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硬紫草细胞悬浮培养和紫草宁及其衍生物的形成

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生物工程学报 1994年第1期10卷 76-80页

作者：宁文曹日强南京大学生物系南京210008

硬紫草细胞悬浮培养形成紫草宁及其衍生物时,细胞生长曲线呈扁平的S形。细胞停止生长后,紫草宁及其衍生物大量形成,二者的动态变化呈负相关。测定了此过程中培养液的无机元素和可溶性糖含量、溶氧、pH值以及细胞形态的变化情况,可作为... 详细信息

硬紫草细胞悬浮培养形成紫草宁及其衍生物时,细胞生长曲线呈扁平的S形。细胞停止生长后,紫草宁及其衍生物大量形成,二者的动态变化呈负相关。测定了此过程中培养液的无机元素和可溶性糖含量、溶氧、pH值以及细胞形态的变化情况,可作为硬紫草细胞大规模培养的参考。

关键词：硬紫草悬浮培养紫草宁衍生物

硬紫草悬浮细胞原生质体培养形成愈伤组织及其体细胞克隆变异

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植物生理学报（0257-4829) 1996年第3期22卷 243-250页

作者：刘培卫志明许智宏褚晓明曹日强中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室南京大学生物系

从硬紫草悬浮细胞系ＡＲ１２６分离原生质体，只有用葡萄糖作渗透剂经琼脂糖－液体双层培养才能获得可见的原生质体克隆，从中选择３４个克隆，用两阶段法生产紫草素及其衍生物，测量了它们在两阶段的细胞生长量及生产阶段的色素含量，... 详细信息

从硬紫草悬浮细胞系ＡＲ１２６分离原生质体，只有用葡萄糖作渗透剂经琼脂糖－液体双层培养才能获得可见的原生质体克隆，从中选择３４个克隆，用两阶段法生产紫草素及其衍生物，测量了它们在两阶段的细胞生长量及生产阶段的色素含量，并比较了其分布规律，其中最好的原生质体克隆色素生产量是起始悬浮系的２．５４倍，经培养４０ｄ达４４．０６ｍｇｇ－１ＦＷ，而且其生产量在所测的８０ｄ内无明显下降。

关键词：硬紫草原生质体培养克隆变异体细胞

硬紫草8-HGO酶基因的克隆及转基因功能初步研究

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硬紫草8-HGO酶基因的克隆及转基因功能初步研究

作者：王昭月南京大学

学位级别：硕士

紫草宁及衍生物(后统称紫草宁)是紫草根部的红色提取物,主成分为萘醌类。不仅能用于治疗创伤、烧伤、痔疮等皮肤性疾病,还具有抗炎杀菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。因此,提高紫草宁产量有很大的市场价值和应用前景,而其合成及调控的机制研... 详细信息

