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猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶介导细菌应激与致病作用

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微生物学通报 2024年第1期51卷 241-249页

作者：占冬波刘海发龙如意王占丰朱乐欣廖兵荣蒋小武宜春学院医学院江西宜春336000

【背景】硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRR)是硫氧还蛋白系统关键组成部分,对病原菌应对体内外氧化应激、调节细菌稳态和介导致病过程具有重要作用。【目的】探究硫氧还蛋白还原酶TRR在人畜共患猪链球菌2型感染过程中参与的... 详细信息

【背景】硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRR)是硫氧还蛋白系统关键组成部分,对病原菌应对体内外氧化应激、调节细菌稳态和介导致病过程具有重要作用。【目的】探究硫氧还蛋白还原酶TRR在人畜共患猪链球菌2型感染过程中参与的生物学效应。【方法】同源重组法构建猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶trr基因缺失株(Δtrr)及回补株(cΔtrr),通过细菌染色、点板计数、体外细胞和动物感染模型等试验比较分析trr基因对细菌形态、抗应激反应及致病过程的影响。【结果】缺失trr对猪链球菌2型形态与生长特性的影响不大,但可增强细菌抗热应激、氧化应激和酸应激能力,缺失株对上皮细胞黏附力下降,侵袭进入脑血管内皮细胞作用显著降低,易于被吞噬细胞吞噬清除,对小鼠模型致病效应显著减弱。【结论】猪链球菌2型TRR因子参与细菌应激反应,介导细菌黏附、侵袭等致病过程,是猪链球菌2型新的潜在毒力因子。

关键词：猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶应激反应致病作用

猪链球菌2型通过诱导人脑微血管内皮细胞RPSA蛋白发生相分离促进菌体对细胞的黏附

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中国兽医学报 2024年第5期44卷 966-973页

作者：孙毅刘嘉楠姜合祥李扬李娜李丰阳雷连成吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062 吉林大学护理学院吉林长春130021

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是诱发细菌性脑膜炎的一种人畜共患病原菌,宿主脑微血管内皮细胞(BMEC)是构成血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的主要细胞,也是病原攻击的重要靶细胞。近年发现宿主细胞核糖体蛋白SA(... 详细信息

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是诱发细菌性脑膜炎的一种人畜共患病原菌,宿主脑微血管内皮细胞(BMEC)是构成血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的主要细胞,也是病原攻击的重要靶细胞。近年发现宿主细胞核糖体蛋白SA(ribosomal protein SA,RPSA)参与SS2诱发的脑膜炎发病过程,但相关机制仍知之甚少。本研究通过对人脑微血管内皮细胞(human cortical microvessels endothelial cells/D3,HCMEC/D3)RPSA蛋白进行序列分析、相分离能力测定,初步研究了RPSA在SS2感染过程中的作用和机制。结果显示,HCMEC/D3 RPSA具有典型的内部无序区(IDRs)结构域;SS2感染能够诱导RPSA发生相分离,相分离显著增强了细菌对细胞的黏附能力;SS2毒力因子ENO既能够促进RPSA发生相分离,也介导了细菌与细胞的黏附。另外,SS2感染后胞内Ca^(2+)水平升高是促进相分离的关键因素。综上,本研究证实SS2通过提升胞内Ca^(2+)水平,促进RPSA发生相分离,从而增强SS2(ENO)与RPSA的相互作用,导致黏附并进一步引起细胞损伤造成宿主感染。本研究为SS2诱发脑膜炎的认知提供了新思路。

关键词：猪链球菌2型核糖体蛋白SA 相分离烯醇化酶 Ca2+

猪链球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表达及催化特性分析

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畜牧与兽医 2024年第1期56卷 46-55页

作者：孙文张永毅陆畅朱德文尹媛媛徐泉明陈叶福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 闽台动物病原生物学福建省高校重点实验室福建福州350002 福建警察学院福建福州350007

为了研究猪链球菌2型(SS2)核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的催化特性,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达猪链球菌2型RNaseⅢ(SS-RNaseⅢ)并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化。异源表达研究显示,重组蛋白RNaseⅢ大部分为可溶性表达;催化特性研究显示,... 详细信息

为了研究猪链球菌2型(SS2)核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的催化特性,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达猪链球菌2型RNaseⅢ(SS-RNaseⅢ)并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化。异源表达研究显示,重组蛋白RNaseⅢ大部分为可溶性表达;催化特性研究显示,RNaseⅢ主要依赖Mg^(2+)或Mn^(2+)发挥催化功能,并在不同离子浓度和pH值环境下具有不同的催化活性;底物特异性研究显示,RNaseⅢ特异性切割长度为30 bp的双链RNA,同时对内源性的rnc mRNA和5S rRNA具有良好的特异性。上述结果表明,相较于其他细菌RNaseⅢ,SS-RNaseⅢ具有独特的催化特性,为深入理解RNaseⅢ如何介导SS2致病机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型核糖核酸酶Ⅲ 原核表达催化特性

猪链球菌2型毒力因子烯醇化酶干扰脑微血管内皮细胞RPSA在脂筏的定位并诱导细胞凋亡的机制研究

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猪链球菌2型毒力因子烯醇化酶干扰脑微血管内皮细胞RPSA在脂筏的...

