检索结果-南通市图书馆

作者：郭婷重庆医科大学

学位级别：硕士

目的由于每年的季节性流感和不定期的流感大流行,流感病毒感染对公众健康构成重大威胁,也造成了较大的经济负担。直到现在,每年季节性流感爆发依然造成300～500万例严重病例和30～60万人死亡。由于目前抗病毒药物的疗效不理想,预防流感... 详细信息

目的由于每年的季节性流感和不定期的流感大流行,流感病毒感染对公众健康构成重大威胁,也造成了较大的经济负担。直到现在,每年季节性流感爆发依然造成300～500万例严重病例和30～60万人死亡。由于目前抗病毒药物的疗效不理想,预防流感感染最有效的方法是接种疫苗。现有的流感疫苗主要诱导对病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗体,而这些抗原容易漂移使病毒容易逃避这些抗体的作用,降低了疫苗接种的有效性。这些疫苗还存在容易出现与流行株错配,抗原易变异,不适合老人和儿童,保护效果不好等缺点。同时,流感疫苗需要根据当年流行的毒株重新配制、生产和接种也耗费了相当大的资源。因此,亟待开发具有更长时间和更广泛保护效果的通用流感疫苗。许多研究表明,M2e是通用流感疫苗的候选蛋白,它是基质蛋白2（M2）N端的23个氨基酸结构域,在所有的甲型流感病毒中保守性超过99%。然而由于M2e蛋白在病毒表面丰度低、分子量小,需要用不同的方式来提高其免疫原性,例如:蛋白疫苗佐剂、纳米颗粒等方式。肺炎链球菌溶血素（Ply）是肺炎链球菌主要毒力因子之一。ΔA146Ply（ΔPly）是Ply蛋白的减毒突变体,本课题组前期发现ΔPly是安全有效的肺炎链球菌疫苗候选蛋白并可以作为蛋白疫苗佐剂。流感病毒继发细菌感染是病人死亡的重要原因,而肺炎链球菌是主要感染病原体之一。因此,本课题拟表达rM2e-ΔPly融合蛋白,肌肉免疫小鼠后探索ΔPly是否可以增强M2e蛋白的免疫原性,并探索其对甲型流感病毒感染及其与肺炎链球菌共感染的保护效果。方法首先,将四段来自人、猪、家禽甲型流感病毒中M2e的一致序列串联在一起,构成rM2e序列。在大肠杆菌中表达并纯化出rM2e、rM2e-ΔPly、ΔPly蛋白,并去除蛋白中的脂多糖。以蛋白为抗原,流感病毒M2e单克隆抗体（14C2）为抗体,分别用ELISA和Western Blot法验证蛋白是否包含流感病毒M2e表位。分别将rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly蛋白经肌肉免疫BALB/c小鼠,H＆E染色主要脏器和血清肝肾功检测证明蛋白的生物安全性。ELISA法检测血清中抗体效价和抗体亚型,以及脾细胞经蛋白刺激后IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17A的表达。同时用三种来源于H1N1、H3N2、H5N1病毒的M2e多肽为抗原,ELISA法检测血清抗体交叉反应。用PR8病毒感染BALB/c小鼠后观察其生存率和体重变化,感染第六天取肺组织,用q RT-PCR法检测肺部病毒载量,ELISA法检测肺组织IL-6、TNF-α表达量,H＆E染色肺组织损伤情况。被动免疫法验证抗体对BALB/c小鼠的保护效果。用rM2e-ΔPly蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠,PR8感染小鼠后,观察其生存率和体重变化,用q RT-PCR法检测肺部病毒载量,ELISA法检测肺组织IL-6、TNF-α表达量。ELISA法检测血清中抗体效价和亚型,被动免疫法验证BALB/c小鼠抗体对C57BL/6小鼠的保护效果。分别将rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly蛋白经肌肉免疫BALB/c小鼠,建立流感病毒和肺炎链球菌共感染模型。观察其生存率和体重变化,用q RT-PCR法检测肺部病毒载量,血平板菌落计数法分析肺部和鼻腔灌洗液中细菌载量。结果1、成功表达了rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly蛋白,并验证了rM2e、rM2e-ΔPly蛋白包含流感病毒M2e表位。2、与单独rM2e相比,rM2e-ΔPly可以使BALB/c小鼠产生更高的血清Ig G抗体,主要以Ig G1、Ig G2a和Ig G2b为主。rM2e-ΔPly组的脾细胞因子IFN-γ和IL-17A显著高于其它组。3、rM2e-ΔPly诱导的血清可以识别来源于H1N1、H3N2、H5N1病毒的M2e多肽,被动免疫BALB/c小鼠后可降低肺部病毒载量。4、流感病毒感染BALB/c小鼠,rM2e-ΔPly组相比于PBS组和rM2e组小鼠生存率显著提高。rM2e-ΔPly相较于其他四个组肺部病毒载量更低。rM2e-ΔPly组相比于PBS组,小鼠肺部的IL-6和TNF-α水平更低,肺组织的炎症细胞浸润和组织损伤更轻。而免疫C57BL/6小鼠后,rM2e-ΔPly组相比于PBS组无保护效果。5、免疫rM2e-ΔPly后,BALB/c小鼠产生的rM2e特异性Ig G比C57BL/6小鼠高10倍,而ΔPly特异性Ig G抗体无差异。抗体亚型检测显示,相比于C57BL/6小鼠,BALB/c小鼠诱导的Ig G1、Ig G2a更强,而Ig G2b无明显差异。6、甲型流感病毒和肺炎链球菌共感染模型,rM2e-ΔPly和ΔPly蛋白可提高BALB/c的生存率。在细菌感染后24h,rM2e、ΔPly、rM2e-ΔPly、rM2e+ΔPly均可以减轻小鼠肺部病毒载量,而肺部和鼻腔灌洗液中的细菌载量无

