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甲型副伤寒沙门氏菌蛋白指纹图谱的建立

细胞与分子免疫学杂志 2012年第6期28卷 576-579页

作者：李晓庆黄文方刘华杨永长肖代雯闫慧罗春丽重庆医科大学医学检验系临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 四川省医学科学院四川省人民医院四川成都610072

目的:利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱建立甲型副伤寒沙门氏菌蛋白指纹图谱。方法:收集临床中分离获得的甲型副伤寒沙门氏菌36株,同时采集对照菌96株,对所收集的细菌利用16S rDNA测序技术进行分子生物学验证鉴定。利用表面增强激... 详细信息

目的:利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱建立甲型副伤寒沙门氏菌蛋白指纹图谱。方法:收集临床中分离获得的甲型副伤寒沙门氏菌36株,同时采集对照菌96株,对所收集的细菌利用16S rDNA测序技术进行分子生物学验证鉴定。利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱检测细菌蛋白,ProteinChip和Biomarker Wizard软件自动采集数据,将结果用BioMarker Patterns软件建立分类树鉴定模型,并进行盲法验证。结果:在相对分子质量(Mr)3 000～20 000范围内,捕获104个蛋白峰,其中90个蛋白峰差异有统计学意义(P甲型副伤寒沙门氏菌的分类树模型,甲型副伤寒沙门氏菌诊断的灵敏度和特异度通过盲法验证为100%。结论:采用SELDI-TOF MS技术建立的甲型副伤寒沙门氏菌的分类树诊断模型,可用于该菌的快速鉴定。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌 SELDI—TOF—MS 蛋白指纹图谱

甲型副伤寒沙门氏菌cdtB亚基的原核表达及对巨噬细胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影响

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中国人兽共患病学报 2016年第6期32卷 535-538,546页

作者：陈鸿鹄吴圆圆占利梅玲玲浙江省疾病预防控制中心微生物所杭州310051 浙江大学医学院附属儿童医院实验检验中心杭州310003

目的研究甲型副伤寒沙门氏菌感染过程中,cdtB对宿主巨噬细胞分泌促炎细胞因子的影响。NF-κB信号通路阻断剂对cdtB诱导的巨噬细胞分泌细胞因子的影响。方法对甲型副伤寒沙门氏菌cdtB亚基进行原核表达,制备并模型纯化重组蛋白,建立其刺激... 详细信息

目的研究甲型副伤寒沙门氏菌感染过程中,cdtB对宿主巨噬细胞分泌促炎细胞因子的影响。NF-κB信号通路阻断剂对cdtB诱导的巨噬细胞分泌细胞因子的影响。方法对甲型副伤寒沙门氏菌cdtB亚基进行原核表达,制备并模型纯化重组蛋白,建立其刺激人THP-1巨噬细胞模型,ELISA检测THP-1分泌IL-6,IL-8和TNF-α等细胞因子。在共培养体系中加入NF-κB信号通路阻断剂,ELISA检测THP-1分泌IL-6,IL-8和TNF-α等细胞因子。结果成功构建甲型副伤寒沙门氏菌cdtB原核表达系统,表达并纯化重组cdtB蛋白,与空白对照相比,受到cdtB刺激的THP-1细胞上清中的IL-6,IL-8和TNF-α浓度显著上升,而在THP-1细胞培养基中加入NF-κB信号通路阻断剂SN50可以显著抑制重组cdtB诱导的IL-6、IL-8、TNF-α分泌。结论甲型副伤寒沙门氏菌cdtB能够通过NF-κB信号通路诱导巨噬细胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α,在甲型副伤寒相关的炎症反应中发挥促进作用。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌 cdtB 细胞因子巨噬细胞

甲型副伤寒沙门氏菌HmpA蛋白的表达纯化及生物学特征预测

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食品工业科技 2023年第24期44卷 131-138页

作者：王磊刘小草董雨王雪婷柴徵微李吉丁爱军张维明曾韦锟昆明学院医学院云南昆明650214

目的:原核表达甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)HmpA蛋白,并对其进行生物信息学分析,为研究副甲菌HmpA蛋白对于宿主体内一氧化氮(NO)信号通路的影响提供理论参考。方法:PCR扩增hmpA基因,亚克隆至T载体后,再构建pNdeI-hmpA表... 详细信息

