2ox和GA合成关键基因PqGA20ox进行克隆与序列分析,获得GenBank登陆录号KJ802836和KJ740524,生物信息学分析显示既无跨膜区又无信号肽。本实验通过分析多个植物激素GA、ABA代谢关键基因和种子休眠解除与萌发相关基因的表达情况,为研究西洋参种子休眠与萌发的分子机理奠定基础。

关键词：西洋参种子休眠与萌发激素基因表达克隆

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珍稀植物青檀种子休眠与萌发的研究

生物学杂志 2007年第1期24卷 28-31页

作者：张兴旺操景景龚玉霞张小平安徽师范大学生命科学学院高校生物环境与生态安全省级重点实验室芜湖241000

为了探讨和研究青檀种子休眠和萌发特性,采用石蜡切片法、生物鉴定(白菜籽发芽实验)法、赤霉素溶液浸种、以及赤霉素与低温层积相结合等方法,寻找引起青檀种子休眠的原因和解除休眠的最佳措施。结果表明:青檀种子本身含有发芽抑制物和... 详细信息

为了探讨和研究青檀种子休眠和萌发特性,采用石蜡切片法、生物鉴定(白菜籽发芽实验)法、赤霉素溶液浸种、以及赤霉素与低温层积相结合等方法,寻找引起青檀种子休眠的原因和解除休眠的最佳措施。结果表明:青檀种子本身含有发芽抑制物和存在生理后熟是引起休眠的2个主要原因,用质量浓度为300mg/L的赤霉素溶液浸种24h或低温层积后用赤霉素处理均能在一定程度上解除休眠促进萌发,其中以低温层积25d后用500mg/L的赤霉素浸种36h效果最好。发芽率和发芽势分别达到83.5%和65%。

关键词：青檀种子休眠与萌发赤霉素生理后熟

芍药种子休眠与萌发相关基因PlPP2C的克隆及遗传转化

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芍药种子休眠与萌发相关基因PlPP2C的克隆及遗传转化

作者：麻永磊沈阳农业大学

学位级别：硕士

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属的草本花卉,既是我国的传统名花,同样又是十分具有特色的园林造景植物。芍药种子具有典型的上、下胚轴双重休眠的特性,这种休眠特性使其在种子繁殖过程中,经常会因为不能打破休眠而导致萌... 详细信息

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属的草本花卉,既是我国的传统名花,同样又是十分具有特色的园林造景植物。芍药种子具有典型的上、下胚轴双重休眠的特性,这种休眠特性使其在种子繁殖过程中,经常会因为不能打破休眠而导致萌发率低,种子繁殖的生长周期过长,为实际生产带来很大障碍,尤其是对新品种选育和杂交育种工作造成很大困难。本研究以芍药品种(♂粉玉楼×♀粉玉奴)的杂交种子为试材,选取种子萌发过程中四个关键时期进行转录组测序,通过分析转录组数据,筛选得到调控芍药种子休眠与萌发的基因PlPP2C,克隆获得了该基因的cDNA全长序列,并对其进行了生物信息学分析及其在种子萌发过程中的表达模式分析、构建了植物表达载体、通过花序浸染法对拟南芥进行遗传转化,为揭示该基因在芍药种子萌发的过程中所起的作用奠定基础。主要研究结果如下:1.通过分析转录组数据,找出脱落酸信号转导途径中调控种子休眠与萌发的相关基因PlPP2C。以转录组测序得到的CDS序列为依据设计引物,通过PCR技术克隆得到芍药种子PlPP2C基因。PlPP2C基因ORF序列全长1233bp,编码410个氨基酸,氨基酸序列含有PP2Cs基因特征序列FFGVYDGHG及保守结构域,属于PP2Cs基因家族。氨基酸序列同源性比对发现,PlPP2C基因与川桑(Morus notabilis)、葡萄(Vitis vinifera)、巨桉(Eucalypyptus grandis)、榴莲(Durio zibethinus)等植物的同源性较高。系统发育树显示,PlPP2C基因与拟南芥AHG1亲缘关系最近。PlPP2C基因编码的蛋白分子量为45kDa,理论等电点5.04,是一个疏水性不稳定蛋白,不具有跨膜结构,定位于细胞核上。2.通过实时荧光定量的方法,分析了PlPP2C基因在芍药种子发育过程中四个关键时期的表达情况,结果显示,PlPP2C基因在下胚轴萌发(露白)阶段表达量最高,而在种子吸胀前的表达量最低,推测该基因可能通过调控种子中ABA的含量而促进其萌发。3.构建了PlPP2C基因的植物表达载体,命名为pBI121-PP2C,并通过冻融法将构建成功的植物表达载体转化到农杆菌GV3101中。种植了野生型拟南芥并收获种子,采用农杆菌介导的花序浸染法对野生型拟南芥植株进行了遗传转化,并收获T代种子,通过抗生素筛选获得了抗性植株。

