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猪带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶的原核表达及其生物学特性分析

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畜牧兽医学报 2014年第9期45卷 1512-1517页

作者：尹才骆学农王帅陈光丽曾巧英才学鹏甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州730070 兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

猪带绦虫(Ts)是一种重要的人畜共患寄生虫,硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)是猪带绦虫及其幼虫重要的功能蛋白。为研究TsTPx蛋白的功能和筛选猪囊虫高效免疫靶标,提取猪带绦虫成虫总RNA,经RT-PCR扩增tstpx基因,测序分析后构建原核表达载体pET... 详细信息

猪带绦虫(Ts)是一种重要的人畜共患寄生虫,硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)是猪带绦虫及其幼虫重要的功能蛋白。为研究TsTPx蛋白的功能和筛选猪囊虫高效免疫靶标,提取猪带绦虫成虫总RNA,经RT-PCR扩增tstpx基因,测序分析后构建原核表达载体pET-30a(+)-tstpx,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,用镍离子亲和层析纯化TsTPx蛋白并进行生物学特性分析,包括抗氧化功能和抗原性。结果如下:SDS-PAGE分析表明,表达的TsTPx蛋白约25ku,主要以可溶性形式存在于菌体裂解上清中。抗氧化功能分析表明,在金属催化氧化(MCO)体系中,TsTPx蛋白对质粒DNA超螺旋结构的保护率与质量浓度呈正相关,20μg·mL-1时可100%保护,电泳图谱中被氧化的开环慢迁移带完全消失;H2O2还原体系中,TsTPx蛋白对H2O2的还原率与质量浓度呈正相关,100μg·mL-1时,在含二硫苏糖醇(DTT)体系中,还原率达69.9%,在不含DTT体系中为54.5%。抗原性分析:Western blotting显示TsTPx蛋白可被猪带绦虫囊尾蚴阶段阳性血清识别,具有良好的反应原性;用TsTPx蛋白免疫家兔,间接ELISA检测的抗体效价高达1∶320 000,具有良好的免疫原性。本研究表达的TsTPx蛋白具有生物学活性和良好的抗原性,为进一步阐明其生物学功能和研制猪囊虫病疫苗奠定了基础。

关键词：猪带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶原核表达生物学特性分析

猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析

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中国人兽共患病学报 2011年第5期27卷 423-426页

作者：江楠席晓兰王杰戴佳琳廖兴江黄江贵阳医学院寄生虫学教研室贵阳550004 贵阳医学院化学教研室贵阳550004 贵阳医学院法医学教研室贵阳550004

目的对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究。方法将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过... 详细信息

目的对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究。方法将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blot)进行免疫学分析。结果成功构建pET-28a(+)-MDH重组质粒,并获得高纯度蛋白,该重组蛋白可被其免疫SD大鼠血清识别,同时也能被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

关键词：猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因基因克隆原核表达

猪带绦虫六钩蚴和未成熟期囊尾蚴生化指标的变化

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中国兽医科技 2001年第7期31卷 22-23页

作者：高文学郝艳红李庆章东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

本试验检测了六钩蚴和猪体内发育至 30日的囊尾蚴的 18项生化指标。结果显示 ,在六钩蚴阶段有部分生化指标未能检测到 ,而在猪体内发育 30日的囊尾蚴则全部检测到 ,提示在六钩蚴阶段虫体处于休眠状态 ,由六钩蚴到未成熟期囊尾蚴是各个... 详细信息

本试验检测了六钩蚴和猪体内发育至 30日的囊尾蚴的 18项生化指标。结果显示 ,在六钩蚴阶段有部分生化指标未能检测到 ,而在猪体内发育 30日的囊尾蚴则全部检测到 ,提示在六钩蚴阶段虫体处于休眠状态 ,由六钩蚴到未成熟期囊尾蚴是各个生化代谢通路的激活过程。

