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植物乳杆菌环二腺苷酸合成酶的克隆表达与活性分析

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微生物学通报 2021年第4期48卷 1130-1139页

作者：杜斌刘喜朋韦曾传汪肖刘正红林栋贵阳学院食品与制药工程学院贵州贵阳550005 上海交通大学生命科学技术学院上海200240

【背景】环二腺苷酸(Cyclic Diadenosine Monophosphate,c-di-AMP)是一种主要存在于革兰氏阳性菌中的重要的第二信使分子,其参与细菌的生长、生存、抗逆性等多种生理活动,但目前关于乳酸菌中c-di-AMP的研究甚少。【目的】从植物乳杆菌(L... 详细信息

【背景】环二腺苷酸(Cyclic Diadenosine Monophosphate,c-di-AMP)是一种主要存在于革兰氏阳性菌中的重要的第二信使分子,其参与细菌的生长、生存、抗逆性等多种生理活动,但目前关于乳酸菌中c-di-AMP的研究甚少。【目的】从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到c-di-AMP合成酶基因,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外活性。【方法】使用高效液相色谱以及质谱分析对植物乳杆菌-YRA7细胞内容物中的c-di-AMP进行检测;以植物乳杆菌-YRA7基因组DNA为模板,克隆c-di-AMP合成酶基因(lpDacA),构建重组表达载体pET-28a-lpDacA并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行体外活性研究。【结果】在植物乳杆菌中检测到c-di-AMP分子;成功构建了c-di-AMP合成酶基因的重组表达质粒,该重组蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白可以催化ATP生成c-di-AMP,其活性依赖于二价阳离子的存在,在Mg2+存在以及碱性环境下活性较强;RHR是合成酶活性的关键基序,是环二腺苷酸合成酶与ATP的结合位点。【结论】植物乳杆菌c-di-AMP合成酶的克隆表达及活性分析为进一步研究c-di-AMP在植物乳杆菌中的作用奠定了基础。

关键词：环二腺苷酸植物乳杆菌原核表达

乳酸菌第二信使分子c-di-AMP研究进展

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工业微生物 2024年第2期54卷 79-84页

作者：范艺周李欢欢喻林兵曹佳尧艾连中熊智强上海理工大学健康科学与工程学院/上海食品微生物工程技术研究中心上海200093

微生物依赖信号识别和信号传递来感知并响应外界环境变化。c-di-AMP作为第二信使分子在信号传导过程中发挥着关键作用,其通过酶、转录调控因子和核糖开关等受体靶标来调控细胞生长、生物膜形成、K^(+)稳态、DNA完整性、细胞壁合成和脂... 详细信息

微生物依赖信号识别和信号传递来感知并响应外界环境变化。c-di-AMP作为第二信使分子在信号传导过程中发挥着关键作用,其通过酶、转录调控因子和核糖开关等受体靶标来调控细胞生长、生物膜形成、K^(+)稳态、DNA完整性、细胞壁合成和脂肪酸合成等与生理功能相关的基因和蛋白的表达。尽管对于c-di-AMP代谢调控在枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌等细菌中的研究较为深入,但对其在乳酸菌中的研究却相对较少。基于此,文章重点关注乳酸菌中cdi-AMP的代谢及其在K^(+)稳态和抑制甘氨酸甜菜碱转运中的信号传导作用;同时,通过总结现有研究中的乳酸菌c-di-AMP代谢调控,深化对乳酸菌第二信使分子信号调控的认知。

关键词：乳酸菌第二信使分子环二腺苷酸

卡介苗用于小鼠黑色素瘤模型免疫治疗的效应及其机制

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中国免疫学杂志 2024年

作者：徐铭泽宁唤唤路延之康健彭钰君张婧瑶胡家豪代婷董梦娟薛飒柏银兰空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室空军军医大学军事医学创新中心空军军医大学基础医学院学员队延安大学生命科学学院宁夏医科大学基础医学院生理学和神经生物学系

目的：探究卡介苗（BCG）和c-di-AMP为佐剂的重组卡介苗（rBCG）用于黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果与机制。方法：构建小鼠黑色素瘤细胞B16F10腹股沟皮下注射荷瘤模型，分别采用1×106CFU BCG和rBCG皮下瘤旁注射免疫治疗3次，观察小鼠生... 详细信息