作者：孙毅吉林大学

学位级别：硕士

猪链球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2,SS2)是一种人畜共患病原菌,可诱发细菌性脑膜炎,严重威胁公共卫生安全。烯醇化酶(Enolase,ENO)是SS2的关键毒力因子,可诱导脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial cells,BMEC中核糖体蛋白SA((Ribosomal Protein SA,RPSA)高表达,并与之结合,最终导致细胞凋亡并破坏血脑屏障。本课题组前期研究表明,脂筏参与了RPSA在SS2感染中的作用,但其机制尚不清楚。因此本研究拟从ENO对脂筏作用入手,揭示SS2感染过程中RPSA在脂筏中的定位与诱导细胞凋亡之间的分子机制。首先,实验发现ENO诱导凋亡具有时间依赖性,随后发现环糊精破坏脂筏有助于促进ENO诱导凋亡,而回补胆固醇则抑制凋亡。进一步研究表明,环糊精通过消耗脂筏内胆固醇破坏脂筏,表明ENO破坏脂筏完整性是导致细胞凋亡的原因之一。免疫荧光观察结果显示,ENO刺激导致脂筏形态的改变和损伤,进一步支持了ENO破坏脂筏完整性促使细胞凋亡的结论。接着,使用脂筏提取试剂盒和免疫印迹技术确定了ENO感染后RPSA在脂筏内的表达情况,结果显示ENO刺激后脂筏内RPSA含量显著减少。通过免疫荧光和免疫印迹双向测定RPSA在ENO刺激后的迁移过程,发现ENO作用后,RPSA在细胞内发生动态迁移,从胞浆转运到胞膜,最终排出胞外,完成了由胞内向胞外的运输过程。抑制RPSA向膜上转运会导致凋亡现象减弱,这些结果表明,ENO与脂筏中的RPSA相互作用,诱导细胞凋亡。最后,探究了ENO干扰RPSA在细胞膜脂筏中定位的机制。实验证明,在ENO的刺激下,RPSA与脂筏标志物CAV 1共定位。通过基因干扰和过表达的方法证实了CAV 1对ENO抑制RPSA在脂筏中定位的作用。结果显示,过表达CAV 1在ENO刺激下显著降低了RPSA在脂筏中的定位,促进细胞凋亡;而抑制CAV 1则导致RPSA在脂筏中的蛋白水平显著升高,减少细胞凋亡水平。进一步的研究证实,脂筏中的CAV1减少,ENO、RPSA、CAV 1三者相互作用并且共定位,这些结果表明可能ENO-CAV 1-RPSA三者形成复合物,使得CAV 1偏离脂筏,破坏脂筏造成凋亡。此外,研究还发现,ENO对脂筏造成损伤诱导细胞凋亡不依赖其酶活性,是通过蛋白结构发挥作用。综上所述,本研究首次阐明ENO通过诱导RPSA异位于细胞膜并与CAV 1结合破坏脂筏导致细胞凋亡的分子机制。为SS2破坏血脑屏障诱发脑膜炎的认知提供了新思路,丰富了人们对脂筏在细菌感染中的认知,为探究SS2破坏血脑屏障诱发脑膜炎的致病机制提供了新的思路。

关键词：猪链球菌2型烯醇化酶核糖体蛋白SA 脂筏凋亡

致脑膜炎猪链球菌2型的分子分型鉴定及其生物学特性

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1192-1207页

作者：李芃绪李世景孙骏项维赵苗苗侯天牧李华明广敏陈瑞格徐梦然吴晓敏姜合祥雷连成张付贤长江大学动物科学技术学院荆州434023 吉林大学动物医学学院长春130062

旨在了解猪源致脑膜炎猪链球菌2型的分子分型和致病性及其生物学特性。本研究从患病猪的脑组织中分离到1株猪链球菌PX0923,通过电镜观察、16S rRNA基因测序、多重PCR、PCR-RFLP和多位点序列分析(MLST)等方法对其进行血清型和分子分型鉴... 详细信息

