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甲型流感病毒感染A549细胞环状RNA表达谱与hsa＿circ＿0070421功能的初步研究

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甲型流感病毒感染A549细胞环状RNA表达谱与hsa＿circ＿0070421功...

作者：张玳宁吉林大学

学位级别：硕士

环状RNA（Circular RNA,circRNA）是一种两端闭合的环形非编码RNA分子,少数可编码蛋白质,是一类具有重要生物学功能的调控型RNA,其在病毒感染过程中也发挥重要功能。甲型流感病毒（Influenza A Virus,IAV）属于正黏病毒科单股负链RNA病... 详细信息

环状RNA（Circular RNA,circRNA）是一种两端闭合的环形非编码RNA分子,少数可编码蛋白质,是一类具有重要生物学功能的调控型RNA,其在病毒感染过程中也发挥重要功能。甲型流感病毒（Influenza A Virus,IAV）属于正黏病毒科单股负链RNA病毒,是具有高度传染性的人畜共患病病原体。IAV能够在鸟类和哺乳动物等多种动物中持续传播,对人类、家畜和野生动物的健康构成严重威胁。但目前对circRNA在流感病毒方面的研究还相对较少。本研究旨在探究甲型流感病毒感染对A549细胞内circRNA表达模式的影响,并就hsa＿circ＿0070421在IAV感染中的功能进行了初步研究。首先,应用基因芯片技术获得了IAV感染前后A549细胞circRNA表达谱。筛选出差异显著表达的circRNA,预测差异Top10的circRNA的mi RNA的靶基因,并对靶基因进行GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG通路分析。结果显示IAV感染A549细胞前后,共有373个circRNA表达差异显著,即207个表达上调和166表达下调。GO分析表明,差异circRNA的潜在生物学功能主要分布在转录调控、细胞代谢的正向调控、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、细胞间信号传递、神经系统发育等;KEGG通路分析显示,表达差异circRNA潜在相关信号通路主要分布在信号传递相关、癌症、趋化因子、细胞增殖和凋亡、MAPK等相关信号通路。通过对随机选出5个差异表达显著circRNA进行了q PCR验证,结果与芯片数据一致。其次,为了探究表达显著上调circRNA之一的hsa＿circ＿0070421与IAV感染的关系,我们进行了以下实验:（1）hsa＿circ＿0070421的成环情况进行鉴定。（2）检测了IAV感染不同条件下A549细胞内hsa＿circ＿0070421的表达情况,结果显示hsa＿circ＿0070421与病毒感染时间和感染剂量呈显著正相关,说明hsa＿circ＿0070421的表达与IAV感染关系密切。（3）在选取的5种不同器官和组织来源细胞系内均可检测到hsa＿circ＿0070421的表达,表明hsa＿circ＿0070421是一个广泛存在的circRNA。（4）在Polyinosinic:polycytidylic acid（poly I:C）、细菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）、顺铂（cisplatin）和血清饥饿处理后的A549细胞中分别检测hsa＿circ＿0070421的表达水平,结果表明hsa＿circ＿0070421的表达增加与poly I:C的刺激明显相关,而与LPS、cisplatin以及血清饥饿处理关系不大,说明hsa＿circ＿0070421表达上调是宿主细胞应答IAV复制的结果。（5）使用不同信号通路抑制剂的实验证实hsa＿circ＿0070421的表达是IAV感染所致JAK-STAT信号通路激活的产物。最后,为了明确hsa＿circ＿0070421在IAV感染中所扮演的角色,在A549细胞中对hsa＿circ＿0070421进行过表达和敲低并检测后续指标变化,结果表明hsa＿circ＿0070421过表达抑制了病毒复制,并且促进了IAV感染诱导的干扰素刺激应答元件（Interferon Stimulated Response Element,ISRE）荧光素酶报告基因活性和Ifnb1 m RNA的表达;反之,hsa＿circ＿0070421的敲低促进了IAV复制并抑制了病毒感染诱导的ISRE活性以及Ifnb1 m RNA的表达,说明hsa＿circ＿0070421可以正调控I型干扰素相关的抗病毒天然免疫应答,并抑制IAV的复制。综上所述,本研究揭示了circRNA的表达与IAV感染的联系,证实了hsa＿circ＿0070421是一个具有正调控I型干扰素天然免疫应答功能的宿主抗IAV因子。