关键词：甲型流感病毒流感病毒M2胞外域通用流感疫苗肺炎链球菌

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甲型流感病毒流行现状及防控策略研究进展

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中国科技期刊数据库医药 2023年第5期 32-36页

作者：唐仲胜河池市天峨县疾病预防控制中心广西天峨547300

流行性感冒(Influenza,简称流感)是由流感病毒(InfluenzaVirus,IFV)引起的每年都会在世界某些地方暴发流行的急性呼吸道传染病。该病以飞沫为主要传播途径,传染性强。以急性发热,乏力,头痛,咳嗽,咽痛,全身酸痛为主要症状。儿童、老年人... 详细信息

流行性感冒(Influenza,简称流感)是由流感病毒(InfluenzaVirus,IFV)引起的每年都会在世界某些地方暴发流行的急性呼吸道传染病。该病以飞沫为主要传播途径,传染性强。以急性发热,乏力,头痛,咳嗽,咽痛,全身酸痛为主要症状。儿童、老年人、有心肺等慢性病或免疫系统缺陷的人,在感染后很容易发生肺炎或其他并发症,其临床表现从轻度的上呼吸道症状,到急性呼吸窘迫综合症,多脏器功能衰竭,严重时可导致死亡。本研究就甲型流感病毒流行现状及防控策略做一综述。

关键词：甲型流感病毒流行防控策略

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基于CRISPR-Cas13a技术的甲型流感病毒检测和清除技术的研究