旨在了解猪源致脑膜炎猪链球菌2型的分子分型和致病性及其生物学特性。本研究从患病猪的脑组织中分离到1株猪链球菌PX0923,通过电镜观察、16S rRNA基因测序、多重PCR、PCR-RFLP和多位点序列分析(MLST)等方法对其进行血清型和分子分型鉴定,毒力基因、生物被膜形成能力、耐药基因检测、小鼠感染试验、抗生素和中药药敏试验分析分离株PX0923的致病性和药物敏感性。结果表明,分离菌株PX0923为革兰阳性菌,电镜下可见连续排列成链状的卵圆形菌体;PCR和16S rRNA基因系统发育树分析确定其属于猪链球菌2型;序列分型为ST7,与ST1型猪链球菌聚为一支;携带epf+/mrp+/sly+/gapdh+/fbps+/orf2+/sao+7种毒力基因,呈现α型溶血活性;感染小鼠可导致小鼠肺、脾和肝等多个器官不同程度的病变,出现了小鼠脑膜炎等与病猪类似的临床症状;半数致死量(LD50)为1.08×10^(9)CFU/小鼠,提示PX0923可引起小鼠脑膜炎。分离菌株对庆大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星等12种药物耐药,携带耐药基因:aadA1和bla-TEM,对中药全蝎和三七敏感。本研究分离到猪源猪链球菌PX0923为血清2型,MLST分型为ST7,其携带多种毒力基因和耐药基因,感染小鼠可引起脑膜炎等多组织损伤;对多种抗生素和中药全蝎、三七敏感。研究结果为猪链球菌的流行和溯源分析提供了分子生物学基础,对致脑膜炎猪链球菌感染的防控提供参考依据。

关键词：猪链球菌2型分子分型 ST7型生物学特性耐药性中药

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优化培养基组分提高猪链球菌2型NT15B菌株活菌数的研究

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中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 2776-2786页

作者：马林丽徐国强张秋萍车巧林史劲松许正宏江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院无锡214122 江南大学江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心无锡214122 江苏南农高科技股份有限公司无锡214405

【目的】以猪链球菌2型NT15B菌株为研究对象,通过优化发酵培养基组分提高菌株活菌数,降低生产成本,为猪链球菌2型NT15B菌株的高密度培养及猪链球菌病疫苗的大规模生产和推广提供参考。【方法】试验以培养的猪链球菌2型NT15B菌株最高活... 详细信息

【目的】以猪链球菌2型NT15B菌株为研究对象,通过优化发酵培养基组分提高菌株活菌数,降低生产成本,为猪链球菌2型NT15B菌株的高密度培养及猪链球菌病疫苗的大规模生产和推广提供参考。【方法】试验以培养的猪链球菌2型NT15B菌株最高活菌数为筛选指标,通过单因素试验筛选菌株发酵培养基中碳源、氮源(有机氮源和无机氮源)、无机盐金属离子、磷酸缓冲液的最佳组分及浓度,并根据单因素筛选结果选择碳源浓度、有机氮源总浓度、有机氮源比例、磷酸盐缓冲液浓度4个因素各3个水平设计正交试验,并进一步进行多因素的筛选与验证。【结果】猪链球菌2型NT15B菌株发酵培养基最优条件为6.0 g/L蔗糖、1.0 g/L尿素、10 g/L酵母提取物YE7与20 g/L酵母蛋白胨Nucel 887混合氮源,1.0 g/L NaCl、9.58 g/L K_(2)HPO_(4)·3H_(2)O、1.09 g/L KH_(2)PO_(4)、1 mmol/L MgSO_(4)·7H_(2)O、0.3 g/L L-抗坏血酸。采用此最优组合,摇瓶培养猪链球菌2型NT15B活菌数最高达80.83×10^(8)CFU/mL,较优化前提高256.08%。【结论】优化后的培养基能有效提高猪链球菌2型NT15B菌株活菌数,降低了生产成本,为发酵罐水平的优化提供参考。

关键词：猪链球菌2型活菌数培养基组分优化

基于响应面分析的高抗原活性猪链球菌2型疫苗培养基的研制与效果评价研究

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饲料研究 2024年第1期47卷 86-92页

作者：苗森牛得权张阳阳刘翔蒋富凤张菊梅万强吴清平合肥工业大学食品与生物工程学院安徽合肥230601 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室广东广州510070 广东环凯生物科技有限公司广东肇庆526238

试验旨在研制具有高抗原活性的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)疫苗培养基。研究以SS2 CVCC60615株为试验对象,通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面分析得到SS2疫苗培养基。培养基发酵验证结果显示,... 详细信息