关键词：环状RNA hsa＿circ＿0070421 甲型流感病毒 JAK-STAT信号通路

靶向甲型流感病毒血凝素蛋白的广谱抗体制备及鉴定

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第8期42卷 636-641页

目的制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的广谱抗体FHA3,并对其进行鉴定。方法依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构... 详细信息

目的制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的广谱抗体FHA3,并对其进行鉴定。方法依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合,且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性,在低浓度下(5μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞,在0.0125μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

关键词：甲型流感病毒血凝素广谱中和活性

基于甲型流感病毒血凝素及联用其他保守表位的通用流感疫苗研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第11期43卷 813-822页

作者：邓玉莹刘书珍李岚舒赵晨燕黄维金中国食品药品检定研究院生物制品检定所艾滋病性病病毒疫苗室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法与标准化重点实验室北京102629

流感病毒每年造成大量感染及死亡病例,对人类健康构成重大威胁,接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效措施。然而,目前的季节性流感疫苗只能预防密切匹配的流行毒株,即使有了广泛的监测和每年的重新制定,每年更新的疫苗仍然比快速演变的... 详细信息

流感病毒每年造成大量感染及死亡病例,对人类健康构成重大威胁,接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效措施。然而,目前的季节性流感疫苗只能预防密切匹配的流行毒株,即使有了广泛的监测和每年的重新制定,每年更新的疫苗仍然比快速演变的病毒落后一步,往往导致匹配度不高或疫苗效力低。由于甲型流感病毒的进化变异相对复杂,利用一系列创新技术开发通用流感疫苗对流感病毒提供广泛和持久的保护,是预防流感流行的新思路和新手段。本文对近3年来以血凝素(hemagglutinin,HA)为靶位的通用疫苗研究进行全面整理,综述了基于流感病毒全HA、HA茎部、串联HA和其他保守表位的通用疫苗设计方法及其在疫苗研究中取得的最新进展,同时比较了不同技术优劣和免疫程序及策略的影响等,并强调了有待克服的潜在挑战,为成功开发通用疫苗提供经验和借鉴。

关键词：甲型流感病毒血凝素保守表位通用流感疫苗

新型冠状病毒和甲型流感病毒双价DNA疫苗的构建与免疫原性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第9期42卷 683-690页

作者：翟程程韩頔邓瑶任皎王文王东红王文玲高龙谭文杰内蒙古科技大学包头医学院公共卫生学院包头014000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会生物安全重点实验室北京102206

目的构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)和甲型流感病毒双价DNA疫苗,并在小鼠模型中评价其免疫原性。方法将SARS-CoV-2 Beta突变株S1蛋白编码序列和甲型流感病毒Cambodia(H3N2)株HA蛋白编码序列进行密码子优化合成,采用Over-lapping PCR方法,将两个编码基因通过自裂解2A肽(self-cleaving 2A peptides)序列连接成S1-2A-HA片段,构建能同时表达S1蛋白和HA蛋白的双价DNA疫苗,命名为pVRC-S1-2A-HA,间接免疫荧光和Western blot验证S1蛋白和HA蛋白的表达。将DNA疫苗以肌肉注射加电转途径(IM+EP)免疫BALB/c小鼠,间接ELISA、假病毒中和试验和血凝抑制试验检测小鼠体液免疫应答,IFN-γELISPOT、胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)和CBA法检测小鼠细胞免疫应答。结果双价DNA疫苗pVRC-S1-2A-HA可以同时表达S1蛋白和HA蛋白,初次免疫后能够显著诱导小鼠产生针对S1蛋白的特异性细胞免疫和针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体;加强免疫后特异性免疫应答都显著增强,针对S1蛋白的特异性IgG结合抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)提高至3251,细胞免疫提高至1238 SFC/106个细胞,针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体GMT达到45407。ICS法检测到疫苗加强免疫可诱导小鼠CD4+和CD8+T细胞产生IL-2、IFN-γ、TNF-α;CBA结果显示单针免疫后小鼠脾细胞分泌多种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ)。结论本研究成功构建能同时表达SARS-CoV-2 S1蛋白和甲型流感病毒H3N2亚型HA蛋白的双价DNA疫苗,该疫苗可诱导产生针对S1蛋白和HA蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫应答,具有较好的研发与应用前景。

关键词：新型冠状病毒甲型流感病毒 DNA疫苗体液免疫细胞免疫

新型冠状病毒和甲型流感病毒双价疫苗研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第12期43卷 986-992页

