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盖塔病毒SC483株cDNA感染性克隆的构建

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中国农业科学 2023年第17期56卷 3479-3486页

作者：杜炳辰王铭刘春国王世达魏新宇路雅曼孙振钊刘在斯魏丽丽王靖飞杨德成中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】盖塔病毒（Getah virus, GETV）是一种由蚊虫传播的病毒，分类学上属于披膜病毒科甲病毒属成员。该病毒宿主范围广，可感染猪、马、牛、狐狸等多种哺乳动物，人也可以感染，但在人群中造成的危害尚不知晓。动物感染主要临床表... 详细信息

【背景】盖塔病毒（Getah virus, GETV）是一种由蚊虫传播的病毒，分类学上属于披膜病毒科甲病毒属成员。该病毒宿主范围广，可感染猪、马、牛、狐狸等多种哺乳动物，人也可以感染，但在人群中造成的危害尚不知晓。动物感染主要临床表现为发热、皮疹、关节炎、繁殖障碍和死胎。GETV在世界范围内流行较为广泛，近年来在我国的流行呈上升趋势，2018年我国南方多个猪场爆发该病，GETV在畜禽养殖及公共卫生方面的危害渐渐受到人们的关注。目前，尚无用于预防和治疗盖塔病毒感染的商业化疫苗和药物。由于对GETV研究较少，其生物学特性、对不同物种的致病性和致病机制以及流行趋势在很大程度上均是未知的。【目的】建立高效的GETV反向遗传操作平台，为深入研究GETV基因组结构与功能、致病机制以及开发新型疫苗奠定基础。【方法】采取化学合成的方式人工合成了两端分别含有锤头状核酶（HamRz）和丁肝病毒核酶（HdvRz）序列的GETV SC483株基因组全长，并克隆至低拷贝pOK12-CMV载体中，从而获得含有GETV SC483株基因组全长cDNA克隆的重组质粒pGETV-SC483。将纯化的重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞进行病毒拯救。对拯救病毒进行连续传代、鉴定以及生物学特性分析，并对感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌中的遗传稳定性进行验证。【结果】重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞后，48 h即可观察到GETV感染引起的典型细胞病变，获得的拯救病毒命名为rSC483。分别提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA，对病毒基因组进行RT-PCR扩增、Not I酶切以及序列测定。结果表明，拯救病毒不同于亲本病毒，其含有人为引入以消去Not I酶切位点的G4332A突变的分子标记。使用GETV特异性抗体作为检测抗体的间接免疫荧光试验和病毒粒子形态学电镜负染观察结果进一步表明，GETV拯救成功。噬斑形成试验和一步生长曲线试验结果表明，拯救病毒与亲本病毒具有相似的复制能力和增殖特性。另外，感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌DH5α中连续传代后的测序结果表明，该重组质粒具有良好的遗传稳定性。【结论】成功构建了稳定、高效的GETV SC483株全长cDNA感染性克隆，为GETV生物学特性及致病机理研究以及新型疫苗开发提供了技术平台。

关键词：盖塔病毒 cDNA感染性克隆病毒拯救反向遗传操作系统

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盖塔病毒分子进化及其迁徙

中国人兽共患病学报 2017年第4期33卷 293-299页

作者：李元元刘红李晓龙付士红高晓艳雷雯雯吕志何英王环宇王桂琴梁国栋山西医科大学太原030001 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室北京100052 山东理工大学淄博255000

目的了解世界各地分离盖塔病毒分子进化特征及其时空迁徙。方法用Clustal X1.83、MegaAlign和Gene DOC软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA 6.0软件绘制系统发生树,采用BEAST v 1.8.1软件包里的Bayesian Stochasti... 详细信息

目的了解世界各地分离盖塔病毒分子进化特征及其时空迁徙。方法用Clustal X1.83、MegaAlign和Gene DOC软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA 6.0软件绘制系统发生树,采用BEAST v 1.8.1软件包里的Bayesian Stochastic Search Variable Selection(BSSVS)程序进行盖塔病毒的空间动力学分析。结果盖塔病毒E2基因全长均为1 266nt,编码422aa,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.5%~100%和96.4%~100%。病毒分子进化分析发现,盖塔病毒不存在蚊虫,马匹和猪等宿主动物和媒介的种属和地域分布差异。生物信息学分析结果显示,盖塔病毒起源于马来西亚,此后依次传播至日本、中国、韩国以及蒙古国和俄罗斯等地。结论自1955年首次分离盖塔病毒至2014年间分离的盖塔病毒E2基因序列较为稳定,未发现病毒基因组之间存在种属及地域分布差异,并且该病毒已经从热带地区传播到欧亚大陆多个国家和地区,因此加强盖塔病毒及人畜动物感染的检测和监测至关重要。