基于CRISPR-Cas13a技术的甲型流感病毒检测和清除技术的研究

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作者：王敏中国医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过针对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)基因的核蛋白(nucleoprotein,NP)及神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)片段保守区设计靶点,构建一种基于CRISPR-Cas13a系统的通用型、特异型检测靶点数据库,并利用CRISPR-Cas13a技术结合逆转录重组酶介导的等温核酸扩增(Reverse transcription recombinase aided amplification,RT-RAA)和胶体金免疫层析法试纸条法实现对IAV准确、高效、快速的现场检测,以期在现场快速识别IAV及其耐药突变株;结合通用型检测靶点进行IAV清除实验,并筛选出高效的递呈载体,在核酸水平实现对当前社会流行度高的多种IAV实现高效清除,从而解决IAV所带来的公共卫生问题。方法:1.在体外对设计合成的crRNA进行转录和纯化,设计合成RT-RAA引物用于扩增IAV核酸样本;实验组将扩增产物作为样本、对照组将无酶水作为样本进行试验,扩增产物与纯化后的crRNA结合用于识别、激活CRISPR-Cas13a并剪切报告RNA,从而捕获报告RNA发出的荧光,通过比较实验组与对照组荧光强度来实现对IAV及其耐药位点的检测,同时利用胶体金免疫层析试纸条对以上检测靶点进行“显色法“检测,将扩增后的核酸样本加入到CRISPR-Cas13a检测体系中孵育30min后将试纸条末端插入其中,观察试纸条检测线是否显色。利用荧光检测法及免疫层析试纸条法分别检测不同拷贝数的样本,确定两种检测方法的检测下限;并利用两种方法检测IAV及其他呼吸道传播病毒,通过检测结果判断两种检测方法的特异性。2.将合成好的两条crRNA单链进行退火形成双链,通过酶切酶连方式将crRNA双链插入到Cas13a backbone中,后将酶切酶连产物导入DH5a中,并挑选成功连接的质粒进行质粒提取,将提取后的质粒利用递呈载体递送进入MDCK细胞内,随后实验组利用IAV侵染MDCK细胞,以仅转染组作为对照组,24h后通过RT-q PCR对细胞上清的核酸提取物进行定量,通过比较实验组与对照组之间的CT值来计算相应的靶点对于IAV的清除效率。3.使用lipofectamine 2000和jet OPTIMUS分别递呈了相同的Cas13a-crRNA系统,从转染后细胞形态、活力、荧光转染效果图及递送后对于IAV的清除效率等方面进行了比较,得出两种不同的转染试剂的细胞毒性、递送效率的优劣差异。结果:1.从NP基因片段的保守区中筛选出7个IAV通用型和特异型crRNA。这种基于CRISPR-Cas13a的检测方法对IAV的检测下限可达到1×10～0 copies/μL;可以特异性的区分于其他6种呼吸道病毒;检测到H1N1病毒的H274Y变异位点,H3N2病毒的H274Y及R292K变异位点。2.与lipofectamine 2000相比,新型纳米材料jet OPTIMUS转染后细胞形态无明显改变,且细胞活力评估实验中lipofectamine 2000组与jet OPTIMUS组相对发光值分别为79400和86400;转染等量CRISPR-Cas13a清除系统时,lipofectamine 2000用量为1μL,而jet OPTIMUS仅需0.2μL;转染相同清除靶点时,jet OPTIMUS相对于lipofectamine 2000平均清除效率提高了21.97%±13.76%。3.利用IAV保守区域设计的清除靶点针对H1N1清除率最高可达91.4%;针对H3N2清除率最高可达96.1%。结论:1.本研究中所创建的IAV现场检测技术与RT-qPCR方法敏感度相当,且其不依赖专业的操作人员和昂贵的仪器设备;可实现单靶点对多型别IAV的现场快速、即时的便携式检测,检测下限可达1×10～0 copies/μL,检测结果稳定性高。2.基于CRISPR-Cas13a系统的IAV常见耐药位点的现场即时检测,可第一时间识别耐药突变株并根据其突变信息指导用药。3.利用IAV的通用型清除靶点可实现对多型别IAV的清除,扩大对IAV的治疗范围,目前H1N1和H3N2通用型清除靶点已初步获得,重复验证、优化中。4.JetOPTIMUS是一种安全、经济、递呈效率高的新型递呈载体,使用其递呈CRISPR-Cas13a清除系统与Lipo2000递呈载体组相比,清除效率提高了约22%,且对IAV的清除效率均高于90%。

关键词： CRISPR-Cas13a 甲型流感病毒核酸检测变异位点病毒清除

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千金藤素抗甲型流感病毒的作用研究

千金藤素抗甲型流感病毒的作用研究

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作者：桑会婷南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:甲型流感病毒(InfluenzaAvirus,IAV)是常见的流感病毒,可导致严重的急性呼吸道疾病,其主要攻击肺泡上皮细胞和呼吸道上皮细胞,可造成肺泡上皮损伤并阻碍气体交换,进而导致肺炎,发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),易造成季节性流... 详细信息

