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白喉毒素(Gly_4Ser)_2-人表皮生长因子融合蛋白的纯化及其特异性细胞毒性研究

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中国免疫学杂志 2004年第3期20卷 171-172页

作者：张国利吴广谋李俊植岳玉环李树民朱平解放军军需大学军事兽医研究所长春130062

白喉毒素(Diphtheria Toxin,DT)是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的分子量为58342da的外毒素,它通过灭活真核细胞的肽链延伸因子Ⅱ(EF-2),阻断细胞蛋白合成,导致细胞死亡.毒素经胰蛋白酶水解分成193个氨基酸残基的A片段和34... 详细信息

白喉毒素(Diphtheria Toxin,DT)是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的分子量为58342da的外毒素,它通过灭活真核细胞的肽链延伸因子Ⅱ(EF-2),阻断细胞蛋白合成,导致细胞死亡.毒素经胰蛋白酶水解分成193个氨基酸残基的A片段和342个氨基酸残基的B片段,A片段分子量为22kD,位于毒素氨基末端,它进入细胞内可以催化ADP-核糖基化,灭活真核细胞的延长因子Ⅱ(EF-2);B片段分子量为38kD,位于羧基末端,由跨膜、转位、受体结合区组成.表皮生长因子是一种多功能的细胞因子,可由多种细胞产生,在一些肿瘤细胞表面(骨髓瘤、原发性肝癌、前列腺癌、鳞状上皮癌)EGF受体呈过度表达,显著高于毗邻组织的正常细胞.

关键词：白喉毒素人表皮生长因子融合蛋白特异性细胞毒性氨基酸 DT

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白喉毒素免疫毒素的研究进展

中国畜牧兽医 2011年第2期38卷 197-201页

作者：李泽鸿文继红刘文涛张国利吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 吉林大学第一医院吉林长春130021

文章主要论述白喉毒素免疫毒素、白喉毒素免疫毒素的构造和效应、白喉毒素免疫毒素的不足、白喉毒素免疫毒素的开发应用、白喉毒素免疫毒素的发展前景。

关键词：白喉毒素免疫毒素

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白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中表达纯化及性质研究

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生物技术通报 2010年第1期26卷 153-156页

作者：赵雪娜董相陈侯登勇孙丽霞王晶翼王庆民齐鲁制药有限公司药物研究院济南250100

CRM197是一种白喉毒素突变体,作为载体蛋白广泛用于疫苗开发。将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pET25b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,CRM197获得高效表达,达到菌体总蛋白的20%。目的蛋白主要以包涵体形式存在,变性、复性后... 详细信息

CRM197是一种白喉毒素突变体,作为载体蛋白广泛用于疫苗开发。将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pET25b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,CRM197获得高效表达,达到菌体总蛋白的20%。目的蛋白主要以包涵体形式存在,变性、复性后经DEAE阴离子交换、S-100分子筛纯化获得纯度高于95%的CRM197样品,用该蛋白样品免疫新西兰大白兔,免疫兔血清中检测到特异性抗体应答。急性毒性试验中,每只豚鼠皮下注射200μgCRM197纯化样品,未出现明显毒性反应症状,与之相比较,注射后48h内,20ng白喉毒素阳性对照组动物全部死亡。结果表明,利用本试验的表达策略,CRM197得到高效表达,并且具有良好的免疫原性和安全性,为其进一步生产及应用奠定基础。

关键词： CRM197 白喉毒素包涵体免疫原性急性毒性

A群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒变异体CRM197结合物的制备及其初步评价

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中国生物制品学杂志 2012年第10期25卷 1248-1253页

作者：张营营蔡路奎姜博毕研伟高丹丹闫铃梅姬秋彦李智华徐维明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118

目的制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性。方法白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性。结果发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量最高;CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95%以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应;GAMP-ADH-CRM197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组。结论成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础。

关键词： A群脑膜炎球菌多糖白喉毒素 CRM197 变异体结合物载体蛋白

白喉毒素受体介导的恶性黑色素瘤细胞在黑色素瘤原位转移模型中的应用的研究

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白喉毒素受体介导的恶性黑色素瘤细胞在黑色素瘤原位转移模型中的...