关键词：盖塔病毒分子进化时空迁徙

我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3′非翻译区分子特征研究

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病毒学报 2007年第4期23卷 270-275页

作者：翟友刚王焕琴付士红梁国栋中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京100052

对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒（GETV）（M1、HB0215-3和HB0234）进行衣壳蛋白基因和3′UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征。首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3′UTR片段,纯化后连接... 详细信息

对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒（GETV）（M1、HB0215-3和HB0234）进行衣壳蛋白基因和3′UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征。首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3′UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树。3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%-100%和97.8%-100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%-99.6%之间。3株病毒3′UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个（45-54位）核苷酸缺失和2个（64位、148位）特有的核苷酸位点。进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群。

关键词：盖塔病毒衣壳蛋白基因 3′非翻译区核苷酸序列系统发生树

内蒙古自治区采集的蚊虫标本新发现乙脑病毒和盖塔病毒

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中华流行病学杂志 2020年第4期41卷 571-579页

作者：程睿南晓伟范娜付士红司晓艳张琳何英雷雯雯李樊王环宇鲁晓晴梁国栋青岛大学公共卫生学院 266071 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性脑炎室传染病预防控制国家重点实验室北京102206 内蒙古自治区综合疾病预防控制中心病媒生物防制科呼和浩特010031 巴彦淖尔市疾病预防控制中心 015000

目的了解内蒙古自治区的吸血昆虫及其携带虫媒病毒的种类及分布,为虫媒病毒病的预防提供基础数据。方法在自然界使用灯诱法采集蚊虫标本,形态学分类后分装编号,液氮保存。组织培养法进行病毒分离。使用多种生物学信息软件(BioEdit、MEGA... 详细信息

目的了解内蒙古自治区的吸血昆虫及其携带虫媒病毒的种类及分布,为虫媒病毒病的预防提供基础数据。方法在自然界使用灯诱法采集蚊虫标本,形态学分类后分装编号,液氮保存。组织培养法进行病毒分离。使用多种生物学信息软件(BioEdit、MEGA等)对病毒核苷酸序列进行分子生物学特征分析。结果2014、2017-2018年在内蒙古自治区5个县(旗)的采集点共采集到2属3种蚊虫24240只,蠓虫17110只。其中在淡色库蚊标本中检测到乙脑病毒基因阳性,并且获得4株可以稳定传代的病毒分离物,经分子生物学鉴定分别为盖塔病毒、浓核病毒。盖塔病毒(NMDK1813-1)E2基因遗传进化分析结果显示,与甘肃分离株(GS10-2)在同一进化分支,且有6个共同的氨基酸变异位点。结论本研究发现的乙脑病毒和盖塔病毒均是在内蒙古蚊虫标本中新近发现的病毒,这为内蒙古地区的虫媒病毒及其传播疾病的预防及控制提供了基础数据,对内蒙古的虫媒病毒及其病毒病的预防及控制提出了新的挑战。

关键词：乙脑病毒盖塔病毒虫媒病毒

我国新分离盖塔病毒的部分基因组分子特征研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第5期30卷 399-404页

作者：陈维欣王环宇付士红李铭华刘桂芳姜红月王力华王海岩王志玉梁国栋山东大学公共卫生学院病毒学研究室济南250012 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性脑炎室北京100052 山东省疾病预防控制中心

目的通过分子生物学方法研究我国山东省2008年分离的盖塔病毒（DY0824）基因组分子生物学特征.方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出结构区基因和3＇ UTR片段,连接到载体中进行序列测定,然后用Clustal X1.83和MegaAlign软件对... 详细信息

目的通过分子生物学方法研究我国山东省2008年分离的盖塔病毒（DY0824）基因组分子生物学特征.方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出结构区基因和3＇ UTR片段,连接到载体中进行序列测定,然后用Clustal X1.83和MegaAlign软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用Mega4软件绘制系统发生树.结果 DY0824病毒株衣壳蛋白由804个核苷酸组成,编码268个氨基酸,与国内外其他分离株的核苷酸同源性为95.4%～99.9%,氨基酸同源性为97.4%～100%.E2蛋白全长1266个核苷酸,编码422个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.8%～99.5%,氨基酸同源性为97.6%～100%.该病毒3＇ UTR由401个核苷酸组成,存在3个重复序列.结论山东省新分离盖塔病毒衣壳蛋白和E蛋白基国与该病毒原型分离株相比分别存在7个和10个氨基酸差异位点,病毒3＇UTR区域存在多个核苷酸差异位点.