紫草宁及衍生物(后统称紫草宁)是紫草根部的红色提取物,主成分为萘醌类。不仅能用于治疗创伤、烧伤、痔疮等皮肤性疾病,还具有抗炎杀菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。因此,提高紫草宁产量有很大的市场价值和应用前景,而其合成及调控的机制研究是一重大突破口。紫草宁生物合成上游的两条主要途径——甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径和苯丙素类(Phenylpropanoids,PP)途径目前已基本明确,但合成下游的部分反应尚不清楚,尤其是3-羟基对苯二酚香叶醌向紫草宁转化所涉及到的反应机制。本课题组前期的转录研究中发现一个基因——8-HGO,其在紫草生长培养基B5中表达量低,但在紫草宁合成培养基M9中高表达。大量文献表明,8-HGO编码的8-羟香叶醇脱氢酶(8-hydroxygeraniol dehydrogenase,8-HGO),在许多次生代谢产物的环烯醚萜合成途径中发挥关键脱氢作用。因此,本实验试图克隆该基因并解析8-HGO在紫草宁合成调控中的功能。基于硬紫草的转录组测序结果,我们获得8-HGO的原始c DNA序列,利用生信软件分析8-HGO的蛋白理化性质,预测其蛋白二三级结构。结果显示:8-HGO的全长ORF为1083bp,可编码360个氨基酸,属于中链锌依赖的醇脱氢酶。我们通过设计引物、克隆目的基因,并以p BI121-e GFP质粒为载体,构建过表达和RNAi载体并导入发根农杆菌ATCC15834中,侵染外植体以诱导得到硬紫草的过表达转基因毛状根(8-HGO-O,HO)、RNAi转基因毛状根(8-HGO-RNAi,Hi)、转p BI121-e GFP质粒的毛状根(Empty vector,EV)三种,每种不少于6个株系。收集并提取M9培养液和毛状根中的紫草宁并测定OD值以计算紫草宁含量,利用HPLC检测各类毛状根产物成分,此外,检测目的基因和相关调控基因的表达量以进一步探究8-HGO的功能。为了验证毛状根,首先,通过PCR检测到各株毛状根中的rol C、GFP基因,接着用激光共聚焦显微镜观察,发现EV和HO、Hi的转基因毛状根均有荧光,进一步证明已成功得到8-HGO转基因毛状根,为探究8-HGO在紫草重要次生代谢物的合成与调控提供尤为关键且重要的实验材料。HO、Hi和EV毛状根在M9培养液中培养6d,肉眼观察到HO毛状根所在的溶液紫色最深,Hi和EV颜色相近。HPLC图谱表明,M9培养液中毛状根分泌的主产物为紫草宁和乙酰紫草宁。q PCR结果显示,相比于EV,8-HGO表达量在HO高表达,在Hi-8中被抑制,表明HO系列毛状根效果明显,且Hi-8的干扰效果可行。计算并比较毛状根中紫草宁含量,发现8-HGO过表达可提高紫草宁含量,表明其可能参与调控紫草宁的合成。但紫草宁合成相关基因表达的初步结果显示,8-HGO对PGT、PAL和HMGR的基因表达影响较小。综上,从多方面初步探测8-HGO的功能,为紫草次生代谢的调控研究提供了必要的先行实验和理论,但具体机制还需要进行更多的实验来探究。

关键词：硬紫草 8-HGO 转基因毛状根紫草宁合成

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硬紫草质量评价研究

硬紫草质量评价研究

作者：辛玲黑龙江中医药大学

学位级别：硕士

紫草(Lithospermum erythrorhizon *** Zucc),别名硬紫草,药用其根部具有凉血、活血、解毒透疹的作用。主要分布在东北,资源丰富。其主要成分为具有5,8-二羟基萘醌结构的萘醌色素。由于萘醌色素对光、热敏感,故本研究采用CO超临界流体... 详细信息

紫草(Lithospermum erythrorhizon *** Zucc),别名硬紫草,药用其根部具有凉血、活血、解毒透疹的作用。主要分布在东北,资源丰富。其主要成分为具有5,8-二羟基萘醌结构的萘醌色素。由于萘醌色素对光、热敏感,故本研究采用CO超临界流体萃取法(SFE)在高压常温下提取硬紫草根中的萘醌类化合物,利用硅胶柱层析法,以石油醚-乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱,利用制备HPLC法,以甲醇-水为溶剂系统进行洗脱,从CO超临界提取物中分离得到5个单体化合物,通过理化性质、UV、IR、MS、NMR数据的解析,确定了5个化合物的结构:紫草素(shikonin),乙酰紫草素(acetylshikonin),β-羟基异戊酰紫草素(β-hydroxy-isovalerylshikonin),异丁酰紫草素(isobutylshikonin),异戊酰紫草素(isovalerylshikonin)。同时,本研究以紫草素,乙酰紫草素,β-羟基异戊酰紫草素,异丁酰紫草素,β,β-二甲基丙烯酰紫草素,异戊酰紫草素6种成分为指标,建立了基于HPLC-DAD方法的硬紫草中多组分同时定量的方法。经方法学考察,精密度试验的RSD在0.78～1.4%之间,表明仪器精密度良好;重现性试验中6种萘醌类化合物含量测定结果的RSD在0.39～1.7%之间,表明方法的重复性较好;6种萘醌类化合物的加样回收率在97.0～102.9%之间,表明整个方法具有良好的准确度;样品溶液在24h内稳定。结果表明,该方法简便、准确、重复性好。并依据此法对不同产地的硬紫草进行质量评价,确定下洼子产硬紫草为最佳药材。为今后建立紫草质量评价体系提供了科学依据,奠定了坚实的基础。