研究背景:甲型流感病毒(InfluenzaAvirus,IAV)是常见的流感病毒,可导致严重的急性呼吸道疾病,其主要攻击肺泡上皮细胞和呼吸道上皮细胞,可造成肺泡上皮损伤并阻碍气体交换,进而导致肺炎,发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),易造成季节性流感或诱发全球性大流行。由于甲型流感病毒传播范围广、抗原突变速度快,疫苗的更新速度有限,抗流感药物应对流感病毒感染仍是防治流感的重要举措之一。以抑制病毒神经氨酸酶为主的抗流感病毒药物已在临床上广泛使用,然而其相应的耐药株出现,为流感的防治带来困难。因此,新的抗病毒药物在作用机制上亟待突破,其中围绕病毒复制的聚合酶和宿主免疫的抗病毒药物研发已成为当前创新药物研发领域的发展方向。针对流感病毒聚合酶,新型速效抗流感药物巴洛沙韦(Xofluza)的成功上市,拓宽了人类开发抗病毒药物的传统理念。而调节宿主免疫的抗病毒药物研究,成为抗病毒药物研发的新方向。若将两种策略相结合,将有可能构成抗病毒药物研发的新契机。近年来,天然产物的研发备受关注,其具有毒性低,多靶点的重要特征。千金藤素(Cepharanthine,CEP),是从防己科植物头花千金藤、地不容中分离提取的双苄基异喹啉生物碱,具有抗肿瘤、抗疟疾、抑菌、调节免疫功能等作用。千金藤素片在临床上主要作为白细胞增生药,能促进骨髓组织增生,从而使外周血白细胞增多。近来的研究表明千金藤素对于多种冠状病毒(包括SARS-CoV2和OC43)都具有抑制作用,曾经用于SARS的临床治疗,目前正开展千金藤素治疗新冠的临床研究。这些结果均表明千金藤素很可能具有广谱抗病毒作用。但千金藤素在抗流感病毒方面的应用尚未见报道。研究目的:我们拟评价千金藤素体内外抗流感病毒药效,从病毒和宿主两方面组合揭示千金藤素抗甲型流感病毒的作用机制,从而探究千金藤素抗甲型流感病毒的作用靶点,阐明千金藤素抗炎的作用机制。本研究为挖掘老药的新用途提供参考,为千金藤素作为一种抗甲型流感病毒的潜在药物开发提供科学依据,为临床治疗提供潜在新方案。实验方法:1.采用MTT法测定千金藤素对靶细胞的毒性,利用细胞病变法、空斑减少法检测千金藤素对不同亚型甲型流感病毒的抑制活性;2.采用间接免疫荧光法、Western blotting以及qRT-PCR等方法检测千金藤素对甲型流感病毒复制的影响;3.采用MTT法检测千金藤素和神经氨酸酶抑制剂zanamivir联用的效果;4.采用mini-replicon实验检测流感病毒聚合酶的活性;5.采用Western blotting和qRT-PCR探究千金藤素对流感病毒感染诱导的炎症反应的影响和机制;6.采用STAT1和STAT2敲低实验检测千金藤素对JAK/STAT通路的影响;7.采用Western blotting和免疫共聚焦实验检测千金藤素对NF-κB通路的影响;8.建立流感病毒感染小鼠模型,评价千金藤素在体内的抗甲型流感病毒作用。实验结果:1.千金藤素能够抑制多种亚型的甲型流感病毒活性,包括A/WSN/1933(H1N1),A/Aichi/2/68(H3N2),A/Puerto Rico/8/34(H1N1),A/FM-1/1/47(H1N1)。IC50分别为 2.34±0.86、5.50±2.22、1.08±0.72 及 3.51±0.47μM;2.千金藤素在甲型流感病毒的早期复制阶段发挥重要作用;3.千金藤素能显著地降低流感病毒聚合酶的活性,且具有剂量依赖性;4.千金藤素与神经氨酸酶抑制剂zanamivir联用指数流感病毒作用;5.千金藤素能够抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路激活相关蛋白如p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2和p-NF-κB p65的表达,显著减少相关细胞因子过度表达;6.千金藤素可减轻流感病毒感染引起的肺损伤,降低肺部病载量并提高流感感染小鼠的生存率。结论:1.千金藤素在体外能够抑制不同亚型甲型流感病毒的活性且细胞毒性较低;2.千金藤素能抑制甲型流感病毒的早期复制;3.千金藤素可通过抑制甲型流感病毒聚合酶的活性发挥直接抗病毒作用;4.千金藤素与zanamivir联用具有协同抗流感病毒作用;5.千金藤素发挥抗炎作用可能与其抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路有关;6.千金藤素具有一定的体内抗甲型流感病毒作用。