作者：郭晓炎翟程程王君内蒙古医科大学基础医学院呼和浩特010110 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会生物安全重点实验室北京102206

新型冠状病毒及其变异株在世界范围内的持续蔓延,对全球经济和公共卫生造成了严重威胁。同属于呼吸道病毒的甲型流感病毒是流感的主要病原体,其宿主范围广泛,易发生变异,每20~40年暴发一次的流感大流行、每年的季节性流感、重症流感或... 详细信息

新型冠状病毒及其变异株在世界范围内的持续蔓延,对全球经济和公共卫生造成了严重威胁。同属于呼吸道病毒的甲型流感病毒是流感的主要病原体,其宿主范围广泛,易发生变异,每20~40年暴发一次的流感大流行、每年的季节性流感、重症流感或动物流感病毒都严重威胁公众健康。以上两种病原感染后的临床症状极为相似。针对这两种呼吸道疾病的交替流行或共同感染,开发有效的双价疫苗具有重要意义。本综述主要介绍基于不同平台的新型冠状病毒和甲型流感病毒双价疫苗的研发进展。

关键词：新型冠状病毒甲型流感病毒双价疫苗免疫保护

甲型流感病毒T细胞表位的预测及HLA-A2限制性抗原肽筛选

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甲型流感病毒T细胞表位的预测及HLA-A2限制性抗原肽筛选

作者：韩雪北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:为了应对流感病毒的突变带来的公共卫生问题,研发一种对多种亚型毒株感染提供交叉保护的通用流感疫苗,这将是对抗流感最有效的方法。本文利用免疫信息学技术对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)限制性甲型流感病毒T细... 详细信息

目的:为了应对流感病毒的突变带来的公共卫生问题,研发一种对多种亚型毒株感染提供交叉保护的通用流感疫苗,这将是对抗流感最有效的方法。本文利用免疫信息学技术对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)限制性甲型流感病毒T细胞表位进行预测,以期获得通用流感疫苗候选抗原肽。方法:以A/Califomia/7/2009(H1N1)为原始毒株,选取流感病毒保守的蛋白聚合酶复合物 1(polymerasebasic],PB1)、核内部蛋白(nucleocapsidprotein,NP)、基质蛋白 1(matrixprotein 1,M1)和基质蛋白 2(matrixprotein2,M2)蛋白,通过免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)进行HLA限制性甲型流感病毒T细胞表位的预测,通过表位分析工具进行簇分析和人群覆盖率分析,筛选出HLA-A*02:01限制性抗原肽;利用SYFPHETHI数据库进行抗原肽与HLA-A*02:01分子结合能力评分;利用HPEPDOCK Web服务器模拟HLA-A*02:01分子与候选抗原肽之间的真实状态构建出结合模型,并进行与HLA-A*02:01结合的亲和性与稳定性验证。获得具有高亲和性和稳定性的抗原肽PB1-395(LLIDGTASL)进行氨基酸序列改变,观察抗原肽与HLA-A*02:01分子结合的性质是否改变,并且进行突变抗原肽3D模型构建、抗原肽亲和性和稳定性试验。结果:(1)本研究共获得甲型流感病毒T细胞表位208个,包括75个PB1表位,78个NP表位和55个M1表位,全球人群覆盖率达到95%以上。获得HLA-A*02:01限制性抗原肽6条,可覆盖全球76.98%的人群。(2)新发现的HLA-A*02:01限制性抗原肽PB1-395(LLIDGTASL),对HLA-A*02:01分子的亲和性和稳定性均优于其他抗原肽,抗原肽PB1-395的亲和性高于抗原肽M1-58(P1.5,DC50>8 H),但与PB1-395(LLIDGTASL)相比其亲和性较弱。结论:(1)通过多种预测工具的运用可快速获得目标表位。(2)PB1-395(LLIDGTASL)具有与HLA-A*02:01分子结合的较高亲和性和稳定性,可覆盖到多种流感病毒毒株,可作为通用流感疫苗候选抗原肽并进行下一步研究。(3)虽然经氨基酸改变后的抗原肽PB1-L-395-I(ILIDGTASL)和PB1-S-402-P(LLIDGTAPL)仍具有与HLA-A*02:01分子结合的较高亲和性和稳定性,但是氨基酸种类改变会使与HLA-A*02:01分子结合亲和性降低。