关键词：芍药种子休眠与萌发 PlPP2C基因拟南芥遗传转化

OsMYB3调控水稻种子休眠与萌发初步研究

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OsMYB3调控水稻种子休眠与萌发初步研究

作者：邱文怡浙江师范大学

学位级别：硕士

萌发是种子打破休眠期进入连续生长状态,并开始进行新的遗传程序（基因转录与表达）和物质同化能量代谢的过程。这一过程是否能够顺利进行对于保证种群顺利繁衍和进化,具有非常重要的生物学意义。大多数植物的种子在收获后会经过一段时... 详细信息

萌发是种子打破休眠期进入连续生长状态,并开始进行新的遗传程序（基因转录与表达）和物质同化能量代谢的过程。这一过程是否能够顺利进行对于保证种群顺利繁衍和进化,具有非常重要的生物学意义。大多数植物的种子在收获后会经过一段时间休眠才能萌发,这现象被称为是种子的休眠特性。种子休眠性是作物重要的农艺性状,与作物的品质和产量息息相关。低休眠的种子容易出现穗发芽,高休眠的种子又会造成播种季节的低萌发率,因此种子的最佳休眠水平对农业生产至关重要。种子的穗发芽既受遗传控制,又受环境（例如高温、高湿）影响,其调控的分子机制仍不清楚。因此通过遗传学、分子生物学等方法解析种子休眠与萌发的分子机制,为作物穗发芽的防控和耐穗芽种质资源的创制提供基础,这将成为未来解决作物穗发芽问题的关键。我们实验室前期通过RNA-seq的方法获得了在灌浆期受高温抑制的转录因子OsMYB3,OsMYB3是编码植物MYB类的转录因子。本实验前期利用组成型表达的Ubi启动子驱动OsMYB3基因获得纯合的超表达材料、以及利用双链RNAi干扰的手段获得OsMYB3基因的纯合RNAi材料。本论文在此基础上开展了对该基因的功能研究,并取得了以下研究进展:1.无论大田或者温室高湿条件处理下,超表达植株收获的种子会出现明显穗发芽表型,而RNAi材料的穗发芽率与野生型没有明显差异。2.利用CISPR/Cas9基因编辑的方法获得了OsMYB3的功能缺失的纯合突变体myb3-1材料。对myb3-1,RNAi和超表达材料新鲜收获的种子及打破休眠后后熟的种子分别进行种子萌发实验,结果发现:突变体myb3-1和RNAi的种子萌发速率均明显低于野生型（日本晴）,而超表达材料成熟种子萌发速率则明显高于野生型,表明该基因可能正向调控种子的萌发。3.本实验室前期的研究结果表明OsMYB3基因的表达受节律调控且在发育的种子有高表达,本论文中,我们对种子不同萌发时期的基因表达进行了检测,结果显示:OsMYB3在种子萌发的过程中诱导表达。4.淀粉水解酶基因是种子萌发标记基因,本研究中,我们对野生型、myb3-1和超表达种子萌发不同时期的α-淀粉水解酶基因表达进行了检测,结果显示OsMYB3的存在能促进部分淀粉水解酶AMY1A、AMY1C、AMY3C等基因的表达,进一步表明OsMYB3可能正向调控种子的休眠与萌发过程。5.ABA和GA是参与种子休眠与萌发调控的两种最重要的激素,利用ABA和GA分别处理萌发期的种子,结果发现myb3-1突变体种子的萌发对GA不敏感、超表达种子的萌发对GA超敏感,而上述种子的萌发对ABA的敏感性没有明显差异,表明OsMYB3基因可能是通过GA信号途径来调控种子的休眠与萌发。6.本实验室前期的研究表明,OsMYB3蛋白没有转录激活功能,本论文中,我们利用酵母双杂的方法,在水稻胚乳cDNA文库中筛选OsMYB3的互作蛋白,激酶SnRK1A为其中一个能与其互做的蛋白。同时我们又筛选了水稻的转录因子库,筛选到2个与OsMYB3互做的蛋白。7.过去的研究表明,激酶SnRK1A参与低糖诱导的种子萌发途径,本研究中,我们未能在原生质体中检测到OsMYB3的表达受低糖诱导或高糖抑制,因此无法确定该基因是否参与低糖介导的种子萌发。8.利用Dual-LUC系统,我们在原生质体中同时表达了OsMYB3和SnRK1A,结果显示OsMYB3单独存在时可明显增强淀粉水解酶α-AMY1A驱动的报告基因的表达,但SnRK1A蛋白加入后,这种增强效果明显被抑制,推测SnRK1A可能会抑制OsMYB3转录激活功能,但确切的调控机制还需要进一步验证。综上,我们推测OsMYB3是种子萌发过程中的正调控因子,OsMYB3可能通过GA信号途径正调控淀粉水解酶基因的表达来调控种子的萌发。激酶SnRK1A能与OsMYB3相互作用,OsMYB3与激酶的互做抑制了该基因参与的转录激活功能,推测该基因的磷酸化会抑制其编码蛋白的活性。OsMYB3是通过什么分子途径促进种子萌发、OsMYB3直接结合的下游靶基因是什么、磷酸化和糖信号在OsMYB3介导的种子萌发中起何作用,等等问题都需要进一步用实验证实。未来我们将通过遗传学、分子生物学等方法解析OsMYB3参与种子休眠与萌发的分子机制,为作物穗发芽的防控和耐穗芽种质资源的创制提供基础。