关键词：甲型流感病毒千金藤素流感病毒聚合酶抗炎信号通路

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金属纳米复合物Cu-TCPP@Mn3O4抗甲型流感病毒活性研究

金属纳米复合物Cu-TCPP@Mn3O4抗甲型流感病毒活性研究

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作者：陈柳蓉南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:季节性流感是由流感病毒感染引起的一种急性呼吸道传染病。1918年西班牙流感大流行、1957年亚洲流感大流行、1968年香港流感大流行和2009年墨西哥流感大流行对社会经济和公共卫生造成了深远的影响。近期我国多地出现流感活动... 详细信息

研究背景:季节性流感是由流感病毒感染引起的一种急性呼吸道传染病。1918年西班牙流感大流行、1957年亚洲流感大流行、1968年香港流感大流行和2009年墨西哥流感大流行对社会经济和公共卫生造成了深远的影响。近期我国多地出现流感活动水平上升,是由甲型流感病毒中的甲型H1N1亚型所致,对公共卫生构成了重大威胁。由于甲型流感病毒极高的变异性,目前流感疫苗的防治效果有限,抗流感药物也面临着局限和挑战。几乎所有在人类传播的甲型流感病毒均对烷胺类药物耐药。临床上常用的抗流感病毒药物如神经氨酸酶抑制剂数量有限,而且随着抗流感药物在临床上广泛使用,耐药性病毒株不断出现,限制了现有抗病毒药物的活性。近年来,出现了一批针对新靶点的抗流感药物,如Xofluza和Favipiravir,但远期效果还有待观察。鉴于目前上市的抗流感药物仍不能满足临床需求,且抗病毒靶点缺乏多样性,因此迫切需要寻找新型高效的抗流感病毒药物。纳米材料具有水溶性、生物相容性、合成成本低、毒性低等独特性质,在生物成像、生物传感、生物标记、光动力疗法和药物递送等方面都有广泛的应用。近年来,越来越多的研究者开始从纳米材料中发现抗病毒药物,但一些纳米材料的粒径远小于病毒,因此与病毒的接触面积有限,在一定程度上限制了其抗病毒活性。二维的金属有机骨架纳米材料具有较大的尺寸、比表面积较高的特点,恰好弥补了这一缺陷。较大的接触面积和相对柔软、可折叠的纳米片结构可以大大提高其与病毒的相互作用,从而表现出更好的抗病毒活性。铜(Ⅱ)四羧基苯基卟啉(Cu-TCPP)是一种由金属离子或团簇与有机配体配位形成的二维金属有机骨架纳米材料,具有灵活可调的二维结构、大的比表面积、多孔等优点,在抗菌和抗肿瘤方面已具有广泛的研究。由合作课题组合成具有高度相容性的二维纳米材料Cu-TCPP@Mn3O4,通过Cu2+表面的正电荷和病毒表面的负电荷之间的静电吸附效应,使病毒吸附在二维有机骨架材料表面,能有效减少病毒数量,更重要的是Mn3O4纳米粒子能有效清除活性氧,下调各种炎症因子,改善宿主环境,这可能是抗病毒领域有吸引力的治疗选择,有望发展成为新一代的抗病毒药物。研究目的:我们拟评Cu-TCPP@Mn3O4体内外抗甲型流感病毒药效,探究Cu-TCPP@Mn3O4抗甲型流感病毒的作用靶点,阐明Cu-TCPP@Mn3O4抗甲型流感病毒的作用机制。本研究旨在通过抗病毒、抗炎和抗氧化多模式同步治疗,为流感病毒防治提供新的思路。实验方法:1.采用MTT法检测Cu-TCPP@Mn3O4对靶细胞的毒性及对不同亚型的甲型流感病毒株的抑制活性;2.空斑减少实验、间接免疫荧光法、Western blotting、qRT-PCR评估Cu-TCPP@Mn3O4体外抗流感病毒效果;3.采用荧光法检测A549细胞对Cu-TCPP@Mn3O4的摄取效果;4.采用H5N1假病毒中和实验检测Cu-TCPP@Mn3O4对流感病毒进入的影响;5.采用透射电镜实验观察Cu-TCPP@Mn3O4对流感病毒结构的影响;6.采用Time-of-addition、血凝抑制实验、溶血实验、合胞体抑制试验、SPR实验、Mini-replicon实验、神经氨酸酶抑制实验分析Cu-TCPP@Mn3O4抗甲型流感病毒的作用机制;7.采用 Western blotting、qRT-PCR 实验研究 Cu-TCPP@Mn3O4 对 IAV 或 Poly(I:C)诱导的炎症损伤的影响及作用机制;8.采用荧光法检测Cu-TCPP@Mn3O4对细胞内甲型流感病毒或LPS诱导的活性氧表达的影响;9.采用A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠,评价Cu-TCPP@Mn3O4对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用。实验结果:1.Cu-TCPP@Mn3O4 对 MDCK、A549、Beas-2B 细胞的 CC50 均大于50 μg/mL;2.Cu-TCPP@Mn3O4在体外对不同亚型甲型流感病毒均有有效的抑制作用,IC50为 0.79～1.47 μg/mL;3.A549细胞对Cu-TCPP@Mn3O4具有良好的摄取效果;4.Cu-TCPP@Mn3O4能够破坏流感病毒的结构;5.Cu-TCPP@Mn3O4可抑制病毒与靶细胞的融合,但不影响流感病毒RNA聚合酶和神经氨酸酶活性;6.SPR实验结果表明Cu-TCPP@Mn3O4能够特异性结合血凝素HA2亚基;7.Cu-TCPP@Mn3O4具有良好的产氧功能并能显著降低流感病毒诱导或LPS刺激细胞产生的ROS;8.Cu-TCPP@Mn3O4能显著降低流感病毒诱导或Poly(I:C)刺激细胞产生炎症相关的细胞因子和趋化因子表达;9.Cu-TCPP@Mn3O4能够调控 NF-κB 和 JAK/STAT 信号通路;10.Cu-TCPP@Mn3O4可有效降低小鼠肺部的病毒载量、肺炎小鼠的肺指数、细胞因子水平,减轻流感病毒诱导的小鼠肺损伤,并延长肺炎小鼠的存活

