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维生素D通过VDR/PPARγ途径改善甲型流感病毒诱导肺上皮细胞炎症的研究

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病毒学报 2023年第5期39卷 1235-1242页

作者：段伟静任维华赵兴敏蔺学燕山东第一医科大学附属人民医院济南271100

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染会导致肺上皮细胞损伤及炎症反应激活,维生素D(Vitamin D,VitD)在脂多糖、细菌感染引起肺上皮细胞损伤中起保护及抗炎作用,在高糖激活炎症反应中通过维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)/过氧... 详细信息

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染会导致肺上皮细胞损伤及炎症反应激活,维生素D(Vitamin D,VitD)在脂多糖、细菌感染引起肺上皮细胞损伤中起保护及抗炎作用,在高糖激活炎症反应中通过维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)轴发挥抗炎作用。为研究VitD在IAV诱导肺上皮细胞损伤中的作用及相关机制,本文对VitD通过VDR/PPARγ途径改善IAV诱导肺上皮细胞炎症的作用展开实验。培养小鼠肺上皮细胞株MLE-12,按照MOI=0.2感染IAV,给予100nmol/L VitD干预,转染阴性对照(Negative control,NC)siRNA或VDR siRNA,干预24h后检测细胞活力,细胞中VDR、PPARγ、细胞核增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达,培养基中白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的水平。结果显示,IAV组MLE-12细胞的活力及PCNA、PPARγ、VDR的表达低于对照组,培养基中IL-1β、TNF-α、IFN-γ的水平高于对照组(P<0.05);VitD组MLE-12细胞的活力及PCNA、PPARγ、VDR的表达高于IAV组,培养基中IL-1β、TNF-α、IFN-γ的水平低于IAV组(P<0.05);si-VDR+IVA+VitD组MLE-12细胞的活力及PCNA、PPARγ、VDR的表达低于si-NC+IVA+VitD组,培养基中IL-1β、TNF-α、IFN-γ的水平高于si-NC+IVA+VitD组(P<0.05)。以上结果表明VitD改善IAV感染诱导肺上皮细胞损伤及炎症反应,这一作用与调控VDR/PPARγ途径有关。

关键词：甲型流感病毒维生素D 肺上皮细胞炎症反应维生素D受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ

河南省南阳市甲型流感病毒的流行变迁及实验室检测方法学差异分析

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疾病监测 2023年

作者：汪海霞冯扬帆蔡晶晶杜锴张雪玲朱丹燕赵莹莹河南省南阳市中心医院医学检验科郑州金域临床检验中心有限公司河南省南阳市第一人民医院医学检验科南阳康圣医学检验所有限公司

目的探讨河南省南阳市甲型流感病毒(IAVs)的流行变迁及多中心实验室不同检测方法学检测IAVs的差异分析。方法收集河南省南阳市中心医院、南阳市第一人民医院、南阳康圣医学检验所和郑州金域临床检验中心有限公司2019年1月—2023年4月期... 详细信息

目的探讨河南省南阳市甲型流感病毒(IAVs)的流行变迁及多中心实验室不同检测方法学检测IAVs的差异分析。方法收集河南省南阳市中心医院、南阳市第一人民医院、南阳康圣医学检验所和郑州金域临床检验中心有限公司2019年1月—2023年4月期间，经临床医生诊疗疑似IAVs感染发热患者外周静脉血、咽拭子和肺泡灌洗液等标本，采用间接免疫荧光法(IFA)、磁微粒化学发光法(CLIA)、胶体金法、一代测序法、逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及靶向高通量测序技术(tNGS)分别进行检测，分析各中心实验室不同检测方法学优劣及关联，以及分析IAVs流行变迁。结果发热门诊送检IAVs标本检测量较大，IAVs患者分布于各年龄段，各人群均易感。2020—2022年期间IAVs处于低流行状态，2019年和2023年至今，IAVs出现大流行。tNGS、一代测序与RT-PCR检测IAV-RNA阳性率比较，三者之间差异无统计学意义(χ2值分别为1.449、0.838，P值分别为0.229、0.360)，IAV-IgM(欧蒙)对IAVs检出阳性率与上述方法学之间差异无统计学意义(χ2=2.447，P=0.118)，IAV-IgM(西班牙)、IAV-IgM(CLIA)对IAVs检出阳性率较低。tNGS与一代测序可以对IAVs进行分型，检测IAVs及亚型IAV-H3N2阳性率之间差异具有统计学意义(u值分别为4.335、4.213，P<0.001)。当IAV-RNA的Ct值<25时，患者咽拭子中IAV-Ag敏感度高达88/90=97.78%，当Ct值≥30时，IAV-Ag阳性检出率仍保持在40.00%以上，金标法检测IAV-Ag敏感度可达77.22%。一代测序和tNGS显示出检测IAV-RNA及其亚型的优势，IFA和CLIA显示出检测肺炎支原体IgM的优势。结论河南省南阳市IAVs常年流行，冬季为流行季。不同中心实验室不同检测方法对IAVs阳性检出率不同，选择IAV-RNA联合IAV-IgM检测可为临床提供准确的IAVs检测结果。

