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松材线虫及其近缘种热激蛋白90基因(hsp90)克隆与序列分析

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农业生物技术学报 2011年第5期19卷 916-923页

作者：代玲玲彭德良黄文坤彭焕龙海波王高峰中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

热激蛋白90家族(heat shock protein 90(HSP)family)是一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用。本研究用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Burs... 详细信息

热激蛋白90家族(heat shock protein 90(HSP)family)是一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用。本研究用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)和豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchus doui)热激蛋白90基因的cDNA全长序列,分别命名为Bx-hsp90、Bm-hsp90和Bd-hsp90,(GenBank登录号分别为:GU013561、HMO34943和HM347331),其cDNA全长分别为2255、2193和2232bp,开放阅读框均为2127bp,编码708个氨基酸,5’端非编码区的长度分别为33、13和13bp,3’端非编码区的长度分别为95、53和92bp。其DNA全长分别为2440、2388和2407bp,包含3个内含子。三者氨基酸序列的一致性为98.78%。进化分析表明,松材线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫与秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的亲缘关系较近,推测三者的进化较为低等。松材线虫热激蛋白90基因与松材线虫对环境温度的适应性密切相关。本研究结果对于深入了解和研究松材线虫的入侵机制具有重要的实际意义,为松材线虫及其近似种对环境适应性等方面的研究提供了良好的技术基础。

关键词：松材线虫拟松材线虫豆伞滑刃线虫热激蛋白90 基因克隆

叶用莴苣热激蛋白90(LsHsp90)基因的克隆及其在热激下的表达

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中国农业科学 2013年第16期46卷 3514-3522页

作者：任月韩莹琰李婷郝敬虹范双喜北京农学院植物科学技术学院

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA中克隆LsHsp90 cDNA序列。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分... 详细信息

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA中克隆LsHsp90 cDNA序列。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥(AY081302.1)、紫茎泽兰(EU269070.1)等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因(EU269070.1)聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。

关键词：叶用莴苣热激蛋白90 基因克隆高温胁迫基因表达

温度和病原菌感染对大黄鱼热激蛋白90基因表达的影响

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中国细胞生物学学报 2012年第6期34卷 555-564页

作者：林天势薛良义孙爱飞朱艺峰宁波大学海洋学院宁波315211

热激蛋白(heat shock protein,HSP)是进化上非常保守的蛋白质家族之一,普遍存在于各种生物体中,在多种生理活动中起到重要作用。该实验克隆了大黄鱼HSP90基因,并分析了温度和病原菌感染对其表达的影响。克隆到的大黄鱼HSP90序列长3 930 ... 详细信息

热激蛋白(heat shock protein,HSP)是进化上非常保守的蛋白质家族之一,普遍存在于各种生物体中,在多种生理活动中起到重要作用。该实验克隆了大黄鱼HSP90基因,并分析了温度和病原菌感染对其表达的影响。克隆到的大黄鱼HSP90序列长3 930 nt,含4个外显子和3个内含子,其中编码区2 178 nt,编码725个氨基酸。同源性分析发现,大黄鱼HSP90基因序列和其它鱼类的同源性在90%以上。在不同水温下,HSP90基因在不同组织中的表达量变化不同,心、肠和脑等组织在29 oC时表达量最高,而肌肉、脾和肝等组织在24 oC时表达量最高。用病原菌感染大黄鱼,感染48 h后,鳃、心、脾、肠、肾和脑组织HSP90的表达量明显上升;发病时(感染7天后),受检的9种组织中HSP90的表达量都比未感染时明显增加。

关键词：大黄鱼热激蛋白90 温度病菌感染基因表达

棉蚜热诱导型热激蛋白90基因响应棉酚与氟吡呋喃酮胁迫以及与转录因子HSF的相互影响

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昆虫学报 2023年第11期66卷 1490-1499页

作者：梁平卓李仁程沈航李大鹏张雷甄丛爱中国农业大学昆虫学系北京100193 中国园林博物馆北京100072

【目的】本研究旨在鉴定棉蚜Aphis gossypii中热激蛋白(heat shock protein,Hsp)基因AgHsp90并明确AgHsp90对温度及植物次生物质和杀虫剂胁迫的响应。【方法】RT-PCR结合RACE克隆棉蚜AgHsp90并进行生物信息学分析;qRT-PCR检测AgHsp90在... 详细信息