试验旨在研制具有高抗原活性的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)疫苗培养基。研究以SS2 CVCC60615株为试验对象,通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面分析得到SS2疫苗培养基。培养基发酵验证结果显示,SS2疫苗培养基菌液最大活菌数为1.09×10^(9) CFU/mL,是TSB培养基最大活菌数的2.41倍。测定SS2不同时间点的抗原活性发现,在SS2发酵培养过程中当活菌数达到最大值后的1~3 h内细菌的抗原活性最高。小鼠感染试验表明,SS2抗原活性最高时制备的灭活疫苗与商品化灭活疫苗相比具有更高的免疫球蛋白G(IgG)抗体效价和疫苗保护率。研究表明,采用研制得到的高抗原活性SS2疫苗培养基制备的灭活疫苗具有IgG抗体效价高、免疫保护力强的优点。

关键词：猪链球菌2型响应面分析高抗原活性疫苗培养基

猪链球菌2型Orf207基因缺失菌株的构建及其生物学特性检测

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微生物学通报 2023年第7期50卷 3009-3019页

作者：梅纪坤姜轩吴桐姜合祥朱俊辉武增帅李丰阳李娜雷连成吉林大学动物医学学院吉林长春130062

【背景】猪链球菌2型(streptococcus suis type 2, SS2)可引起人、猪的脑膜炎、关节炎及败血症等,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。本团队前期通过噬菌体展示文库技术发现Orf207编码蛋白可能参与SS2诱导的脑... 详细信息

【背景】猪链球菌2型(streptococcus suis type 2, SS2)可引起人、猪的脑膜炎、关节炎及败血症等,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。本团队前期通过噬菌体展示文库技术发现Orf207编码蛋白可能参与SS2诱导的脑膜炎发生,然而其在SS2致病过程中的具体作用尚不清楚。【目的】探究Orf207基因对SS2致病性的影响。【方法】采用温敏性自杀质粒介导的同源重组系统,构建SC19 Orf207基因缺失菌株ΔOrf207及其回补菌株CΔOrf207,系统比较缺失菌株与野生株间在生长特性、形态、组织定殖能力、毒力情况、细胞黏附与侵袭及抗巨噬细胞吞噬能力等生物学特性方面的差异。【结果】与野生株相比,缺失菌株链长变短,生长速度略慢;而且Orf207缺失显著增加了小鼠的存活率,降低了细菌在血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织的定殖能力和对肺组织的病理损伤并显著减弱SS2对HeLa细胞的黏附与侵袭能力及抗巨噬细胞吞噬能力。【结论】Orf207基因可以显著降低SS2对宿主的致病能力,本研究结果不仅丰富了SS2的致病机制,也为SS2疫苗等研发提供了新靶点。

关键词：猪链球菌2型 Orf207基因缺失株黏附侵袭

猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶多克隆抗体制备与亚细胞定位分析

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中国病原生物学杂志 2022年第4期17卷 410-414页

作者：赖芸占冬波蒋小武宜春学院医学院江西宜春336000

目的制备猪链球菌2型(Streptococcus suis,SS2)硫氧还蛋白还原酶(SsTrxR)抗体,分析其在SS2中的定位。方法对猪链球菌2型trxR基因进行生物信息学分析,PCR扩增TrxR基因,酶切、连接,构建重组表达载体pET30a-trxR。IPTG低温诱导表达SsTrxR... 详细信息

目的制备猪链球菌2型(Streptococcus suis,SS2)硫氧还蛋白还原酶(SsTrxR)抗体,分析其在SS2中的定位。方法对猪链球菌2型trxR基因进行生物信息学分析,PCR扩增TrxR基因,酶切、连接,构建重组表达载体pET30a-trxR。IPTG低温诱导表达SsTrxR重组蛋白,镍柱亲和纯化目的蛋白。皮下接种SsTrxR至日本大耳白兔,获取多克隆抗血清。Western blot分析SsTrxR抗血清特异性与在SS2中的定位。结果SsTrxR因子与细菌硫氧还蛋白还原酶的氨基酸序列存在多个保守区域与位点,同属内其它代表性链球菌硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列同源性在68.5%以上,拥有Cys-Xaa-Xaa-Cys基序。成功构建pET30a-trxR表达质粒,SsTrxR原核蛋白呈可溶性表达,过镍柱纯化,获得目的蛋白。Western blot检测结果显示SsTrxR与抗血清反应性好,SsTrxR因子分布于细菌胞浆内。结论猪链球菌2型存在硫氧还蛋白还原酶SsTrxR,制备的兔源SsTrxR多克隆抗体特异性好,且该因子为胞内蛋白,为开展TrxR因子在SS2感染与免疫过程中发挥的功能研究奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶多克隆抗体定位分析