作者：雷振子锦州医科大学

学位级别：硕士

目的为了能够针对动物模型的原位肿瘤有针对性的杀伤而使我们能够进行肿瘤转移方面的研究,我们尝试建立白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞系,将白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞与对照组黑色素瘤细胞用白喉毒素处理后,检测并比较在体外环... 详细信息

目的为了能够针对动物模型的原位肿瘤有针对性的杀伤而使我们能够进行肿瘤转移方面的研究,我们尝试建立白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞系,将白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞与对照组黑色素瘤细胞用白喉毒素处理后,检测并比较在体外环境下过表达白喉毒素受体的黑色素瘤细胞与对照组黑色素瘤的细胞活性,用于构建白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞小鼠原位转移模型。方法将MSCV载体使用Mfe I+BamH I进行双酶切后连入提前PCR扩增的Puro CDS片段;再使用Xho I+Psi I酶对质粒及p2ADTR进行双酶切后连接;最后使用Xho I+BamH I酶再次酶切并连入Luc 2片段,得到的产物命名为MSCV-Luc2-DTR-puro;通过流式细胞仪分析并筛选DTR阳性细胞,分离后构建细胞系;使用DT在体外对建立的细胞系及对照细胞进行浓度梯度的杀伤并通过检测CCK-8染色后的吸光度值对比两组细胞杀伤后的细胞活性。结果1.测序结果显示,Luc2、p2ADTR及Puro片段能够正确的连接到MSCV载体中;2.流式细胞分析结果显示存在DTR阳性细胞,MSCV-Luc2-DTR-puro能够在小鼠恶性黑色素瘤细胞中表达;***-8实验结果显示,DT对DTR阳性细胞有更好的细胞活性抑制作用。结论白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞在体外经白喉毒素处理后细胞活性相比于对照组显著下降,使白喉毒素受体介导的黑色素瘤细胞用于建立黑色素瘤细胞动物原位转移模型时成功率大大提高,这可能是一个对肿瘤转移研究有意义的原位肿瘤杀伤模型。

关键词：白喉毒素白喉毒素受体免疫毒素荧光素酶肿瘤转移模型

白喉毒素/IL-6的高效表达及细胞毒作用的研究

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生物化学与生物物理学报 1998年第2期30卷 65-69页

作者：张新建李晶张宝云洪涛中国预防医学科学院病毒学研究所

白喉毒素是由携带β噬菌体基因组的白喉杆菌产生的由５３５个氨基酸组成的单链外毒素，毒性极强，１～２个分子即可灭活１个真核细胞，肿瘤细胞对它尤为敏感。在骨髓瘤、原发性肝癌等肿瘤细胞表面，ＩＬ－６受体可过度表达，利用受体与... 详细信息

白喉毒素是由携带β噬菌体基因组的白喉杆菌产生的由５３５个氨基酸组成的单链外毒素，毒性极强，１～２个分子即可灭活１个真核细胞，肿瘤细胞对它尤为敏感。在骨髓瘤、原发性肝癌等肿瘤细胞表面，ＩＬ－６受体可过度表达，利用受体与配体的特异性结合，可将细胞毒性药物定向导入肿瘤细胞。基于上述理论，用ＩＬ－６ｃＤＮＡ取代白喉毒素的受体结合区，构建了白喉毒素／ＩＬ－６融合蛋白表达载体ｐΔＤＴ／ＩＬ－６。ＩＰＴＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果显示，在６４ｋＤ处，有一明显产物带，该产物即能与白喉毒素单抗结合而显色，又能与ＩＬ－６单抗结合。表达量在菌体蛋白的２０％以上。经初步纯化后，ＩＬ－６受体竞争性结合实验及细胞毒性实验表明，该融合蛋白对表面有大量ＩＬ－６受体的骨髓瘤细胞Ｕ２６６有较强的细胞毒作用；而ＩＬ－６受体较少的正常细胞对其有一定的耐受作用。

关键词：白喉毒素白细胞介素-6 融合蛋白表达

构建靶向毒素血管内皮生长因子抗体-白喉毒素突变体

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中华检验医学杂志 2006年第5期29卷 441-444页