关键词：硬紫草萘醌色素结构鉴定 HPLC 含量测定

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硬紫草细胞培养色素形成的动力学研究

植物学报 1992年第S1期39卷 95-96页

作者：宁文曹日强南京大学生物系南京210008

紫草为我国传统中药,最早收录于《神农本草经》,根部入药。其有效成分为紫红色的萘醌类衍生物的复合物(紫草色素)。它具有抗菌、消炎、抗肿瘤等作用,是具有药用价值的天然色素,在医药、印染、化妆品及食品工业上有广泛的应用前景。借助... 详细信息

紫草为我国传统中药,最早收录于《神农本草经》,根部入药。其有效成分为紫红色的萘醌类衍生物的复合物(紫草色素)。它具有抗菌、消炎、抗肿瘤等作用,是具有药用价值的天然色素,在医药、印染、化妆品及食品工业上有广泛的应用前景。借助细胞培养技术生产紫草色素,是开发紫草资源的新途径。1983年日本已将硬紫草细胞培养工业化生产,1984年便有紫草色素产品投放市场。本文测定了硬紫草细胞培养色素形成过程中细胞生长、产物(色素)

关键词：硬紫草细胞培养紫草色素色素形成细胞生长产品投放市场神农本草经萘醌类静止期指数生长期

硬紫草LeHMGR基因的cDNA克隆及过表达毛状根的诱导

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硬紫草LeHMGR基因的cDNA克隆及过表达毛状根的诱导

作者：张东霞南京大学

学位级别：硕士

紫草科植物如新疆紫草、滇紫草和硬紫草的根部可合成一类萘醌类化合物-紫草宁及其衍生物,该类化合物具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗HIV等活性。尽管目前紫草宁及其衍生物的生物合成途径已经基本清楚,并且已分离、克隆得到许多相关代谢酶的... 详细信息

紫草科植物如新疆紫草、滇紫草和硬紫草的根部可合成一类萘醌类化合物-紫草宁及其衍生物,该类化合物具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗HIV等活性。尽管目前紫草宁及其衍生物的生物合成途径已经基本清楚,并且已分离、克隆得到许多相关代谢酶的基因,然而,紫草宁及其衍生物的合成受到诸多影响因子的调控,如光信号、植物激素、无机元素、真菌诱导子等,这些因素对紫草宁及其衍生物合成调控的分子机制尚不清楚,有待进一步研究。紫草宁及其衍生物是首先由苯丙素类(phenylpropanoid)代谢途径形成对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, PHB)和由甲羟戊酸(mevalonate acid, MVA)代谢途径形成焦磷酸香叶酯(geranylpyrophosphate, GPP)这两种重要的中间前体,然后在对羟基苯甲酸香叶基转移酶(p-hydroxybenzoate:geranyltransferase, PGT)的催化作用下形成香叶基-对羟基苯甲酸(m-geranyl-p-hydroxybenzoic acid, GBA),再经过其它代谢酶的级联反应后形成的。紫草宁的合成主要发生在内质网中,然后通过胞外分泌作用运输到表皮细胞原生质体外的细胞壁中。其中一个重要的代谢中间体由甲羟戊酸(MVA)途径合成,而HMGR是甲羟戊酸途径中的第一个重要限速酶。因此,克隆和获得高表达HMGR基因的紫草毛状根具有重要的理论和应用价值。本实验根据实验室前期的转录组测序数据得到的HMGR基因核心片段,通过cDNA末端快速扩增方法(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)得到了硬紫草LeHMGR基因的全长cDNA克隆,并进一步构建了该基因的植物过表达载体LeHMGR-PBI121-GFP,转化发根农杆菌ATCC15834,用外植体诱导的方法获得了LeHMGR过表达的转基因硬紫草毛状根株系(LeHMGR overexpression hairy root, OH),同时用野生型农杆菌ATCC15834菌株诱导硬紫草外植体获得野生型(wild type, WT)硬紫草毛状根。亚细胞定位分析认为该基因可能定位于质膜上,有待进一步研究。本研究为深入探讨LeHMGR对紫草宁及其衍生物合成的调控及分子作用机制提供了实验材料。

关键词：硬紫草 LeHMGR 过表达载体毛状根亚细胞定位

固定化培养和产物释放促进剂对硬紫草细胞代谢的影响

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植物生理学报（0257-4829) 1995年第2期21卷 111-116页

作者：吕华赵群华曹日强夏仲豪南京大学生物系

固定化培养的硬紫草细胞生长缓慢，仅包埋球外层的细胞生长明显。其蛋白质合成的量也低。培养３０ｄ的细胞色素产量达到４．２ｍｇ／ｇＦＷ，相对色素分泌量达到７０％，而色素的组成成分及各组分的比例也与悬浮细胞的不同。以正十六烷... 详细信息

