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耐高温高产灵芝酸灵芝菌株的筛选及其生理机制的初步探究

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耐高温高产灵芝酸灵芝菌株的筛选及其生理机制的初步探究

作者：罗丽媛延安大学

学位级别：硕士

灵芝(Ganoderma)是我国珍贵的药用菌,具有多种活性成分。灵芝酸(Ganoderic acids,GAs)是灵芝中重要的活性成分,灵芝酸含量的高低是鉴定灵芝品质的重要指标。目前灵芝菌丝体以及子实体中灵芝酸含量普遍较低,满足不了工业生产的要求。而... 详细信息

灵芝(Ganoderma)是我国珍贵的药用菌,具有多种活性成分。灵芝酸(Ganoderic acids,GAs)是灵芝中重要的活性成分,灵芝酸含量的高低是鉴定灵芝品质的重要指标。目前灵芝菌丝体以及子实体中灵芝酸含量普遍较低,满足不了工业生产的要求。而且在工业微生物大规模发酵生产活性成分的过程中,耐高温菌株的应用不仅能有效提高细胞的传质速率,缩短生产周期,减少污染,更能大幅度降低冷却水的使用,从而达到节能减排的目的。为此,选育一株能在高温条件下生长性能良好且高产灵芝酸的灵芝菌株能够有效驱动灵芝产业的高质量发展。针对以上问题,本研究收集了17株用于工业生产及研究较多的灵芝菌株,综合灵芝菌丝形态观察、拮抗实验、ITS序列比对及发育树分析三个方面对其进行分类鉴定,然后以菌丝生长性能和灵芝酸产量为指标对17株灵芝菌株进行高温和高产灵芝酸目的菌株筛选,接着在高温培养条件下,以灵芝酸产量为衡量指标对目的菌株进行基于响应面法的高产灵芝酸发酵培养条件优化,得到高效生产灵芝酸的最佳发酵培养条件。最后通过测定相应的生理指标,初步探究高温高产灵芝酸灵芝菌株的作用机制,得出以下结果:(1)将收集到的11株灵芝菌株鉴定为灵芝属,分为四类,G1为白肉灵芝(Gano derma leucocontextum);G2、G4、G6为松杉灵芝(Ganoderma tsugae);G8为无柄灵芝(Ganoderma sessile);G3、G5、G7、G9、G10、G11为赤芝(Ganoderma lucidum)。(2)G8菌株在20℃、25℃、30℃、35℃固体平板培养下的灵芝菌丝生长速率最快,最快达到11.04±0.06 mm/d。G8菌株在25℃、35℃下的液体发酵过程中在第8d达到菌丝体生物量最大值,发酵生长性能好,且相较于其他菌株具有显著干重优势,最高达到2.25±0.06 g/100 m L。G8菌株在25℃和35℃发酵培养10 d的菌丝体中的总灵芝酸含量无明显优势,但灵芝酸产量明显高于其他菌株,最高达57.06±3.98 mg/100 m L。综合以上结果,筛选得到G8为耐高温高产灵芝酸灵芝菌株。(3)G8菌株高温高效生产灵芝酸的最佳发酵培养条件为发酵液初始p H为3.8,转速159 rpm,接种量为10%,总灵芝酸产量达到89.35 mg/100 m L,较未优化前提高了57%。(4)相比较于25℃,35℃灵芝菌丝体中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量明显下降,总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)活力、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活力显著上升,胞外酶活活力提高,总抗氧化能力(Total antioxid ant capacity,T-AOC)显著上升,2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)自由基清除能力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力有所提高,还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量显著上升,可溶性蛋白含量提高,多糖含量显著升高,海藻糖含量显著上升,海藻糖代谢相关的基因海藻糖6-磷酸合成酶1(Trehalose6-phosphate synthase 1,TPS1)、海藻糖6-磷酸合成酶2(Trehalose 6-phosphate syn thase 2,TPS2)及海藻糖酶1(Trehalase 1,TRE1)和海藻糖酶2(Trehalase 1,TRE2)的转录水平也提高了。(5)25℃和35℃下发酵培养的G8菌丝体中的主要脂肪酸组分为亚油酸(C18:2)、棕榈酸(C16:0)和油酸(C18:1)。相较于25℃,35℃下的G8菌丝体中的饱和脂肪酸种类和含量增加,脂肪酸不饱和度提高。(6)比较G8菌株在25℃和35℃培养温度下的总灵芝酸含量及生物合成相关基因转录水平,发现35℃下的总灵芝酸含量较25℃提高了6%,羊毛甾醇合成酶(Lan osterol synthase,LS)和细胞色素加氧酶5150L8基因(Cytochrome oxygenase 5150L8,CYP5150L8)较25℃下的转录水平无明显差异,但3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase,HMGR)、鲨烯合成酶(Squalene syn thase,SQS)、法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的转录水平有不同程度的