关键词：甲型流感病毒 T细胞表位预测 HLA-A*02:01 免疫信息学

携带TAP标签的重组甲型流感病毒的构建与鉴定

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微生物学报 2023年第2期63卷 601-609页

作者：谭琳张文钰潘明磊张磊曹萌萌邓涛北京协和医学院病原生物学研究所北京102600 中国科学院微生物研究所北京100101

【目的】将TAP标签构建到WSN病毒基因组上,得到含有TAP标签的重组流感病毒,以便进行后续的病毒追踪。【方法】利用反向遗传学技术,对甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的PA片段进行改造来插入TAP(tandemaffinitypurification)标签序列。通过... 详细信息

【目的】将TAP标签构建到WSN病毒基因组上,得到含有TAP标签的重组流感病毒,以便进行后续的病毒追踪。【方法】利用反向遗传学技术,对甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的PA片段进行改造来插入TAP(tandemaffinitypurification)标签序列。通过病毒拯救得到表达外源标签TAP的重组流感病毒WSNPA-TAP,并对拯救出的重组病毒进行生物学鉴定。【结果】成功拯救出重组流感病毒并命名为WSN PA-TAP。重组病毒基因组测序表明重组病毒的序列正确,利用RNA银染技术观察到重组病毒的全基因组片段。重组流感病毒WSN PA-TAP在MDCK细胞上测定生长曲线,发现该重组病毒的复制能力比野生型WSN弱;Westernblotting检测到PA-TAP融合蛋白的表达,其分子质量为96 kDa。【结论】成功拯救出能够表达外源标签TAP的重组流感病毒WSN PA-TAP,为筛选与甲型流感病毒聚合酶有关的宿主蛋白的研究提供了新思路,同时也为以甲型流感病毒为载体携带外源基因的探索提供了重要依据。

关键词：甲型流感病毒串联亲和纯化反向遗传学

基于甲型流感病毒H1N1亚型血凝素的mRNA疫苗制备和加强免疫策略研究

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上海交通大学学报（医学版） 2023年第11期43卷 1374-1383页

作者：沈海浅俞康莹陈颖盈季萍王颖上海交通大学医学院上海市免疫学研究所上海200025 上海市病毒研究院上海200025

目的制备甲型流感病毒H1N1亚型血凝素(hemagglutinin,HA)mRNA疫苗,并探讨不同加强免疫策略的免疫保护作用。方法以荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)为报告基因,构建Fluc mRNA-脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)疫苗,通过小鼠活体... 详细信息

目的制备甲型流感病毒H1N1亚型血凝素(hemagglutinin,HA)mRNA疫苗,并探讨不同加强免疫策略的免疫保护作用。方法以荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)为报告基因,构建Fluc mRNA-脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)疫苗,通过小鼠活体成像实验鉴定Fluc mRNA-LNP疫苗肌内注射后在体内的表达情况。进一步构建H1N1亚型(A/Michigan/45/2015)HA(M15-HA)的mRNA-LNP疫苗,将20、10、5和1μg M15-HA mRNA-LNP疫苗通过肌内注射分别免疫不同剂量组小鼠2次(间隔3周),酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定小鼠第2次免疫2周和4周后血清抗体滴度,血凝抑制试验检测功能性抗体水平。第2次免疫后40 d,采用1μg mRNA疫苗或10μg HA蛋白亚单位疫苗对1μg剂量免疫组小鼠进行加强免疫,接种2周和4周后用ELISA和血凝抑制试验分别检测特异性抗体及功能性抗体水平。结果活体成像实验结果显示,小鼠接种Fluc mRNA-LNP疫苗1 d后即能在小鼠体内检测到荧光素酶活性。制备获得的M15-HA mRNA-LNP疫苗2次免疫小鼠2周和4周后,所有剂量组小鼠的特异性抗体水平均较免疫前显著上升(均P=0.000);血凝抑制试验结果显示,20μg和10μg剂量组的功能性抗体水平均较PBS对照组显著升高(均P<0.05)。对1μg低剂量组小鼠进行HA蛋白或M15-HA mRNA-LNP的加强免疫后,均诱导产生了更高水平的特异性抗体和功能性抗体,并能维持较长时间;2种不同加强免疫策略之间差异无统计学意义。结论成功制备M15-HA mRNA-LNP疫苗,显示出良好的免疫原性和抗体中和活性;低剂量mRNA疫苗免疫2次后,同源mRNA疫苗和异源蛋白疫苗加强免疫均可以诱导更强的免疫反应。