目的：探究卡介苗（BCG）和c-di-AMP为佐剂的重组卡介苗（rBCG）用于黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果与机制。方法：构建小鼠黑色素瘤细胞B16F10腹股沟皮下注射荷瘤模型，分别采用1×106CFU BCG和rBCG皮下瘤旁注射免疫治疗3次，观察小鼠生存情况，肿瘤生长与转移情况；分离小鼠肿瘤组织制备细胞悬液，流式细胞术检测各免疫细胞比例；qRT-PCR检测肿瘤组织免疫相关基因转录水平。结果：BCG和rBCG免疫治疗均可显著抑制小鼠黑色素瘤的生长，延长小鼠生存时间，且rBCG免疫治疗抑制肿瘤转移的效果优于BCG。两菌株均可显著降低肿瘤生长和转移相关的M2型巨噬细胞和髓源性抑制细胞比例。两菌株均能促进肿瘤组织淋巴细胞浸润，rBCG显著促进肿瘤组织B细胞浸润增加。BCG免疫治疗上调肿瘤转移相关的细胞因子转录水平，而rBCG治疗并不影响上述基因转录。结论：BCG和rBCG免疫对小鼠黑色素瘤具有治疗作用，c-di-AMP为佐剂的rBCG抑制肿瘤转移的效果优于BCG，其作用机制与调节肿瘤组织内免疫应答水平有关。

关键词：卡介苗重组卡介苗黑色素瘤环二腺苷酸免疫治疗

牙龈卟啉单胞菌合成环二腺苷酸的高效液相色谱-串联质谱法定性分析

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华西口腔医学杂志 2016年第3期34卷 307-311页

作者：谭咏梅杨小军杜娟赵望泓陈晓丹侯晋南方医科大学南方医院口腔科南方医科大学公共卫生与热带医学学院卫生监测中心广州510515 汕头大学医学院第二附属医院口腔科汕头515041

目的定性检测牙龈卟啉单胞菌(***)是否能产生细菌信号分子环二腺苷酸(c-di-AMP),为探索其在***生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。方法以***标准菌株ATCC33277为实验菌株,抽提细菌内核酸物质作为样品,配置c-di-AMP标准品,通过高... 详细信息

目的定性检测牙龈卟啉单胞菌(***)是否能产生细菌信号分子环二腺苷酸(c-di-AMP),为探索其在***生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。方法以***标准菌株ATCC33277为实验菌株,抽提细菌内核酸物质作为样品,配置c-di-AMP标准品,通过高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)和高效液相色谱法(HPLC)对样品进行验证。结果 HPLC-MS/MS检出限按照信噪比(S/N)3∶1计算,c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49 min,***提取物样品在保留时间为8.82 min时有目标峰出现(大于3 S/N)。HPLC检测结果表明,***核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7 min处出现目标峰,且二者的紫外吸收光谱相同。结论牙龈卟啉单胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP,牙龈卟啉单胞菌可以合成产生c-di-AMP。

关键词：环二腺苷酸牙龈卟啉单胞菌高效液相色谱-串联质谱法

结核分枝杆菌EsxV脂质体纳米颗粒亚单位疫苗的制备及免疫学特性

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生物工程学报 2023年第10期39卷 4085-4097页

作者：白鹭路延之宁唤唤康亚莉谢燕玲康健李雪崔若囡韦垠刘月芹柏银兰空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032 延安大学生命科学学院陕西延安716000 西北大学生命科学学院陕西西安710069 宁夏医科大学基础医学院生理学和神经生物学系宁夏银川750001

本研究旨在制备脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)为载体的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原EsxV亚单位疫苗,明确该疫苗经黏膜免疫诱导的免疫应答水平。采用薄膜分散法制备包裹蛋白EsxV和c-di-AMP的LNP(EsxV:C:... 详细信息

本研究旨在制备脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)为载体的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原EsxV亚单位疫苗,明确该疫苗经黏膜免疫诱导的免疫应答水平。采用薄膜分散法制备包裹蛋白EsxV和c-di-AMP的LNP(EsxV:C:L),并对其包封率、LNP形态、粒径、表位电荷及多相分散指数进行了检测。EsxV:C:L滴鼻免疫BALB/c小鼠,检测免疫后血清和黏膜抗体、肺或脾细胞因子转录及分泌水平、肺T细胞亚群细胞比例。结果成功获得大小均一、呈球状、带负电的EsxV:C:L LNP亚单位疫苗。与EsxV:C相比,EsxV:C:L鼻黏膜接种可诱导小鼠呼吸道黏膜sIgA水平增加,脾细胞因子IL-2分泌水平升高,提高中央记忆T细和组织驻留T细胞的比例。综上,EsxV:C:L经黏膜免疫,可诱导更强的黏膜免疫和记忆性T细胞免疫应答,可能提供更好的抗Mtb感染的保护作用。

关键词：结核分枝杆菌 EsxV 环二腺苷酸脂质体纳米颗粒亚单位疫苗

结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答

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中国人兽共患病学报 2022年第5期38卷 379-386页

作者：白鹭宁唤唤康健梁璇谢燕玲彭钰君张婧瑶路延之柏银兰延安大学生命科学学院延安716000 空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室西安710032 西北大学生命科学学院西安710069

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组***诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以E... 详细信息

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组***诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。