关键词：甲型流感病毒靶向高通量测序实验室检测流行

环状RNA在抗病毒固有免疫和甲型流感病毒感染中的作用

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病毒学报 2022年第6期38卷 1470-1477页

作者：王业魏凡华宁夏大学农学院银川750021

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种新型的非编码RNA,具有特殊的环状结构,由mRNA前体通过反向剪接产生。随着高通量测序技术的发展,人们发现环状RNA几乎存在于所有的生物体内,目前的研究表明,环状RNA具有多种生物学功能,在癌症、心脑... 详细信息

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种新型的非编码RNA,具有特殊的环状结构,由mRNA前体通过反向剪接产生。随着高通量测序技术的发展,人们发现环状RNA几乎存在于所有的生物体内,目前的研究表明,环状RNA具有多种生物学功能,在癌症、心脑血管等多种疾病中都发挥着重要作用。更重要的是,环状RNA也被证实参与病毒感染,并在抗病毒固有免疫中具有重要作用。本文对环状RNA的生物合成、分类和生物学功能以及其在抗病毒免疫和甲型流感病毒感染中的研究进展进行综述,旨在提供基于环状RNA的抗病毒新策略。

关键词：环状RNA 甲型流感病毒抗病毒免疫固有免疫

金荞麦水提物通过调控RIG-Ⅰ信号通路与细胞自噬抑制甲型流感病毒H1N1的复制

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中药药理与临床 2022年第1期38卷 103-110页

作者：张哲雯冯燕徐昌平高见吴巧凤浙江中医药大学药学院杭州310053 浙江省疾病预防控制中心杭州310057

目的:探讨金荞麦水提物体外抗甲型流感病毒H1N1的效果及其作用机制。方法:考察金荞麦水提物抗H1N1感染犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞的活性及作用方式;转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)分析金荞麦水提物处理后感染细胞... 详细信息

目的:探讨金荞麦水提物体外抗甲型流感病毒H1N1的效果及其作用机制。方法:考察金荞麦水提物抗H1N1感染犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞的活性及作用方式;转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)分析金荞麦水提物处理后感染细胞的基因差异表达,筛选与抗病毒相关的信号通路;蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测LC3Ⅱ的表达水平,荧光显微镜观察自噬流,分析金荞麦水提物对感染细胞自噬水平的影响。结果:金荞麦水提物具有良好的抑制细胞内H1N1复制的活性,细胞对MDCK 1.25 mg/mL抑制率为51.02%,5 mg/mL抑制率为98.22%。与模型对照组比较,金荞麦水提物处理感染细胞后,引起2682个基因差异表达。KEGG通路富集分析表明,差异表达基因富集在RIG-Ⅰ和细胞自噬信号通路。金荞麦水提物1.25、2.5、5 mg/mL处理的感染细胞中,LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著低于模型对照组(P<0.01),且出现自噬溶酶体。结论:金荞麦水提物具有显著体外抗H1N1的活性,其作用机制与对宿主细胞RIG-Ⅰ信号通路的调控,以及抑制感染诱导的细胞自噬相关。