【目的】本研究旨在鉴定棉蚜Aphis gossypii中热激蛋白(heat shock protein,Hsp)基因AgHsp90并明确AgHsp90对温度及植物次生物质和杀虫剂胁迫的响应。【方法】RT-PCR结合RACE克隆棉蚜AgHsp90并进行生物信息学分析;qRT-PCR检测AgHsp90在棉蚜不同发育阶段(1-4龄若虫和成虫)、不同温度(-5,0,5,10,15,20,30,35,38和42℃)处理1 h时成虫中以及植物次生物质(20 mg/L单宁酸、50 mg/L的棉酚、50 mg/L 2-十三烷酮和50 mg/L槲皮素)和杀虫剂氟吡呋喃酮[LC25(2.410 mg/L)]胁迫24 h时成虫中的表达量。通过饲喂法对棉蚜成虫AgHsp90和热激因子(heat shock factor,HSF)基因AgHSF进行RNAi,24 h时用饲喂法及浸叶法分别测定50 mg/L棉酚和LC40(4.649 mg/L)氟吡呋喃酮处理24和48 h时棉蚜成虫死亡率,探究AgHsp90对棉蚜对棉酚和氟吡呋喃酮敏感性的影响,初步证明AgHsp90与AgHSF的相互调控。【结果】获得1个棉蚜Hsp90基因AgHsp90(GenBank登录号:UOF38310),ORF长2181 bp;AgHsp90在棉蚜不同发育阶段间的表达量相对稳定,其中只有3龄若虫与成虫间的表达量存在显著差异。温度胁迫实验结果表明,AgHsp90可以被高温明显诱导,但低温使其表达量降低。分别与对照0.5 mol/L蔗糖和Triton X-100比较,棉蚜成虫中AgHsp90的表达量不被3种植物次生物质(棉酚、单宁酸和槲皮素)显著诱导,可以分别被2-十三烷酮和LC25氟吡呋喃酮显著诱导。与对照(饲喂dsGFP)比较,AgHsp90 RNAi可明显增加棉酚和氟吡呋喃酮导致的棉蚜成虫死亡率;利用RNAi,AgHsp90与其转录因子AgHSF可相互影响彼此的表达量。【结论】棉蚜的热激蛋白基因AgHsp90能够被高温及氟吡呋喃酮显著诱导。AgHsp90很可能与棉蚜对棉酚及氟吡呋喃酮的敏感性相关。上述结果暗示AgHsp90在棉蚜应对高温及杀虫剂氟吡呋喃酮胁迫时发挥重要作用。

关键词：棉蚜热激蛋白90 棉酚氟吡呋喃酮 HSF

莲草直胸跳甲热激蛋白90基因的分子特征、表达模式及对温度胁迫的响应

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植物保护 2023年第2期49卷 279-287页

作者：梁晓翠武强靳继苏裴怡铭郭建英万方浩中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害综合治理全国重点实验室北京100193 中国农业科学院深圳农业基因组研究所岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心农业农村部农业基因数据分析重点实验室深圳518120

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是世界性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌,冬季低温和夏季高温会影响其种群数量从而降低防控效果。为进一步探讨莲草直胸跳甲对温度胁迫适应性的分子生态机制,本研究对其... 详细信息

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是世界性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌,冬季低温和夏季高温会影响其种群数量从而降低防控效果。为进一步探讨莲草直胸跳甲对温度胁迫适应性的分子生态机制,本研究对其热激蛋白90(AhHSP90)进行了蛋白结构、磷酸化修饰及系统发育等生物信息学分析,并采用荧光定量PCR检测了AhHSP 90基因的时空表达动态及不同温度胁迫后的表达。RT-qPCR结果显示,AhHSP 90在莲草直胸跳甲整个生活史及雌成虫各组织中均有表达;高温(30、35和40℃)、低温(-5、0、5、10、15和20℃)胁迫2 h后,AhHSP 90在高温40℃下表达显著升高,但在其他温度下无显著差异。根据对AhHSP 90分子特征、表达模式以及对温度胁迫的响应等方面的综合分析,推测其可能在莲草直胸跳甲发育及抵抗高温过程中发挥着重要的作用。

关键词：莲草直胸跳甲空心莲子草热激蛋白90 表达模式温度胁迫

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昆虫热激蛋白90的研究进展

生物技术通报 2014年第2期30卷 15-23页

作者：张珂翁群芳付昊昊华南农业大学天然源农药与化学生物学教育部重点实验室广州510642

热激蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是细胞内最为广泛的分子伴侣之一,间接调控细胞内多条与细胞增殖、分化、存活、滞育以及与凋亡相关的信号转导通路。近年来,对Hsp90家族成员在分子水平上的认识不断深入,Hsp90已成为细胞免疫、... 详细信息