目的:原核表达甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)HmpA蛋白,并对其进行生物信息学分析,为研究副甲菌HmpA蛋白对于宿主体内一氧化氮(NO)信号通路的影响提供理论参考。方法:PCR扩增hmpA基因,亚克隆至T载体后,再构建pNdeI-hmpA表达载体,转化BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDSPAGE检测蛋白表达形式,利用Histrap预装柱亲和纯化HmpA蛋白,并用Western blot鉴定,生物信息学多方法分析HmpA蛋白特征。结果:成功构建了原核表达载体pNdeI-hmpA,低温诱导时,HmpA蛋白以包涵体和可溶表达形式并存;纯化后的HmpA蛋白可被His标签抗体检测。生物信息学分析提示HmpA蛋白为亲水性蛋白;无跨膜结构域、无信号肽;蛋白二级结构主要由α螺旋与不规则卷曲构成,三级结构模型类似环状;蛋白结构域分析表明含有1个功能结构域,属于PRK13289超级家族;共有32个磷酸化位点;与沙门氏菌多个降解硝酸盐和杀伤性NO的蛋白酶或转录因子存在关联。结论:本研究成功利用基因工程技术获得了甲型副伤寒沙门氏菌HmpA蛋白,并通过生物信息学方法预测了其部分生物学特征,为后续揭示甲型副伤寒沙门氏HmpA蛋白对于宿主体内的一氧化氮信号通路的影响提供理论支持。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌原核表达 HmpA蛋白蛋白纯化生物信息学分析

肉制品加工中脂肪对甲型副伤寒沙门氏菌rpoE的应激特性

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中国食品学报 2019年第4期19卷 155-160页

作者：王亚飞李苗云崔文明赵改名柳艳霞高晓平河南农业大学食品科学技术学院河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室郑州450002 中检集团中原农食产品检测(河南)有限公司郑州450002

目的:为了解甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株和野生株在肉制品加工过程不同介质中的热应激响应特征,并进一步探究肉制品加工中脂肪对甲型副伤寒沙门氏菌rpoE表达的影响。方法:以55,63,72℃对接种108CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野... 详细信息

目的:为了解甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株和野生株在肉制品加工过程不同介质中的热应激响应特征,并进一步探究肉制品加工中脂肪对甲型副伤寒沙门氏菌rpoE表达的影响。方法:以55,63,72℃对接种108CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野生株在不同介质下进行热处理,测定处理后样品中甲型副伤寒沙门氏菌的残存数量,比较缺陷株和野生株在不同介质下的失活情况,对野生株和缺陷株在不同介质下的耐热情况进行分析,然后以Real-time PCR法检测野生株在近似巴氏杀菌条件下不同介质中热处理后的残存菌体样本的rpoE基因的表达水平,比较脂肪对rpoE表达水平的影响。结果:缺陷株和野生株D值之间存在显著性差异(P菌株更耐热,野生株在肥瘦1∶1和纯瘦肉介质的近似巴氏杀菌条件下,表达上调水平分别为3.53,3.29倍,且不存在显著性差异(P>0.05)。结论:肉制品在巴氏杀菌近似条件下,甲型副伤寒沙门氏菌通过提高rpoE的表达水平来增加甲型副伤寒沙门氏菌的耐热性。脂肪对菌株的耐热性起重要作用,并不会通过调节rpoE的表达来提高耐热性。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌 rpoE D值脂肪耐热性

甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的表达及其免疫保护性研究

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甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的表达及其免疫保护性研究

作者：刘春梅南昌大学

学位级别：硕士

伤寒是一种急性全身性感染，每年全球伤寒(包括副伤寒)患者约2200万，死亡超过20万人。伤寒包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A，B and C)引起的副伤寒。近年来我国甲... 详细信息

伤寒是一种急性全身性感染，每年全球伤寒(包括副伤寒)患者约2200万，死亡超过20万人。伤寒包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A，B and C)引起的副伤寒。近年来我国甲型副伤寒的发病率呈逐年上升趋势，研究出安全、高效、经济的疫苗，对于预防甲型副伤寒爆发具有重大的经济社会效益。甲型副伤寒沙门氏菌是无荚膜的革兰氏阴性菌，其外膜蛋白在致病和刺激机体免疫应答方面起着非常重要的作用。因此，在研究和开发疫苗中，病原体的外膜蛋白成为热点。本论文对甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫保护性进行了研究，目的在于探索应用甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白作为保护性抗原，获得甲型副伤寒候选疫苗的可能性。本课题选择毒力较强的甲型副伤寒沙门氏菌50973做为实验菌株，以NmpC、MipA、OmpW、PagC、OmpX、PomP(GI：56412276)、OmpC、FadL、TolC、BtuB和Imp等11个外膜蛋白为目标蛋白，分别将其基因的PCR扩增片段克隆到pET-32a表达载体，筛选出阳性克隆，用IPTG作为诱导剂，实现了这11种目标外膜蛋白的过量表达。利用这些过表达目标蛋白在盐溶液中形成沉淀而在水中可溶的特性实现了目标蛋白的有效分离。采用腹腔注射和体内攻毒的方法对纯化好的外膜蛋白的免疫保护性进行了研究，结果表明，PagC、OmpX、NmpC、FadL、TolC和BtuB等6个外膜蛋白具有良好的免疫保护力，其保护率分别为100％、100％、95％、75％、75％和70％。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白克隆过量表达体内攻毒免疫保护性

甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50973外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究

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甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50973外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究

作者：王斌中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

伤寒是一种急性全身性感染，包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A，B and C)引起的副伤寒。甲型副伤寒沙门氏菌是甲型副伤寒的病原菌，通过粪—口途径传播，感染剂量为10... 详细信息

伤寒是一种急性全身性感染，包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A，B and C)引起的副伤寒。甲型副伤寒沙门氏菌是甲型副伤寒的病原菌，通过粪—口途径传播，感染剂量为10～10，人是唯一宿主。人群对甲型副伤寒沙门氏菌普遍易感，但儿童和青壮年发病最高。现在据估计每年全球伤寒(包括副伤寒)患者约2200万，死亡超过20万人。自1996年以来，我国的甲型副伤寒的发病率也在逐年升高。更为严重的是，甲型副伤寒沙门氏菌临床耐药株以及多重耐药株(MDR)已经相当广泛，使临床治疗变得更加困难，一些患者由于治疗不彻底而成为带菌者。因此，需要研究出安全、高效、简便、经济的疫苗来预防甲型副伤寒。免疫蛋白质组学是通过双向电泳分离病原蛋白质组，再用不同病人的超免血清鉴定出有强免疫性的蛋白，这一蛋白质组的分支，很有希望成为寻找药物和疫苗靶位的有效途径(因为证明这些蛋白能引起宿主的免疫应答)。甲型副伤寒沙门氏菌是无荚膜的革兰氏阴性菌，其外膜蛋白在致病和刺激机体免疫应答方面有非常重要的作用。因为细菌的膜蛋白(尤其是外膜蛋白)抗原，往往是一些反应性抗原，它们与机体免疫系统有十分密切的相互作用。因此，在疫苗研究中，病原体的表面蛋白具有很重要的地位。本实验提取了甲型副伤寒沙门氏菌的外膜蛋白，建立了甲型副伤寒沙门氏菌的外膜蛋白双向电泳参考图谱。在考马斯亮兰染色的胶上共取了80个外膜蛋白点，鉴定出61个，代表30种蛋白。结合根据基因组预测的外膜蛋白对鉴定的所有蛋白质点的等电点/分子量吻合程度、分布以及功能分类等进行了初步的分析。进一步采用免疫蛋白质组的方法，对提取细菌的外膜蛋白进行双向电泳分离后，再转移到PVDF膜上，与甲型副伤寒病人恢复期的血清进行免疫印迹反应，记录具有免疫反应的外膜蛋白点。在考马斯亮兰染色的胶上取外膜蛋白点以及有免疫反应的蛋白点，酶切后进行MALDI-TOF质谱鉴定。在PVDF膜上共有45个免疫反应点，鉴定到42个点，代表23种蛋白质抗原，采用psort(***)软件分析，外膜蛋白13种，胞质蛋白3种，定位不明确(可能是多处定位)1种，未知定位6种。这些蛋白有希望成为药靶或疫苗的候选成分。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌免疫蛋白质组学外膜蛋白

甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白免疫原性研究及其菌体抗原单克隆抗体的制备

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甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白免疫原性研究及其菌体抗原单克隆抗体...

作者：梁昊宇中国药品生物制品检定所

学位级别：硕士

近年来，我国南方一些地区以及东南亚某些国家均有甲型副伤寒沙门氏菌流行的报道。甲型副伤寒暴发流行，显示了伤寒流行菌型变迁的新特点，即由原来以伤寒沙门氏菌流行为主转为以甲型副伤寒沙门氏菌为主导菌，因此对甲型副伤寒沙门氏菌... 详细信息