关键词：流感疫苗甲型流感病毒血凝素 mRNA疫苗加强免疫

甲型流感病毒H1N1来源circRNA的发现与功能研究

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甲型流感病毒H1N1来源circRNA的发现与功能研究

作者：王旌羽辽宁大学

学位级别：硕士

甲型流感病毒是一种单股负链,分节段、有囊膜的RNA病毒,属正粘病毒科。由于病毒易变异,防控困难,历史上多次造成大规模甲流疫情,因此成为公共卫生安全的重要防控对象之一,也是病毒学研究的重点对象。随着研究的不断深入,流感病毒的感染... 详细信息

甲型流感病毒是一种单股负链,分节段、有囊膜的RNA病毒,属正粘病毒科。由于病毒易变异,防控困难,历史上多次造成大规模甲流疫情,因此成为公共卫生安全的重要防控对象之一,也是病毒学研究的重点对象。随着研究的不断深入,流感病毒的感染机制在蛋白质水平研究较多,但病毒能否产生环状RNA(circular RNA,circRNA)及其生物学功能还未见报道。因此,本研究针对甲型流感病毒circRNA开展研究,研究结果如下:1.基于生物信息学预测结果,筛选潜在的病毒来源circRNA,通过反向引物扩增,发现H1N1的核蛋白(Nucleoprotein,NP)基因所在负链RNA能够产生一条circRNA,命名为circNP37。滚环扩增、核糖核酸酶R(Ribonuclease R,RNase R)消化实验、全环序列扩增及非反式反向剪接产物验证实验进一步验证了该circRNA的环形结构。2.为揭示circNP37在病毒侵染过程中的生物学作用,构建circNP37缺失病毒及circNP37表达质粒,通过感染实验观察circNP37对流感病毒复制的影响。结果显示,在缺失circNP37的条件下,病毒复制、转录及子代病毒的滴度减弱,通过过表达质粒回复circNP37后病毒复制随之恢复。此外,寡核苷酸敲降circNP37实验指出circNP37缺失后病毒复制下降。可见,circNP37的存在有利于病毒复制。3.为解析circNP37发挥生物学作用的机制,首先通过核质分离实验检测到在病毒侵染过程中circNP37主要定位在细胞质,推测circNP37可能通过与micro RNA(miRNA)相互作用发挥功能;通过生物信息学手段预测到7条与circNP37相互作用的宿主miRNA分子,经检验,其中4条miRNA在缺失circNP37病毒侵染过程中表达升高,4条miRNA中的2条在circRNA pull-down实验中能够被circNP37下拉。最后双荧光素酶实验显示,2条miRNA中的hsa-miR-361-5p具有直接性靶向circNP37的作用;在病毒侵染条件下检测hsa-miR-361-5p对circNP37的影响,发现细胞中circNP37的表达水平被hsa-miR-361-5p抑制;并通过p LC5 GFP荧光变化进一步验证circNP37与miR-361-5p相互作用关键结合位点。4.为进一步探究hsa-miR-361-5p对病毒复制影响的机制,首先通过生物信息学预测hsa-miR-361-5p可能靶向的病毒m RNA,并通过miRNA pull-down及病毒m RNA pull-down进行验证,发现hsa-miR-361-5p靶向流感病毒聚合酶碱性蛋白2(Polymerase basic protein 2,PB2)的m RNA。在病毒感染及单独转染PB2表达质粒的条件下,敲低、过表达hsa-miR-361-5p,发现hsa-miR-361-5p能够抑制PB2的蛋白表达。5.为验证circNP37/hsa-miR-361-5p/PB2-m RNA三者关系,在野生型病毒感染及非感染条件下上调及下调hsa-miR-361-5p,检验PB2转录与翻译变化,发现circNP37对PB2蛋白表达具有促进作用,而hsa-miR-361-5p的存在可以抑制circNP37对PB2表达的促进作用。上述研究结果表明,在病毒侵染过程中circNP37通过吸附hsa-miR-361-5p,促进PB2-m RNA的翻译,由此促进病毒复制。综上所述,该研究首次发现了流感病毒circRNA的存在,并证明了其在病毒感染过程中发挥的作用及机制,研究结果将为流感病毒的研究打开新的视角,让我们对流感病毒的感染机制有了更为全面的认识。

关键词：甲型流感病毒 circRNA miRNA 病毒复制感染机制