热激蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是细胞内最为广泛的分子伴侣之一,间接调控细胞内多条与细胞增殖、分化、存活、滞育以及与凋亡相关的信号转导通路。近年来,对Hsp90家族成员在分子水平上的认识不断深入,Hsp90已成为细胞免疫、信号转导以及抗肿瘤研究的前沿课题。昆虫功能基因组的研究正在世界范围内掀起热潮,与昆虫滞育相关热激蛋白的研究也不断深入。对近年来国内外Hsp90的生物学特性、生物学功能及其在昆虫防治中的研究现状及前景进行综述,以期为害虫综合防治的研究提供参考信息。

关键词：热激蛋白90 分子伴侣滞育应用

中华绒螯蟹热激蛋白90基因内含子的克隆与界定

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南京师大学报（自然科学版） 2013年第4期36卷 107-113,119页

作者：张入峰宋金远李鹏陆舟严洁吴烨高勍南京师范大学生命科学学院江苏南京210023

热激蛋白家族中分子量为90kDa的热激蛋白(HSP90)是真核细胞胞质中最丰富和高度保守的蛋白质之一.HSP90作为一种重要的分子伴侣,广泛参与细胞的激素信号通路、细胞周期调控以及细胞发育等重要的生理过程;内含子(intron)是基因中的非编码... 详细信息

热激蛋白家族中分子量为90kDa的热激蛋白(HSP90)是真核细胞胞质中最丰富和高度保守的蛋白质之一.HSP90作为一种重要的分子伴侣,广泛参与细胞的激素信号通路、细胞周期调控以及细胞发育等重要的生理过程;内含子(intron)是基因中的非编码DNA片段,参与基因的组织特异性表达、蛋白质变异、基因转录等多种生物学过程.本文通过PCR扩增得到了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)HSP90(命名为EsHSP90)的3个内含子序列(分别为296 bp、140 bp和173bp),内含子1和内含子3的剪接符合GT-AG规律,而内含子2不遵循GT-AG或AT-AC规律.EsHSP90的DNA序列全长为3 126 bp.序列比对分析显示EsHSP90与已知甲壳动物的HSP90具有高于80%的序列相似度.

关键词：中华绒螯蟹热激蛋白90 内含子序列分析

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柞蚕热激蛋白90基因的克隆与表达分析

柞蚕热激蛋白90基因的克隆与表达分析

作者：陈莉安徽农业大学

学位级别：硕士

柞蚕是一种具有重要经济价值的野生绢丝昆虫,属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属。柞蚕茧可作为纺织工业原料使用,其幼虫和蛹还具有重要的药用和食用价值。尽管昆虫在高温和低温等不利环境下的生活史对策已有较多研究报道,但柞蚕对于高温耐... 详细信息

柞蚕是一种具有重要经济价值的野生绢丝昆虫,属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属。柞蚕茧可作为纺织工业原料使用,其幼虫和蛹还具有重要的药用和食用价值。尽管昆虫在高温和低温等不利环境下的生活史对策已有较多研究报道,但柞蚕对于高温耐受性的生化与分子机制仍未被解析。热激蛋白（heat shock protein Hsp）是一种抗逆蛋白,在细胞受到胁迫时表达量会增加,对细胞起到一种保护作用,帮助生物机体度过不利环境条件。近期的研究还表明,HSPs还与生物的生长、发育与分化、细胞内信号传导和育性转化有关。本论文在克隆获得柞蚕热激蛋白90（Hsp90）基因序列的基础上,进一步对蛹在不同温度胁迫下的相对表达量进行了测定,并且大肠杆菌内进行了成功的表达,从而为阐明柞蚕耐高温的分子机制提供参考。主要结果如下： 1.柞蚕Hsp90克隆及序列分析：根据GenBank中昆虫热激蛋白基因序列同源性设计简并引物,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了柞蚕Hsp90基因cDNA全长序列。柞蚕Hsp90基因cDNA全长序列序列全长2482bp,开放阅读框长2154bp,编码717个氨基酸。预测的该蛋白的相对分子量和等电点分别为82.6kDa和5.0。该序列具有Hsp90家族的典型特征和特殊的功能结构域,并且与多种生物的Hsp90核苷酸序列以及推导的氨基酸序列都具有较高的同源性。系统进化分析表明,柞蚕Hsp90和天蚕的Hsp90氨基酸同源性最高,为94.5%。 2.高温胁迫下柞蚕体内Hsp90基因表达量的变化提取柞蚕幼虫及蛹期的不同组织的RNA,反转录为第一链cDNA进行半定量RT-PCR.实验结果表明,Hsp90在精巢中的表达量较高,而其他被检组织中的表达量无明显差异。利用18S rRNA作为内参基因,以柞蚕不同组织的RNA为模板,结合实时荧光定量PCR （SBGY Real-timePCR）技术分别检测了25℃和42℃胁迫处理30min后柞蚕蛹期体内Hsp90基因相对表达量。结果表明,Hsp90基因表达量随着温度升高呈增加的趋势。42℃胁迫下,不同组织内的Hsp90基因表达量均高于对照的（P＜0.05）。Hsp90基因较高的表达水平说明这种蛋白在柞蚕抗高温中起到一定的保护作用。 3. Hsp90基因的原核表达 PCR法扩增了柞蚕热激蛋白90的ORF,并连接至pET-28a（+）表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,用不同浓度的IPTG进行了诱导表达,经SDS-PAGE电泳和蛋白纯化检测,目的蛋白得到了稳定的表达。