关键词：金荞麦水提物甲型流感病毒转录组测序差异表达基因 RIG-Ⅰ信号通路细胞自噬

基于TLDA技术的甲型流感病毒高通量快速分型方法的建立及应用

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中华实验和临床病毒学杂志 2022年第3期36卷 311-316页

作者：楼秀玉赵翔王欣莹陈寅孙逸李榛余昭茅海燕浙江省疾病预防控制中心微生物检验所杭州310051 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

目的开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array,TLDA),可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定,适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法设计甲型流... 详细信息

目的开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array,TLDA),可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定,适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法设计甲型流感病毒通用、H1-16亚型、N1-9亚型的引物探针,并将其预先定制在TLDA反应芯片上;优化TLDA退火温度;用多种亚型的甲型流感病毒核酸进行10倍梯度稀释,结合微滴式数字PCR定量方法评价TLDA检测灵敏度;用乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞等其他多种常见的呼吸道病毒验证该TLDA检测特异性,同时选用多种已经明确分型的甲型流感病毒评价该TLDA的特异性和有效性;采集16例流感样病例标本及24例禽流感外环境标本用该芯片开展检测。结果该TLDA的最佳退火温度为60℃;针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9和H9N2,其检测灵敏度为1.52~8.00拷贝/μl;能特异性检测甲型流感病毒,与其他常见呼吸道病毒无交叉反应,并能精准鉴定多种甲型流感病毒的亚型;应用该方法检测16例流感样病例标本和24例禽流感外环境监测标本,均可分型。结论基于TLDA技术建立的甲型流感病毒高通量快速分型检测方法具有较好的灵敏度和特异性,适用于流感样病例和禽流感标本的病原快速检测,特别是对目前用常规商业化试剂尚无法鉴定的新型甲型流感病毒能够进行快速的亚型筛查与鉴定。

关键词： Taqman低密度芯片甲型流感病毒高通量检测

褪黑素通过抑制NLRP3介导的炎症反应及细胞焦亡减轻甲型流感病毒诱导肺上皮细胞损伤

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病毒学报 2023年第6期39卷 1541-1548页

作者：吕圣杰李春香吕园杨逢永山东第一医科大学附属人民医院济南271199 济南市第二妇幼保健院济南271199

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染引起肺上皮细胞损伤与Nod样受体蛋白3(Nod like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体介导的炎症反应及细胞焦亡相关。褪黑素对NLRP3炎症小体的激活具有抑制作用,为研究褪黑素对AV诱导肺上皮细胞... 详细信息

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染引起肺上皮细胞损伤与Nod样受体蛋白3(Nod like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体介导的炎症反应及细胞焦亡相关。褪黑素对NLRP3炎症小体的激活具有抑制作用,为研究褪黑素对AV诱导肺上皮细胞损伤的保护作用及机制,本研究通过细胞实验观察褪黑素通过抑制NLRP3介导的炎症反应及细胞焦亡减轻IAV诱导肺上皮细胞损伤。培养小鼠肺上皮细胞株MLE-12,按照MOI=0.2感染IAV,给予800μmol/L褪黑素或/和1.28μmol/L NLRP3激动剂BMS-986299干预,24h后检测细胞活力,细胞中细胞核增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N的mRNA表达和蛋白表达,培养基中白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的水平。结果显示,IAV组细胞活力、细胞中PCNA的mRNA表达和蛋白表达水平低于对照组,细胞中NLPR3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、GSDMD N端结构域(Gasdermin D-N,GSDMD-N)的mRNA表达和蛋白表达水平、培养基中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、IL-1β、IL-18、TNF-α的水平高于对照组(P0.05);褪黑素+NLRP3激动剂组细胞活力、细胞中PCNA的mRNA表达和蛋白表达水平低褪黑素组,细胞中Caspase-1、GSDMD-N的mRNA表达和蛋白表达水平、培养基中LDH、IL-1β、IL-18、TNF-α的水平高于褪黑素组(P0.05)。以上结果表明,褪黑素组减轻IAV诱导肺上皮细胞损伤,相关的分子机制是抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应和细胞焦亡。