固定化培养的硬紫草细胞生长缓慢，仅包埋球外层的细胞生长明显。其蛋白质合成的量也低。培养３０ｄ的细胞色素产量达到４．２ｍｇ／ｇＦＷ，相对色素分泌量达到７０％，而色素的组成成分及各组分的比例也与悬浮细胞的不同。以正十六烷处理固定化细胞可促进产物释放，其不同的处理时间对细胞没有显著影响。连续培养的固定细胞保持其色素形成能力达８０ｄ之久，色素总产量达２０ｍｇ／ｇＦＷ。

关键词：硬紫草紫草色素固定化培养细胞代谢

软紫草与硬紫草化学成分的研究及紫草烫伤膏的制备

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软紫草与硬紫草化学成分的研究及紫草烫伤膏的制备

作者：张爱英沈阳药科大学

学位级别：硕士

紫草中的主要有效成分为萘醌色素，其5，8-二羟基萘醌的结构特点使之对光、热极不稳定，若采用普通的溶剂提取法，容易破坏其有效成分。实验中我们用CO超临界流体萃取法(SFE)在高压常温下提取软紫草及硬紫草根中的萘醌类色素。利... 详细信息

紫草中的主要有效成分为萘醌色素，其5，8-二羟基萘醌的结构特点使之对光、热极不稳定，若采用普通的溶剂提取法，容易破坏其有效成分。实验中我们用CO超临界流体萃取法(SFE)在高压常温下提取软紫草及硬紫草根中的萘醌类色素。利用硅胶色谱柱分离手段，以石油醚—氯仿、石油醚—乙酸乙酯、环己烷—氯仿为溶剂系统进行梯度洗脱，从软紫草根的CO超临界萃取物中分离鉴定了去氧紫草素(deoxyshikonin，1)、β，β-二甲基丙烯酰紫草素(β，β-dimethylacrylshikonin，2)、乙酰紫草素(acetylshikonin，3)、紫草素(shiko nin，4)四个单体化合物，从硬紫草根的CO超临界萃取物中分离鉴定了去氧紫草素(dcoxyshikonin，5)、β，β-二甲基丙烯酰紫草素(β，β-dimethyl acrylshikonin，6)、异丁酰紫草素(isobutyrylshikon-in，7)、乙酰紫草素(ace tylshikonin，8)、紫草素(shikonin，9)、β-谷甾醇(β-sitosterol，10)六个单体化合物。其中去氧紫草素(deoxyshikonin)为首次从硬紫草中分得的已知化合物。为比较两种紫草中主要成分的差别，采用紫外-可见分光光度法，测定软紫草与硬紫草根的CO超临界流体萃取物中总萘醌色素含量。在516nm处，测定吸光度A，以左旋紫草素(CHO)的吸光系数(E)为242计算。左旋紫草素在8.08～30.30μg／ml浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.0211X-0.0089，r=0.9998。软紫草中含量为50.21％，硬紫草中含量为35.97％。采用高效液相色谱法测定软紫草与硬紫草根的CO超临界流体萃

关键词：软紫草硬紫草蔡醌色素 β,β-二甲基丙烯酰紫草素乙酰紫草素高效液相色谱紫草烫伤膏

日本武田药厂试制痔疮药——硬紫草根提取物制剂Borraginol-NandS

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中成药 1981年第6期 45-20页

作者：孙海明中成药情报中心站

硬紫草(Lithospermum officinale *** Maximowicz)根具有抗菌、消炎、止血等作用,并可促进肉芽生长。其主要活性成分为多种紫草素(Shikonin)衍生物,如紫草素(Shikonin)及乙酰紫草素(acetyl-shikonin)等。自古以来,日本民间就用含有Borra... 详细信息

硬紫草(Lithospermum officinale *** Maximowicz)根具有抗菌、消炎、止血等作用,并可促进肉芽生长。其主要活性成分为多种紫草素(Shikonin)衍生物,如紫草素(Shikonin)及乙酰紫草素(acetyl-shikonin)等。自古以来,日本民间就用含有Borraginol-N&S的硬紫草根提取物治疗灼伤、冻疮、水疮以及痔疮等。

关键词：根提取物 Borraginol-NandS 痔疮硬紫草紫草素栓剂剂型药厂制剂