作者：张润玲胡洁杜惠芬李克生兰州大学第二医院检验科 730030 甘肃省医学科学研究院医学生物技术中心

目的探讨以血管内皮生长因子(VEGF)抗体为导向,白喉毒素突变体(CRM9)作效应部分,构建靶向毒素VEGF抗体-CRM9,为直接杀伤肿瘤细胞寻找新的药物。方法应用异型双功能连接剂甲基丙烯酸甲酯丁二烯苯乙烯三元共聚物(MBS)连接兔抗人VEGF多抗和... 详细信息

目的探讨以血管内皮生长因子(VEGF)抗体为导向,白喉毒素突变体(CRM9)作效应部分,构建靶向毒素VEGF抗体-CRM9,为直接杀伤肿瘤细胞寻找新的药物。方法应用异型双功能连接剂甲基丙烯酸甲酯丁二烯苯乙烯三元共聚物(MBS)连接兔抗人VEGF多抗和CRM9,制备成新的构建蛋白,Sephacryl S-300分离纯化后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明二者的结合情况。对构建蛋白抗体活性采用酶联免疫法检测,生物毒性应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测。结果构建蛋白通过分离并电泳后,出现明显增粗的分子量为116000新条带,位于CRM9和VEGF条带前方。构建的蛋白结合体中抗体活性检测,VEGF抗体与CRM9按1∶1制备的蛋白结合体,抗体活性与VEGF抗体对照差异无统计学意义(P>0·05),按1∶5和1∶8两种比例制备的蛋白结合体,抗体活性降低与VEGF抗体对照差异有统计学意义(P0·05),CRM9组杀伤效果与空白对照组相比差异有统计学意义(P毒素抗肿瘤的各项研究奠定了基础。

关键词：免疫毒素类血管内皮生长因子A 白喉毒素

靶向DF3的白喉毒素A链基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

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中华实验外科杂志 2007年第1期24卷 15-17页

作者：黄文广罗威黄汉菊华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科武汉430022 同济医学院微生物学教研室

目的探讨白喉毒素A链（DTA）基因在DF3／MUC1启动子调控下的杀伤作用。方法构建含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A链基因的表达载体pGL3-DF3-DTA，转染DF3阳性的乳癌细胞MCF-7，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测DTA基因的表达；噻唑蓝... 详细信息

目的探讨白喉毒素A链（DTA）基因在DF3／MUC1启动子调控下的杀伤作用。方法构建含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A链基因的表达载体pGL3-DF3-DTA，转染DF3阳性的乳癌细胞MCF-7，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测DTA基因的表达；噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长活性；免疫组织化学法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果酶切和测序表明获得了与预期结果相一致的pGL3-DF3-DTA真核表达载体。转染MCF-7细胞后，RT—PCR检测到了249bp的DTA mRNA片段。与对照组比较，转染pGL3-DF3-DTA的MCF-7细胞生长受到了抑制，流式细胞术检测到的凋亡率达39．43％，而对照组仅有0．28％。结论pGL3-DF3-DTA可对DF3阳性的乳癌细胞产生特异性的杀伤，对乳腺癌的基因治疗有潜在的应用价值。

关键词：乳腺肿瘤基因治疗白喉毒素

四环素调控白喉毒素基因的重组逆转录病毒载体的构建

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第二军医大学学报 2001年第Z1期22卷 89-90页

作者：李玉光赵立军李强曹广文杨淑英陈秋莉潘卫戚中田刘忠令山东省济宁医学院附属医院呼吸内科济宁272129 第二军医大学长海医院呼吸内科第二军医大学长海医院呼吸内科第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 第二军医大学长海医院呼吸内科

　　将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基... 详细信息

　　将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基化,使肽链延长因子Ⅱ失活,从而抑制宿主细胞蛋白合成[2].Gossen等[3]提出了可调控型高表达系统(Tet系统),这为毒素基因治疗肿瘤开辟了新途径.Tet系统可分为 Tet-On和Tet-Off系统,前者的基因表达是在四环素加入后激活,而后者则是在四环素浓度逐渐降低的情况下激活.我们构建携带四环素系统调控的DTA基因的逆转录病毒载体,为进一步探讨肺癌的基因治疗奠定基础.……

关键词：白喉毒素四环素系统肺癌逆转录病毒载体