关键词：金属有机骨架纳米材料甲型流感病毒抗病毒机制抗炎机制

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甲型流感病毒PA蛋白新成员的研究进展

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病毒学报 2014年第6期30卷 689-693页

作者：谭伟谢芝勋广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001

流感严重地威胁着人们的生活和健康,研究流感病毒的蛋白组成将有助于流感病毒疫苗及检测试剂等的研发。流感病毒含有结构和非结构蛋白。最初人们认为甲型流感病毒的8个基因节段只能编码8个病毒蛋白,以后发现M基因和NS基因可以分别编码M... 详细信息

流感严重地威胁着人们的生活和健康,研究流感病毒的蛋白组成将有助于流感病毒疫苗及检测试剂等的研发。流感病毒含有结构和非结构蛋白。最初人们认为甲型流感病毒的8个基因节段只能编码8个病毒蛋白,以后发现M基因和NS基因可以分别编码M2离子通道蛋白和非结构蛋白NS2。自2012年以来人们从甲型流感病毒中鉴定出了数种新的病毒蛋白,本文将主要介绍于2012年和2013年分别发现的甲型流感病毒PA蛋白新成员PA-X、PA-N155和PA-N182。

关键词：甲型流感病毒酸性聚合酶 PA-X 核糖体开放阅读框架移动

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甲型流感病毒H9N2亚型毒株血凝素基因特性的研究

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Chinese Medical Journal 2001年第1期114卷 109-110页

作者：郭元吉董婕王敏张烨郭俊峰吴昆昱中国预防医学科学院病毒学研究所流感研究室北京100052

目的　了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA ,通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增 ,接着PCR产物用纯... 详细信息