关键词：柞蚕热激蛋白90 克隆实时荧光定量PCR 原核表达

盐角草热激蛋白90（SeHSP90）基因的克隆、表达及耐盐性分析

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盐角草热激蛋白90（SeHSP90）基因的克隆、表达及耐盐性分析

作者：徐凯安徽农业大学

学位级别：硕士

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高盐度对许多高等植物都造成很大的伤害，严重影响着植物的生长和发育，因此，分析植物对于盐胁迫的反应的生理及分子机制，对于耐盐作物的培育，具有重要的实践意义。研究表明，热应激蛋... 详细信息

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高盐度对许多高等植物都造成很大的伤害，严重影响着植物的生长和发育，因此，分析植物对于盐胁迫的反应的生理及分子机制，对于耐盐作物的培育，具有重要的实践意义。研究表明，热应激蛋白（heatshockprotein,HSP）在对盐度胁迫的耐受机制中起到了重要作用，而HSP90又是其家族的重要成员，并发现其在具有耐盐作用的植物体内含量丰富。盐角草是最著名的耐盐植物，其体内是否含有HSP90基因和相对应的蛋白，HSP90基因表达的HSP90蛋白是否在其盐胁迫耐受中起到作用，本实验对此进行了研究。通过简并PCR扩增，获得长度为1142bp的盐角草SeHSP90基因的中间片段，利用RACE技术首次从盐角草中获得SeHSP90（GenBank：KC181862）基因的全长cDNA序列，大小为2461bp，开放阅读框2091bp，编码697个氨基酸，分子量约为79kD。通过生物信息学定位分析表明SeHSP90蛋白在细胞质内合成后不再进行蛋白转运，最终定位于细胞质中，且具有HSP蛋白家族特征序列;理化性质分析表明SeHSP90为亲水性蛋白，等电点为5.01，主要存在有三种的磷酸化氨基酸，不存在跨膜结构和信号肽序列;同源性分析表明，SeHSP90与不同物种的HSP90氨基酸序列间存在多个高度保守区域，且与黄灯笼辣椒亲缘关系最近。通过双酶切技术成功构建原核表达载体pET-SeHSP90并成功转入表达菌株BL21（DE3）。然后利用SDS-PAGE蛋白电泳检测，表达蛋白条带大小与预期一致，说明SeHSP90基因可以在BL21（DE3）中获得表达。进一步进行IPTG浓度优化，表明转入SeHSP90基因的菌株的最适IPTG浓度为0.025mmol/L。通过不同盐浓度实验结果显示重组菌（pET-SeHSP90）的生长明显优于对照菌，并且生长优势随盐度提高而更为显著，盐浓度为5%时，重组菌的生长约为对照菌的1.5倍，6%时约为1.7倍，6.5%时约为2.5倍，7%时约为3倍。因此导入的盐角草SeHSP90基因能够明显提高菌株的耐盐能力。为今后进一步研究盐角草抗逆境的分子机制奠定基础。

关键词：盐胁迫盐角草热激蛋白90 克隆表达耐盐性分析