关键词：灵芝灵芝酸分类鉴定培养优化生理机制

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灵芝酸的药物代谢动力学研究进展

中国中药杂志 2019年第5期44卷 905-911页

作者：张菲菲刘如明遵义医学院附属医院医药生物技术研究所贵州遵义563003 遵义医学院附属医院创伤修复实验室贵州遵义563003

灵芝酸(ganoderic acid,GA)是传统名贵中草药灵芝的主要活性成分,是一类结构高度氧化的四环三萜类羊毛甾烷型衍生物,具有多种重要的药理活性,如抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、抗糖尿病及抗HIV等。目前,有关灵芝酸的研究主要集中在生物合成... 详细信息

灵芝酸(ganoderic acid,GA)是传统名贵中草药灵芝的主要活性成分,是一类结构高度氧化的四环三萜类羊毛甾烷型衍生物,具有多种重要的药理活性,如抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、抗糖尿病及抗HIV等。目前,有关灵芝酸的研究主要集中在生物合成、发酵调控、分离纯化、结构鉴定和药理药效等方面,与临床应用密切相关的药物代谢动力学研究还相对偏少。近年来研究表明,GA口服后,可经胃肠道迅速吸收并广泛分布于各组织器官,在肝脏发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢后,主要经胆汁排泄。该文对GA的药代动力学特征及其吸收、分布、代谢和排泄过程进行较为系统的梳理,以期为灵芝三萜类药物的应用开发研究及临床合理用药提供科学依据。

关键词：灵芝灵芝酸药物代谢动力学研究进展

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灵芝酸生物合成及代谢调控研究进展

生物技术通报 2021年第8期37卷 46-54页

作者：袁恺何伟杨云丽朱威宇彭超安泰李丽周卫强中粮营养健康研究院有限公司北京102209 营养健康与食品安全北京市重点实验室北京102209 北京工商大学化学与材料工程学院北京100048

灵芝酸是药用灵芝菌的次级代谢产物,是灵芝菌的主要活性成分之一,已经在抗癌以及其他医药领域进行了深入研究。为了解决灵芝孢子、子实体生长周期长,生长环境要求高以及灵芝酸含量低等问题,灵芝菌深层液体发酵技术应运而生。尽管已经取... 详细信息

灵芝酸是药用灵芝菌的次级代谢产物,是灵芝菌的主要活性成分之一,已经在抗癌以及其他医药领域进行了深入研究。为了解决灵芝孢子、子实体生长周期长,生长环境要求高以及灵芝酸含量低等问题,灵芝菌深层液体发酵技术应运而生。尽管已经取得了一定的突破,但是发酵生产灵芝酸的低产量问题依然存在。灵芝酸生物合成途径的解析和调控对于解决发酵生产灵芝酸低产量问题意义重大,本文系统综述了近年来在灵芝酸生物合成和代谢调控方面的研究进展,并提出未来研究重点方向,为进一步通过基因工程手段和代谢通路调控手段实现灵芝酸的高浓度积累提供参考。