关键词：盖塔病毒衣壳蛋白基因 E2蛋白基因 3’非翻译区核苷酸序列

盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2023年

作者：顾志刚郭洁真王子涵孙彤陈鸿军孙竹筠陈丹清江苏省常州市武进区畜牧兽医管理服务中心中国农业科学院上海兽医研究所

盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒，可通过蚊虫传播感染人畜，导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状，可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列，设计3... 详细信息

盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒，可通过蚊虫传播感染人畜，导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状，可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列，设计3组引物探针，筛选出最佳的引物探针，建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的Taqman探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9989；对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验，最低检出限达10copies，是普通 RT-PCR 方法的1000倍，敏感性高；与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应，特异性好；变异系数小于2%，重复性好。本研究了建立了一种敏感、特异的GETV检测方法，对GETV的快速诊断具有重要意义。

关键词：盖塔病毒 nsP1 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR

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盖塔病毒6K蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

中国兽医科学 2021年第1期51卷 59-65页

作者：鹿田原牟春晓陈振海扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为用于猪群中盖塔病毒(Getah virus,GETV)的流行病学调查,并研究其6K蛋白功能,制备了该蛋白的单克隆抗体。将6K基因克隆至原核表达载体pCold-TF,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG低温诱导表达。将诱导的重组菌超声裂解,离心后收集上清... 详细信息

为用于猪群中盖塔病毒(Getah virus,GETV)的流行病学调查,并研究其6K蛋白功能,制备了该蛋白的单克隆抗体。将6K基因克隆至原核表达载体pCold-TF,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG低温诱导表达。将诱导的重组菌超声裂解,离心后收集上清,经过镍柱亲和和切胶纯化后,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。使用间接免疫荧光(IFA)法筛选阳性杂交瘤细胞,获得1株GETV 6K单克隆抗体,命名为25C5。将其注射小鼠腹腔,制备6K单抗腹水。IFA检测结果显示,单抗25C5可以结合GETV蛋白并产生特异性荧光。在Western-blot和免疫沉淀试验中,单抗25C5可以结合GETV感染的ST-R细胞样品,其特异性条带大小约6 ku。以上结果表明,单抗25C5免疫学反应特性良好,可用于检测GETV,为该病毒的分离鉴定、致病机制和蛋白功能等研究奠定了基础。

关键词：盖塔病毒 6K蛋白原核表达单克隆抗体

盖塔病毒E2结构域蛋白的原核表达及抗血清制备

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中国兽医学报 2021年第8期41卷 1506-1511页

作者：仇相书史宁朱翔宇任世斌张海森李海鲁会军金宁一西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林农业大学动物医学院吉林长春130122 昭苏县西域马业有限责任公司新疆伊犁835600

甲病毒属病毒E2结构蛋白是一种保守的受体结合蛋白,包含与免疫原性、组织噬性及宿主感染范围相关的重要残基。本试验以盖塔病毒(Getah virus,GETV)SD17/09株为模板设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增E2结构域基因(E2d),扩增产物E2d连接... 详细信息

甲病毒属病毒E2结构蛋白是一种保守的受体结合蛋白,包含与免疫原性、组织噬性及宿主感染范围相关的重要残基。本试验以盖塔病毒(Getah virus,GETV)SD17/09株为模板设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增E2结构域基因(E2d),扩增产物E2d连接至原核表达载体pET-22b(+)融合表达,利用SDS-PAGE及Western blot方法分析表达产物。以His-Bind亲和层析柱纯化E2d蛋白,免疫新西兰兔获得阳性血清,通过血清中和方法检测血清效价,并通过Western blot分析其活性。结果显示,在预期38 kDa处出现目的条带,表明E2d基因成功表达,表达产物以包涵体形式大量存在;免疫后24 d多抗血清中和效价达1∶4096,能与重组蛋白E2d和GETV SD17/09株发生特异性反应。本试验成功应用大肠杆菌表达GETV E2d蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得兔源阳性血清,为开展GETV E2蛋白结构域的功能研究、诊断方法的建立和疫苗研发奠定基础。

关键词：盖塔病毒 E2结构域蛋白原核表达兔阳性血清

盖塔病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2023年第3期44卷 51-58页

作者：孟慧鹿田原周景业牟春晓陈振海扬州大学兽医学院江苏扬州225009

为制备盖塔病毒(GETV)E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对G... 详细信息

为制备盖塔病毒(GETV)E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对GETV E2蛋白的阳性杂交瘤细胞9E8,将该杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔内生产腹水。经间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验鉴定,该单抗可与GETV发生特异性反应。经IP试验证明,该单抗可识别天然结构的GETVE2蛋白。对E2单抗进行抗原表位鉴定,确定其所识别的多肽序列为66KIRYIAGHD74。与GenBank上登录的其他GETV毒株序列对比,发现该段序列高度保守。综上,E2单抗9E8免疫学反应特性良好,为研究该病毒提供了有效的免疫学检测工具。

关键词：盖塔病毒 E2蛋白单克隆抗体抗原表位