关键词：种子休眠与萌发穗发芽 GA信号途径分子机制

芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建

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北京林业大学学报 2023年第7期45卷 120-129页

作者：费日雯樊富伟孙天祎辛如洁宋文慧关士鑫孙晓梅沈阳农业大学园艺学院辽宁沈阳110866 沈阳农业大学林学院辽宁沈阳110866

【目的】芍药具有极佳的观赏价值,但其种子的双重休眠难以解除,严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库,可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库... 详细信息

【目的】芍药具有极佳的观赏价值,但其种子的双重休眠难以解除,严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库,可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库的构建可为丰富芍药种子休眠调控研究提供科学支撑,能为芍药栽培育种和野生资源保护及利用奠定分子理论基础。【方法】本研究以休眠解除过程中5个关键时期的芍药种子为试验材料,进行总RNA的提取和m RNA的分离,使用gateway方法构建cDNA初级文库,再通过LR重组,将初级文库重组到pGADT7-DEST次级文库载体上,构建出次级文库,最后经过酵母转化试验,将次级文库质粒转化到酵母Y187感受态细胞中,构建出芍药种子休眠解除过程的酵母文库。【结果】经鉴定,cDNA初级文库库容量为1.28×10^(7) CFU,平均插入片段长度在1000 bp以上,重组率为100%;cDNA次级文库库容量为1.12×10^(7) CFU,平均插入片段长度在1000 bp以上,重组率为100%;酵母文库滴度为7.0×10^(7) CFU/mL,平均插入片段长度在1000 bp以上,重组率为96%。23个阳性克隆测序结果经NCBI比对后,按照功能将20个已知蛋白序列划分为8类,其中7个序列已被报道参与种子的休眠与萌发。【结论】芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建的质量较高,具有较完整的基因信息,符合酵母文库筛选试验所需的标准,为构建芍药种子休眠解除过程的分子调控网络提供基础。