关键词：结核分枝杆菌 6kDa早期分泌靶抗原分泌系统蛋白V(EsxV) 亚单位疫苗黏膜免疫环二腺苷酸

基于c-di-AMP信号通路探讨补气阴方抗MRSA感染的机制研究

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基于c-di-AMP信号通路探讨补气阴方抗MRSA感染的机制研究

作者：温博中国中医科学院

学位级别：硕士

研究背景:多重耐药菌感染是当今人类生命健康的重大威胁。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种重要的致病菌,可引起全身多系统感染。MRSA的高致病性、高复发率和高致死率与其对临床多种... 详细信息

研究背景:多重耐药菌感染是当今人类生命健康的重大威胁。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种重要的致病菌,可引起全身多系统感染。MRSA的高致病性、高复发率和高致死率与其对临床多种抗生素的高耐药性密切相关。生物膜(Biofilm,BF)的生成是其产生耐药性的重要原因。贞芪颗粒(ZQ)在临床具有抗菌和提高免疫力的疗效,可用于对抗MRSA感染。研究目的:明确ZQ联合万古霉素(Van)对浮游态MRSA及有BF的MRSA(MRSA-BF)的药效,并初步揭示其协同抑菌机制。明确ZQ对感染MRSA的BEAS-2B肺上皮细胞的保护作用。研究方法:采用微量稀释法和平板划线法测定Van、ZQ对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);棋盘法测定两药联用对MRSA的分数抑制浓度指数,确定最小抑菌浓度比。Van、ZQ单用及联用干预MRSA-BF,采用微孔板法测定MRSA-BF内活菌量的变化,采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察MRSA-BF内活死菌数量的变化,采用扫描电镜(SEM)观察Van、ZQ各自单用及联用对MRSA-BF形态的影响。通过RT-PCR检测Van、ZQ各自单用及联用对MRSA-BF相关基因 purF、lytS、IrgB、tarH、dltA、fmtA、krtA 表达的影响。通过 ELISA 检测Van、ZQ各自单用及联用对c-di-AMP信号分子表达的影响。通过CCK8测定ZQ干预BEAS-2B细胞的最佳浓度;通过MRSA与BEAS-2B细胞共培养及黏附实验观测ZQ对MRSA黏附能力的影响。研究结果:Van对MRSA的MIC为2 μg/mL;未检测到ZQ对MRSA的MBC,故以ZQ的最大溶解度800mg/mL作为实验浓度。最小抑菌浓度比实验未检测到两药的FICI值。200mg/mLZQ对MRSA-BF膜内活菌有显著抑制作用。形态学观察发现,1μg/mL Van组与Control组的活、死菌荧光信号强度无差异;200 mg/mL ZQ组的活菌荧光信号范围小于1μg/mL Van组和Control组;1 μg/mL Van+200 mg/mLZQ组活、死菌荧光强度均低于Control组和两药各自单用组。1 μg/mL Van对MRSA-BF菌体形态的影响与Control组无差异;200 mg/mL ZQ组MRSA无膜结构包被,仅有微菌落散在分布,菌体间排列松散;1 μg/mL Van+200 mg/mL ZQ组MRSA无膜结构包被,菌体间排列松散,大小不一。与Control组相比,两药联用组的7个与MRSA-BF生成相关的基因purF、lytS、IrgB、tarH、dltA、fmtA、krtA的表达受到抑制,通路信号分子c-di-AMP蛋白表达也受到抑制。ZQ干预BEAS-2B细胞的最佳浓度为12.5mg/mL,当感染比(MOI)为1:1时,10 mg/mL和12.5 mg/mL ZQ能够显著抑制MRSA对BEAS-2B细胞的黏附。研究结论:***对MRSA-BF具有抑制作用,能够协助Van接触到BF内的细菌,促进Van对MRSA的清除。***联合ZQ抑制MRSA-BF的机制是通过抑制fmtA、dltA等基因的表达,破坏细胞壁结构,并干扰了细菌自溶过程以减少胞外DNA的释放,从而抑制BF生成。***对MRSA的黏附能力具有抑制作用,能够抑制MRSA对BEAS-2B细胞的黏附,进而减少MRSA在细胞表面的定植,保护BEAS-2B细胞。4.本研究为临床上ZQ联合Van治疗MRSA提供理论依据,也为开辟中药联合抗生素治疗难治性耐药菌感染奠定基础。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜贞芪颗粒万古霉素环二腺苷酸

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c-di-AMP在细菌感染与免疫中的作用

微生物学通报 2019年第9期46卷 2362-2369页

作者：宁唤唤徐志凯柏银兰空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032 西北大学生命科学学院陕西西安710069