目的　了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA ,通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增 ,接着PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。而后 ,RNA序列测定是采用双脱氧链末端终止和克隆法。最后用MegAlign( 1.0 3版 )和Editseq( 3.69版 )软件进行种系发生学分析。结果　从中国所分离出的H9N2亚型毒株。它们的HA1与HA2间裂解部位的氨基酸序列均为R S S R ,除一株鸽病毒其HA蛋白分子上仅含 7个潜在的糖基化位点外 ,而其余的均含 8个。 6株H9N2毒株HA蛋白分子上氨基酸序列有 2 - 16个不同 ,这些不同分布在 2 4个不同的位点上。近来在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2亚型毒株。结论　人甲型流感病毒H9N2亚型毒株可能性最大来自鸡的H9N2毒株 ,而不是来源于鸽的H9N2毒株。但 ,H9N2毒株是否具有人传人能力 ,至今仍不清楚。在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2毒株。

关键词：甲型流感病毒 H9N2亚型 HA基因特性

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甲型流感病毒血凝素基因的进化与分型研究

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复旦学报（医学版） 2011年第4期38卷 324-328页

作者：熊成龙张志杰梁笛蒋露芳陆一涵居丽雯陈跃姜庆五复旦大学公共卫生学院流行病学教研室-公共卫生安全教育部重点实验室上海200032

目的分析甲型流感病毒各亚型血凝素基因的系统发育特征,探讨甲型流感病毒血凝素基因的起源与演化规律。方法从互联网获取甲型流感16个亚型的基因序列资料,运用DNAStar、Clustal X1.83、MEGA 4及PHYLIP 3.67等生物信息学软件对其进行系... 详细信息

目的分析甲型流感病毒各亚型血凝素基因的系统发育特征,探讨甲型流感病毒血凝素基因的起源与演化规律。方法从互联网获取甲型流感16个亚型的基因序列资料,运用DNAStar、Clustal X1.83、MEGA 4及PHYLIP 3.67等生物信息学软件对其进行系统发育关系研究。结果 16个亚型的甲型流感病毒的血凝素基因能够按照各自的血清亚型实现聚类,亚型内各基因的遗传距离在0.10231~0.22516厘摩（centimorgan,cM,SE为0.006~0.011）之间不等,按照系统发育关系,16个血清亚型可以分为5个大的进化簇：亚型H1、H2、H5与H6构成A簇,H8、H9与H12构成B簇,H11、H13与H16构成C簇,H7、H10与H15构成D簇,H3、H4与H14构成E簇,其中A簇、B簇与C簇可进一步聚类为一个进化群,而D簇与E簇也可以进一步聚类为另一进化群。结论按血凝素基因的序列信息可将甲型流感病毒分为5个进化簇并进而分为两个进化群。

关键词：甲型流感病毒血凝素基因进化基因分型

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基于“肠-肺”轴的连花清瘟胶囊改善甲型流感病毒感染小鼠免疫功能的机制研究

基于“肠-肺”轴的连花清瘟胶囊改善甲型流感病毒感染小鼠免疫功...

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作者：许萍皖南医学院

学位级别：硕士

目的:肠道微生物群的改变可能有助于肺组织损伤的修复;已知连花清瘟胶囊(Lianhua Qingwen capsule,LHQW)对缓解流行性感冒有益,然而,LHQW改善流感病毒症状时,其肠道菌群是否发挥作用,尚不清楚。本实验研究LHQW改善小鼠流感病毒感染引起... 详细信息