近年来，我国南方一些地区以及东南亚某些国家均有甲型副伤寒沙门氏菌流行的报道。甲型副伤寒暴发流行，显示了伤寒流行菌型变迁的新特点，即由原来以伤寒沙门氏菌流行为主转为以甲型副伤寒沙门氏菌为主导菌，因此对甲型副伤寒沙门氏菌的研究非常有必要。本论文从两个方面对甲型副伤寒沙门氏菌进行了研究，即甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白免疫原性的研究和甲型副伤寒沙门氏菌菌体抗原单克隆抗体的制备。论文第一部分的主要研究目的在于：探索应用单一或混合的甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白作为保护性抗原，进而作为甲型副伤寒的候选疫苗的可能性。首先对本室保存的6株甲型副伤寒沙门氏菌株进行鉴定和筛选。6株菌均符合革兰氏阴性菌的形态特点，生化反应结果显示6株菌均为甲型副伤寒沙门氏菌，可信度为97％，并表现出不发酵木糖，也不产生HS的甲型副伤寒沙门氏菌主要生化特征。血清学检测显示6株菌与沙门氏菌诊断血清(02、012、Ha)发生了较强的凝集。建立小鼠攻毒模型对6株菌的毒力进行比较，选择出毒力较强的50973为后续实验用菌株。借助分子生物学技术对50973的16S rDNA进行了测序，结果与GeneBank中已知的甲型副伤寒沙门氏菌的16s rRNA基因序列进行比对，两者同源性达到99％;其后建立了体外杀菌抗体检测的实验方法，确定了最佳的菌液浓度为1000CFU／ml，反应时间为16—18h，乳兔的补体作为补体来源等，并进行了验证;最后建立了甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，在此基础上应用SDS—PAGE电泳来分离外膜蛋白的各个组分，并用电洗

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌 16S rRNA 外膜蛋白单克隆抗体

甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体LSPA1生物学特性及其与宿主相互作用的研究

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甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体LSPA1生物学特性及其与宿主相互作用的...

作者：毛普加昆明理工大学

学位级别：硕士

甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)是导致甲型副伤寒的致病菌,经粪口途径传播;噬菌体是一种细菌病毒,能够侵染并裂解宿主菌。噬菌体普遍存在于宿主菌中,所以在大多数环境下,噬菌体和宿主菌参与持续的联合进化,两者在自然界达... 详细信息

甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)是导致甲型副伤寒的致病菌,经粪口途径传播;噬菌体是一种细菌病毒,能够侵染并裂解宿主菌。噬菌体普遍存在于宿主菌中,所以在大多数环境下,噬菌体和宿主菌参与持续的联合进化,两者在自然界达到宿主一噬菌体动态平衡。目前对噬菌体与宿主之间相互作用机制尚不清晰,本文筛选了一株甲型副伤寒沙门氏菌烈性噬菌体(LSPA1)、对其生物学特性和基因组学进行分析并研究噬菌体与甲型副伤寒沙门氏菌相互作用,进而更深入认识噬菌体、深层次了解噬菌体与宿主之间的相互作用。目前对于治疗病原菌的感染主要是利用抗生素,然而抗生素的滥用以及生物膜的形成大大降低了抗生素治疗的效果,因此研究一种新型的治疗方法尤为重要。由于噬菌体的宿主特异性和强感染性,对宿主菌而言是个致命的威胁,因此科研工作者设想通过噬菌体治疗达到治愈病原菌感染的效果。为了获得一株新型的噬菌体并深入研究,作者将医院污水和甲型副伤寒沙门氏菌混合培养后,分离纯化甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体;并研究LAPS1部分生物学特性,包括最佳感染复数、pH和温度敏感性、结构蛋白以及初步受体分析。提取LSPA1基因组,用鸟枪法测全基因序列,分析其进化树、同源性和开放阅读框。在研究噬菌体与宿主相互作用中,先利用结合转座筛选抗噬菌体的甲型副伤寒沙门氏菌突变菌,鉴定插入基因,并通过同源重组定点突变和互补实验进一步证明,由于该种基因的突变引起甲型副伤寒沙门氏菌突变菌抗噬菌体的特性;另外发现σ-54依赖的翻译调节器基因与生物膜形成有关联。噬菌体筛选结果表明：1)将医院污水和甲型副伤寒沙门氏菌混合培养,取菌液离心,用上清做双层平板,有透明的噬斑出现,说明了在医院污水中成功筛选出甲型副伤寒沙门氏菌裂解性噬菌体,命名为LSPA1。2)将筛选的噬菌体LSPA1进行浓缩后,电镜观察,噬菌体LSPA1形态呈现64面体的头部,并属于长尾噬菌体。3)提取噬菌体基因组用限制性内切酶酶切,结果表明基因组能酶切,证明噬菌体LSPA1基因组属于双链DNA。噬菌体LSPA1生物特性分析：1)选择不同MOI接种噬菌体,结果表明在MOI为0.2时,能获得最高滴度的噬菌体,证明了0.2为噬菌体LSPA1最佳MOI。2)噬菌体LSPA1一步生长曲线中潜伏期为20 min,爆发期为50 mm,爆发量为129。3)将噬菌体LSPA1进行不同温度和pH处理后,再测量其滴度,噬菌体LSPA1在pH值3～10之间,具有较高的滴度,pH值在1～2和11～12之间,丧失活性;并且随温度上升滴度明显降低,在80℃几乎无活性副甲噬菌体存在。4)噬菌体LSPA 1进行SDS-PAGE分析,主要包含相对分子质量约67KD、60KD、55KD、40KD四种蛋白,其中55KD为衣壳蛋白。5)实验中初步分析噬菌体的受体为脂多糖和外膜蛋白。噬菌体LSPA1基因组学分析：1)噬菌体LSPA1基因组全长为41880bp,碱基组成：A=25.09%,T=24.43%,G=25.13%,C=25.35%,G+C=50.48%。2)噬菌体LSPA1全基因含有58个ORF,其中38个在正链上,20个在负链上。3)噬菌体LSPA1不仅仅和沙门氏菌噬菌体具有高度亲缘性,同样和大肠杆菌噬菌体也具有很高的亲缘性,其中与SETP3基因组具有高度相似性。4)将噬菌体LSPA1全基因序列提交GenBank,登录号为KM272358.噬菌体LSPA1感染宿主相关基因：1)筛选6株抗噬菌体突变菌,通过测序得知突变基因分别是溶菌酶、假设的蛋白质(可能甲基转移酶)、硫代硫酸盐还原酶电子前体、假定传感器激酶蛋白、乙酰乳酸合酶同工酶III大亚基、假定σ-54依赖的翻译调节器。2)研究发现假定a-54依赖的翻译调节器突变菌生物膜的形态明显发生改变以及成膜能力显著增强。3)通过定点突变和互补实验进一步证明假定a-54依赖的翻译调节器是抗噬菌体和生物膜相关基因,且a-54依赖的翻译调节器的缺失宿主表现出抗噬菌体、成膜能力显著增强的特性。本研究中,从医院的污水中筛选一株裂解性甲型副伤寒沙门氏菌噬菌体,并分析其生物学特性,证明了噬菌体LSPA1属于双链、长尾噬菌体;对噬菌体LSPA1基因基因组学和宿主甲型副伤寒沙门氏菌相互作用分析,证明了其中6种基因与噬菌体LSPA1侵染相关,并且σ-54依赖的翻译调节器的缺失会显著增强甲型副伤寒沙门氏菌的成膜能力。本实验为后续研究噬菌体侵染机制和利用噬菌体治疗病原菌感染奠定基础。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌筛选与分离基因组学

RpoE缺陷对甲型副伤寒沙门氏菌在肉制品加工中热失活特性的影响

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中国食品学报 2019年第3期19卷 148-152页

目的:RpoE作为由rpoE基因编码的σ因子,是普遍存在于革兰氏阴性细菌中的一类调节基因,对细菌响应各种环境胁迫起着重要的调节作用。为了解甲型副伤寒沙门氏菌rpoE基因在肉制品加工过程中的热应激响应特征。方法:本研究首先对缺陷株△rpo... 详细信息

目的:RpoE作为由rpoE基因编码的σ因子,是普遍存在于革兰氏阴性细菌中的一类调节基因,对细菌响应各种环境胁迫起着重要的调节作用。为了解甲型副伤寒沙门氏菌rpoE基因在肉制品加工过程中的热应激响应特征。方法:本研究首先对缺陷株△rpoE在最适温度的生长情况进行分析,然后以55,63,72℃对接种10~8CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野生株的介质进行热处理,测定处理后样品中甲型副伤寒沙门氏菌的残存数量,比较缺陷株和野生株在肉制品加工中的失活情况。结果:研究结果表明,在最适温度37℃条件下,缺陷株和野生株的生长能力没有显著性差异。野生株和缺陷株在55℃的D值分别为14.0980,10.8933 min,在63℃的D值分别为1.3078,0.3147 min,在72℃的D值分别为0.9885,0.9135 min,并且3个温度下甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株和野生株的D值之间有显著性差异(t甲型副伤寒沙门氏菌的耐热性起了重要作用,本文为进一步探讨甲型副伤寒沙门氏菌耐热机理及其控制提供了理论参考。

关键词：甲型副伤寒沙门氏菌 rpoE 热失活 D值肉制品