环二腺苷酸(Cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是细菌中广泛存在的第二信号分子。c-di-AMP在细菌中的代谢受二腺苷酸环化酶(Diadenylatecyclase, DAC)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)的精密调控。c-di-AMP不仅调节细菌生长、细胞壁稳态、离子转运等多种生理过程,而且能够被真核宿主胞内多种感应子/受体蛋白识别,从而调控抗感染免疫。细菌c-di-AMP参与调控宿主I型干扰素应答、NF-κB信号通路活性、自噬以及炎症小体应答等固有免疫应答。此外,c-di-AMP作为黏膜佐剂可诱导宿主适应性免疫。c-di-AMP被认为是一种新发现的病原体相关的分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),已成为细菌疫苗和药物研究中的新靶点。

关键词：环二腺苷酸细菌感染免疫固有免疫

苏云金芽胞杆菌BMB171中c-di-AMP假定受体蛋白TerD的功能研究

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苏云金芽胞杆菌BMB171中c-di-AMP假定受体蛋白TerD的功能研究

作者：邓淋华中农业大学

学位级别：硕士

环二腺苷酸（c-di-AMP）是2008年新发现的细菌核酸类第二信使分子。在上游信号分子的刺激下,c-di-AMP在细胞内的浓度分别通过具有DisA＿N结构域的二腺苷酸环化酶的正调节和具有DHH-DHHA1或HD结构域的特异性降解酶来负调节。作为第二信... 详细信息

环二腺苷酸（c-di-AMP）是2008年新发现的细菌核酸类第二信使分子。在上游信号分子的刺激下,c-di-AMP在细胞内的浓度分别通过具有DisA＿N结构域的二腺苷酸环化酶的正调节和具有DHH-DHHA1或HD结构域的特异性降解酶来负调节。作为第二信使分子,c-di-AMP通常通过与特定的受体或效应物结合,从而来调节相关下游靶基因的表达。到目前为止,相关文献只报道了c-di-AMP能够感应DNA的完整性,参与DNA的损伤修复,从而调控细菌芽胞的形成,调控肽聚糖的合成和钾离子转运以及脂肪酸代谢等生理功能。然而,我们对其信号调节途径相关受体与靶标却知之甚少。我们将与生物素共价结合的c-di-AMP直接结合到链亲和素琼脂糖树脂上,从而建立以c-di-AMP为配基的亲和色谱垂钓体系。利用此以c-di-AMP为配基的亲和色谱柱,我们在苏云金芽胞杆菌BMB171中捕获并鉴定了一些c-di-AMP特异结合的受体蛋白TerD和TerD。TerD是一种压力响应调节蛋白,其结构中还存在cAMP的结合结构域（也可能是c-di-AMP的结合位点）。在BMB171中,由于TerD、TerD和TerD三者之间氨基酸序列具有很高的相似性,而且又位于同一操纵子内,所以我们推测TerD、TerD和TerD都有可能是c-di-AMP的受体。于是我们用P标记的同位素实验和LC-TOF/MS质谱结合以及ITC实验,在体外验证了TerD与c-di-AMP或cAMP的相互作用,同位素实验结果表明,TerD、TerD和TerD不仅能和cAMP结合,还能与c-di-AMP结合,只是与c-di-AMP结合需要金属离子Ca的参与,说明TerD与cAMP的结合能力明显强于与c-di-AMP的,LC-TOF/MS质谱结合结果表明,TerD能和cAMP结合,却不能与c-di-AMP结合,而ITC实验结果表明,TerD能和c-di-AMP结合,却不能与cAMP结合。同时,我们通过归巢内切酶I-Sce I介导的同源重组基因无痕敲除方法,成功构建了以下terD相关BMB171缺失菌株:ΔterD、ΔterD、ΔterD、ΔterC、ΔterDΔterC、ΔyceG、ΔtelA、ΔyceGΔtelA和Δfl。为了探索terD相关基因在BMB171中参与的生理功能,我们对terD相关缺失菌株进行了以下表型实验,包括运动性、生物膜的形成、高钠、高钾、温度、紫外敏感性和对芽胞和伴胞晶体形成的影响以及对亚碲酸盐（KTeO）的抗性等。实验结果表明,各菌株除了KTeO抗性和温度敏感性外,运动性和生物膜的形成等其他表型均无明显变化。在对KTeO抗性实验中,最小抑制浓度、抑菌圈和生长抑制实验结果都表明,terD相关基因的缺失会增强菌株对KTeO的敏感性,这与其他文献报导的结果一致;同时,terD相关基因的缺失也会增强菌株对低温的敏感性和对高温的耐受能力。我们研究结果表明,TerD是cAMP或c-di-AMP的受体,一方面丰富了cAMP和c-di-AMP的代谢调控网络,另一方面为细菌碲抗性机制相关研究提供新的思路。

关键词：苏云金芽胞杆菌环二腺苷酸压力响应蛋白TerD 受体蛋白温度敏感性