目的:肠道微生物群的改变可能有助于肺组织损伤的修复;已知连花清瘟胶囊(Lianhua Qingwen capsule,LHQW)对缓解流行性感冒有益,然而,LHQW改善流感病毒症状时,其肠道菌群是否发挥作用,尚不清楚。本实验研究LHQW改善小鼠流感病毒感染引起的肺损伤,以及其对肠道菌群的作用,结合计算机辅助药物设计技术和CFSE活细胞荧光标记技术,从“肠-肺”轴的角度,为“肺病”“肠治”提供理论依据。方法:BALB/c小鼠用甲型流感病毒(H1N1,A/PR/8/34株)滴鼻,制备流感病毒感染模型,随机均分为病毒模型组(Model)、连花清瘟胶囊中11mg·d(LHQW-M)、连花清瘟胶囊高剂量组22mg·d(LHQW-H)、磷酸奥司他韦组395.90μg·d(OSTW),验证其对流感病毒的改善作用,并观察其对肺部炎症损伤及肠黏膜屏障的影响;通过16S r RNA分析评估肠道菌群的组成和多样性;网络药理学筛选LHQW提高流感病毒临床治愈率的关键成分和作用靶点,分子对接、分子动力学模拟和自由结合能进行初步验证;使用相关性分析验证肠道中微生物组成的变化与免疫反应的改变和肺部疾病发展的关系;使用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)、实时荧光定量(quantitative real-time reverse transcription PCR,RT-QPCR)和免疫荧光评价LHQW对病毒感染小鼠相关细胞因子的影响;用活细胞荧光染剂CFSE对分离的小鼠淋巴细胞进行标记后,流式细胞术和小动物活体成像对回输标记的淋巴细胞进行体内示踪检测分析。结果:与正常对照组(Normal组)比较,模型组(Model组)小鼠肺内病毒载量显著升高,小鼠的生存率、体质量显著降低,炎症因子紊乱,肠道黏膜屏障受损,其肠道菌群的Alpha多样性中的Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数均呈现不同程度降低,其中Simpson降低显著(P病毒载量显著减少,肺组织损伤、肠黏膜屏障损伤显著改善,其肠道菌群4项指数均有不同程度的回升,其中Shannon指数升高显著(P病毒量及网络药理学筛选的核心靶点与肠道菌群存在密切联系。在病毒感染高峰期,小肠和肺组织淋巴细胞归巢程度升高,提示H1N1感染在一定程度上诱导淋巴细胞向小肠和肺的迁移;而经过LHQW治疗后能够显著提升淋巴细胞归巢的能力。结论:LHQW可改善菌群丰度和多样性,逆转流感病毒感染引起的菌群改变,其可能通过调节肠道菌群并作用于TNF和Toll受体信号通路,抑制免疫炎症反应,恢复肠道受损屏障,调节淋巴细胞细胞募集到受损肺来调节全身免疫,改善免疫微环境,减少体内炎症因子的产生和释放,减轻肺泡上皮的损伤和异常修复,从而对流感病毒感染综合征产生防治效果。

关键词：连花清瘟胶囊甲型流感病毒肠道菌群淋巴细胞归巢

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甲型流感病毒H1N1单克隆抗体特性鉴定和应用

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中国免疫学杂志 2021年第9期37卷 1094-1099页

作者：刘杨赵向绒郭春艳李研胡军(指导) 陕西省人民医院中心实验室西安交通大学医学院第三附属医院西安710068

目的:制备抗甲型流感病毒单克隆抗体(mAbs)并分析抗体反应特性,评价mAbs在免疫荧光(IFA)和细胞免疫化学染色中的应用,初步建立H1N1流感病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA方法。方法:取A/PR/8/34(H1N1)毒种接种于鸡胚尿囊腔,培养72 h后收获... 详细信息

目的:制备抗甲型流感病毒单克隆抗体(mAbs)并分析抗体反应特性,评价mAbs在免疫荧光(IFA)和细胞免疫化学染色中的应用,初步建立H1N1流感病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA方法。方法:取A/PR/8/34(H1N1)毒种接种于鸡胚尿囊腔,培养72 h后收获尿囊液,甲醛灭活,蔗糖密度梯度超离心法纯化,用于mAbs免疫原开发。病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,ELISA和IFA筛选稳定分泌抗甲型流感病毒mAbs的杂交瘤细胞株。ELISA、IFA、血凝抑制试验(HI)和中和试验(MN)分析抗体反应特性。依据mAbs特性建立细胞IFA试验、HI试验和双抗体夹心ELISA方法。结果:共制备13株mAbs,其中6株(PR8-10、PR8-19、PR8-20、PR8-26、PR8-28、PR8-30)具有较高血凝抑制活性,血凝抑制滴度≤3μg/ml。PR8-13和PR8-15无中和活性,其他11株均具有中和活性。部分mAbs可用于IFA试验和细胞免疫化学染色。依据PR8-24和PR8-25抗体反应特性初步建立H1N1流感病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA法。结论:制备出可用于IFA试验和细胞免疫化学染色的A/PR/8/34(H1N1)mAbs,初步建立了快速H1N1检测的ELISA方法,为H1N1流感病毒或病毒血凝素蛋白快速定量方法建立提供依据。

关键词：甲型流感病毒单克隆抗体细胞免疫化学染色双抗体夹心ELISA

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