关键词：芍药种子休眠与萌发酵母杂交 cDNA文库 gateway技术

细胞分裂素调控种子发育、休眠与萌发的研究进展

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植物学报 2021年第2期56卷 218-231页

作者：宋松泉刘军杨华张文虎张琪高家东中国科学院植物研究所北京100093 广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室/广东省农业科学院农业生物基究中心广州510640 湖南农业大学生物科学与生物技术学院长沙410128

种子萌发是子代植株建立、生长和繁育的重要阶段,在种子植物生命周期中起重要作用。种子休眠是在发育过程中形成的,在生理成熟期达到峰值。种子休眠与萌发的植物激素调控可能是种子植物中一种高度保守的机制。细胞分裂素(CK)是植物体内... 详细信息

种子萌发是子代植株建立、生长和繁育的重要阶段,在种子植物生命周期中起重要作用。种子休眠是在发育过程中形成的,在生理成熟期达到峰值。种子休眠与萌发的植物激素调控可能是种子植物中一种高度保守的机制。细胞分裂素(CK)是植物体内的一种重要信号分子,调控植物生长发育的许多方面。生物活性CK的水平由其生物合成、活化、失活、再活化和降解之间的平衡所调控,种子的发育、休眠与萌发受生物活性CK的水平和信号转导途径调控。该文综述了CK的生物合成与代谢、信号转导以及对种子发育、休眠与萌发的调控作用,提出了在本领域需要进一步研究的科学问题,旨在为理解CK调控种子发育、休眠与萌发的分子机理提供参考。

关键词：细胞分裂素代谢分子机制种子休眠与萌发信号转导

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北京地区流苏及鸡麻种子的休眠与萌发研究

种子 2007年第7期26卷 29-31页

作者：李锐丽徐本美孙运涛郭琛孙超北京林业大学北京100083 中国科学院植物研究所北京100093

按A.W.Crocker与L.V.Borton(1959)提出的概念,凡是在苗圃条件下,犹如在自然条件下成熟后的第2个春季来临之前不出苗的种子,通称为二年种子(two years seed)[9]。鸡麻和流苏属两年种子的范畴。实验表明,第1年秋(11月底)种子经处理后砂藏,... 详细信息

按A.W.Crocker与L.V.Borton(1959)提出的概念,凡是在苗圃条件下,犹如在自然条件下成熟后的第2个春季来临之前不出苗的种子,通称为二年种子(two years seed)[9]。鸡麻和流苏属两年种子的范畴。实验表明,第1年秋(11月底)种子经处理后砂藏,第2年春(4月初)种子在砂藏中少量发芽,播入地里后第3年春出苗。相比之下经酸蚀处理加催芽剂的种子出苗率最高,其次为酸蚀种子,对照种子出苗率最低。

关键词：鸡麻流苏种子休眠与萌发二年种子

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濒危植物永瓣藤种子休眠与解除

种子 2012年第3期31卷 17-19,22页

作者：潘健郭起荣方乐金张建伟黄山学院安徽黄山245041 国际竹藤中心北京朝阳100102

永瓣藤(Monimopetalum chinense Rehd)为我国特有的单种属植物,国家二级稀有濒危保护树种,其种子具休眠特性。测定了永瓣藤种子千粒质量、含水量、吸水率和种子生活力等指标,分别采用层积、酸蚀和GA3处理种子,分析不同处理对种子萌发的... 详细信息

永瓣藤(Monimopetalum chinense Rehd)为我国特有的单种属植物,国家二级稀有濒危保护树种,其种子具休眠特性。测定了永瓣藤种子千粒质量、含水量、吸水率和种子生活力等指标,分别采用层积、酸蚀和GA3处理种子,分析不同处理对种子萌发的影响。结果表明:永瓣藤种子千粒重为(4.504 8±0.055 8)g,含水率为13.18%±1.84%,吸水率为29.95%±1.58%,种子生活力为94.25%±0.017 1%,种子萌发实验的发芽率为0;层积时间对种子萌发影响不显著,最高仅为2.67%±1.53%,种子经50%H2SO4处理20 min的发芽率为18.00%±3.46%,种子经250 mg/L GA3处理24 h然后再经室内层积75 d,发芽率达到72.67%±7.02%,对照仅为1.67%±1.15%,永瓣藤种子休眠首次有效破除。永瓣藤种子休眠可能与种皮障碍有关,种子内可能存在活性较强的内源抑制物质是引起种子休眠的重要原因,GA3处理能有效解除其种子休眠。