关键词：猪带绦虫六钩蚴猪囊尾蚴生化指标未成熟期

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猪带绦虫实验动物模型的建立

中国预防兽医学报 2013年第6期35卷 510-512页

作者：陈贝妮王丹王哲赵权吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为建立猪带绦虫实验动物模型,本实验通过口服激活、未激活囊尾蚴和尾静脉注射激活的囊尾蚴感染昆明小鼠、BA LB/c小鼠、SD大鼠、豚鼠、金黄地鼠、沙鼠,对各种鼠体内的绦虫的感染、生长发育及寄生部位等生物学特性进行研究。在感染45 d... 详细信息

为建立猪带绦虫实验动物模型,本实验通过口服激活、未激活囊尾蚴和尾静脉注射激活的囊尾蚴感染昆明小鼠、BA LB/c小鼠、SD大鼠、豚鼠、金黄地鼠、沙鼠,对各种鼠体内的绦虫的感染、生长发育及寄生部位等生物学特性进行研究。在感染45 d的金黄地鼠体内检出可见虫体,检出的虫体多数吸附在小肠。本实验建立了猪带绦虫的实验动物模型,使得解决猪带绦虫实验材料的来源问题成为可能,也为猪带绦虫的深入研究奠定了基础。

关键词：猪带绦虫六钩蚴实验动物模型金黄地鼠

猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

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中国农业科学 2004年第5期37卷 776-780页

作者：贾万忠郑亚东王佩雅陈涓程晓红景志忠才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到... 详细信息

根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的45W基因家族新成员。各cDNA克隆之间核苷酸序列的差异性为1.5%～19.8%,氨基酸序列之间的差异性为2.6%～29.7%,后者比前者的差异程度更大。

关键词：猪带绦虫 45W基因 cDNA

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猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选

中国兽医学报 2003年第6期23卷 567-569页

作者：唐雨德陆承平南京军区军事医学研究所江苏南京210002 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库... 详细信息

在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5～ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库。

关键词：猪带绦虫六钩蚴 cDNA文库囊虫病免疫抗原筛选

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猪带绦虫六钩蚴抗原基因的克隆与表达

中国兽医学报 1997年第5期17卷 470-472页

作者：翟春生唐雨德顾志香南京军区军事医学研究所

以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫六钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合... 详细信息

以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫六钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合蛋白（Ｍｒ分别为５×１０４和６×１０４）的工程菌。在ＬＢ营养液中添加１％乳糖和０．２％葡萄糖，工程菌的表达效果优于用ＩＰＴＧ诱导的效果。融合蛋白约占工程菌总蛋白的２３％。

关键词：猪带绦虫 cDNA文库基因克隆融合表达

猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究

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中国人兽共患病学报 2015年第7期31卷 645-648页

作者：周必英刘美辰杨凤娇遵义医学院寄生虫学教研室遵义563003

目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4BTSOL18电转入长双歧杆菌(***),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/***、pGEX-TSOL18/***和pGEXTSO45W-4B-TSOL18/***,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析。结果阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/***、pGEX-TSOL18/***和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/***分别在常温下、4℃、-20℃、-80℃、-196℃(液氮中)分别保存48h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/***、pGEX-TSOL18/***和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/***在液氮中、-80℃、-20℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象。结论猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存最稳定,常温最差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。

关键词：猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗保存稳定性

猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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中国人兽共患病学报 2019年第12期35卷 1100-1105页

作者：罗波李想周必英遵义医科大学寄生虫学教研室

目的建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法通过逆转录PCR(RT-PCR)技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express... 详细信息

目的建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法通过逆转录PCR(RT-PCR)技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达产物,用HisLink亲和层析柱进行纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的分布。结果成功构建猪带绦虫重组表达质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 kD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了Ts14-3-3.3多克隆抗体,其效价为1∶512000。Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论成功制备猪带绦虫重组Ts14-3-3.3蛋白,并获得了高纯度、高效价的兔多克隆抗体。

关键词：猪带绦虫 Ts14-3-3.3蛋白原核表达多克隆抗体