关键词：甲型流感病毒肺上皮细胞损伤褪黑素 NLRP3炎症小体炎症反应细胞焦亡

甲型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的研制

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微生物学报 2010年第3期50卷 400-405页

作者：李稀罕王宇刘方政顾宏伟杨永华南京大学病毒学研究所医药生物技术国家重点实验室南京210093 泰州亲和力生物技术有限公司泰州225300 泰州市病毒研究所泰州225300

【目的】研制一种可同时对甲型流感病毒H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种流行亚型进行检测和分型的基因芯片。【方法】根据National Center for Biotechnology Information中Influenza Virus Resource数据库,针对H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种亚型甲型流感病毒的HA和NA基因设计46条特异性寡核苷酸探针和1条质控探针,点制成基因芯片。利用通用引物扩增流感病毒HA和NA基因,使用Klenow酶对扩增产物进行荧光标记和片段化,将标记后产物和芯片杂交,清洗、扫描后根据荧光信号判定检测结果。用18株不同种属来源的甲型流感病毒分离毒株和186份咽拭子对芯片特异性、敏感性和临床应用进行初步评价。【结果】所有18株分离毒株均能被芯片准确检测并分型,芯片检测灵敏度能达约1×104个病毒基因拷贝。同时8份咽拭子检测结果为H1N1阳性,4份咽拭子为H3N2阳性。【结论】研究表明该芯片具有较高的特异性和灵敏度,可为甲型流感病毒的监测提供一种有效的方法。

关键词：甲型流感病毒基因芯片检测

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

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病毒学报 2011年第1期27卷 50-57页

作者：黄保英王文玲王秀平蒋涛谭文杰阮力中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒病应急技术中心北京100052

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt... 详细信息

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。

关键词：甲型流感病毒核蛋白原核系统密码子优化蛋白质表达

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儿童甲型流感病毒肺炎临床特征及危险因素

中华医院感染学杂志 2023年第23期33卷 3664-3668页

作者：陈梅陈芳李鹏高毅张世玲郑州大学附属儿童医院、河南省儿童医院郑州儿童医院、河南省儿童感染与危重症诊治工程研究中心东三街急诊医学科河南郑州450000 郑州大学附属儿童医院、河南省儿童医院郑州儿童医院、河南省儿童感染与危重症诊治工程研究中心南区急诊医学科河南郑州450000

目的分析甲型流感病毒肺炎患儿的发病现况、高危因素。方法回顾性收集186例2020年6月-2022年6月河南省儿童医院收治的甲型流感病毒感染患儿为研究对象,根据患儿是否发生肺炎,分为肺炎组(n=42)和非肺炎组(n=144)。患儿入院就诊时,采集其... 详细信息

目的分析甲型流感病毒肺炎患儿的发病现况、高危因素。方法回顾性收集186例2020年6月-2022年6月河南省儿童医院收治的甲型流感病毒感染患儿为研究对象,根据患儿是否发生肺炎,分为肺炎组(n=42)和非肺炎组(n=144)。患儿入院就诊时,采集其鼻咽分泌物、肺部痰液进行病原检测,收集两组临床资料,统计甲型流感病毒肺炎患儿的发病现况,并利用单因素和多因素Logistic回归法分析其危险因素。结果甲型流感病毒肺炎在儿童中的发病率为22.58%,其占比前三的年龄段为>12且≤36个月(42.86%)、>6且≤12个月(26.19%)、>36且≤60个月(19.05%),病情程度以轻度为主,临床症状多为呼吸道症状和肺部出现啰音,胸部影像病变部位多为双肺,易合并细菌感染;男性、发病至首次就诊时间>48 h、发病至抗病毒治疗时间>48 h、肺部出现啰音是甲型流感病毒肺炎的危险因素(P甲型流感病毒肺炎的发病率较高,以轻度肺炎、双肺病变为主,易合并细菌感染;男性、发病至首次就诊或抗病毒治疗时间长、肺部出现啰音的儿童发病风险较高,据此可给予针对性的预防干预及治疗措施。

关键词：甲型流感病毒肺炎患儿临床表现危险因素预测模型