关键词：永瓣藤种子休眠与萌发酸蚀处理赤霉素层积

芍药种子下胚轴休眠与萌发相关调控基因PlGAI1的克隆及功能分析

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芍药种子下胚轴休眠与萌发相关调控基因PlGAI1的克隆及功能分析

作者：崔金秋沈阳农业大学

学位级别：硕士

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属的多年生宿根草本花卉,其良好的观赏特点和极高的切花品质逐渐被世界上越来越多的人们赏识,市场需求极高。但芍药种子有上、下胚轴双重休眠的特性,其生长周期过长,在实际生产中有很大障碍... 详细信息

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属的多年生宿根草本花卉,其良好的观赏特点和极高的切花品质逐渐被世界上越来越多的人们赏识,市场需求极高。但芍药种子有上、下胚轴双重休眠的特性,其生长周期过长,在实际生产中有很大障碍,尤其是对新品种选育和杂交育种工作产生了巨大的影响。本研究以母本为芍药品种‘粉玉奴’,父本为芍药品种‘粉玉楼’的杂交种子为试验材料。选取沙藏0d(PDB,下胚轴萌发前)和沙藏40d(PDA,下胚轴萌发后的露白种子)的种子为试验材料,利用转录组学技术分析芍药种子下胚轴萌发前后的基因表达差异。找到差异表达基因中与下胚轴休眠与萌发相关的关键基因,并进行克隆及原核表达分析。试验中主要的结果如下：1.转录组测序共得到120181964条Unigene序列,从PDB种子的RNA中获得了58107876条Unigene序列,从PDA种子的RNA中获得了6274088条Unigene序列。序列经过滤后共获得107929718条clean reads。本研究采用de novo方法,对测序数据进行了拼接,共获得123577个contig,其中大于2kb的有13360个。2.经过blast比对,共有34284条Unigenes序列得到Nr、Nt、SwissProt、 PFAM、GO、KOG、KEGG数据库的基因功能注释,占所有Unigenes总量的50.37%。通过KEGG注释后获得Pathway注释信息,其中包括与植物种子萌发相关的植物激素信号转导(ko04075)通路信息。在比对上Nr、SwissProt、 KEGG和KOG等7个数据库的序列中,对其中的30803个序列进行了编码蛋白框(CDS)的预测,其中有8203个基因预测氨基酸长度大于300,占26.6%所预测的基因,有745个基因预测的氨基酸长度超过1000,占2.42%所预测的基因。3.PDA样品相对于PDB样品有1794个差异基因,其中上调表达的差异基因有834个,下调表达的差异基因有960个。对差异表达基因进行了GO功能显著性富集、Pathway显著性富集分析,选取植物激素信号转导通路(ko04075)作为主要研究对象,它涉及赤霉素、脱落酸、生长素、细胞分裂素、乙烯等多种激素调节途径,植物萌发及生长发育多与激素的调节有着密不可分的关系,故我们锁定这个通路作为研究对象。在此通路中,与生长发育相关的ARF、GAI1、BRI1、JAZ基因都有差异表达,并对这些基因做了qRT-PCR验证,结果与FPKM分析结果相一致。4.本研究成功从芍药种子cDNA中扩增得到GAI1基因的ORF序列。经分析GAI1基因编码的蛋白质的分子量为60.44kDa,理论等电点为4.93。预测其为疏水性蛋白,不属于跨膜蛋白,是非分泌蛋白,其编码的蛋白很可能在叶绿体或者细胞核中。5.通过原核表达验证了PlGAI1蛋白在大肠杆菌中的表达。结果显示该基因能在大肠杆菌中明显表达,这为以后的研究提供了理论和实践依据,为后续对该蛋白的研究奠定了坚实的基础。

关键词：芍药转录组 DELLA蛋白GAI1基因种子休眠与萌发原核表达