关键词：灵芝酸合成代谢基因工程代谢调控

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灵芝酸的分子结构与生物活性的关系

无锡轻工大学学报（食品与生物技术） 2002年第3期21卷 249-253页

作者：杨海龙吴天祥等江南大学生物工程学院江苏无锡214036

用量子化学半经验方法（AM1）计算了从发酵生产的灵芝菌丝体中纯化得到的灵芝酸组分M1和M2的分子轨道和电子结构，结果表明：M1和M2的分了轨道组成及电子结构较为相似，但在前线轨道上存在差异（M1的LUMO能量较低），它们的生物活性相... 详细信息

用量子化学半经验方法（AM1）计算了从发酵生产的灵芝菌丝体中纯化得到的灵芝酸组分M1和M2的分子轨道和电子结构，结果表明：M1和M2的分了轨道组成及电子结构较为相似，但在前线轨道上存在差异（M1的LUMO能量较低），它们的生物活性相近但又有差别，与灵芝酸M1和M2抑菌试验的结果相符。此外，从理论上探讨了灵芝酸分子结构与生物活性间的关系。

关键词：灵芝酸分子结构生物活性灵芝量子化学半经验方法

组蛋白乙酰化对灵芝生长、灵芝多糖和灵芝酸生物合成的影响

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中国农业科学 2020年第3期53卷 632-641页

作者：张宗源蒋咏梅章文贤福建师范大学生命科学学院河南省科学院生物研究所有限责任公司

【目的】组蛋白乙酰化修饰对真菌生长发育和次级代谢合成具有重要的调控作用。研究组蛋白乙酰化对静置培养的灵芝生长发育和主要代谢物合成的影响,为表观遗传手段提高灵芝多糖和灵芝酸生物合成提供理论依据。【方法】采用液体振荡-静置... 详细信息

【目的】组蛋白乙酰化修饰对真菌生长发育和次级代谢合成具有重要的调控作用。研究组蛋白乙酰化对静置培养的灵芝生长发育和主要代谢物合成的影响,为表观遗传手段提高灵芝多糖和灵芝酸生物合成提供理论依据。【方法】采用液体振荡-静置两阶段法培养灵芝。在静置培养阶段添加不同浓度(0、0.6、60、120和180μmol·L)辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA),采用常规方法测定或观察灵芝生物量、糖消耗、上层菌丝膜形成、菌丝体形态、灵芝孢子生成以及灵芝酸和灵芝多糖生物合成,利用蛋白免疫印迹技术测定灵芝组蛋白乙酰化水平;利用qRT-PCR技术对灵芝多糖(ugp、gls和pgm)、灵芝酸(hmgr、sqs、se和ls)生物合成关键基因以及灵芝全局调控因子相关基因(vet和LaeA)进行表达分析。【结果】SAHA处理使灵芝组蛋白H乙酰化水平提高,最高为对照组的1.6倍;抑制了灵芝菌丝体生长和色素产生,改变了菌丝体的形态。灵芝孢子的形成也受到抑制,且SAHA浓度越大,抑制程度越明显。SAHA处理显著增加了灵芝多糖的产量,最高增加50%;灵芝酸生物合成受到抑制,与对照相比降低13%—27%;qRT-PCR分析结果表明SAHA处理下灵芝多糖与灵芝酸合成关键酶基因表达均有不同程度上调,其中灵芝多糖合成关键酶基因提升1.5—3.5倍,灵芝酸合成关键酶基因提升1.8—12.1倍;灵芝全局性调控因子vet和LaeA的表达被抑制,仅为对照组的11.30%—62.4%。【结论】组蛋白乙酰化可通过灵芝全局调控因子调控灵芝生长发育进而影响灵芝酸生物合成,同时组蛋白乙酰化对灵芝多糖生物合也有影响。

关键词：灵芝组蛋白乙酰化灵芝酸灵芝多糖 SAHA

灵芝酸A对人肝癌细胞的辐射增敏效应的初步研究

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原子核物理评论 2020年第1期37卷 97-103页

作者：邵长胜张群霞汪建业黄青中国科学院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所合肥230031 中国科学技术大学合肥230027 中国科学院核能安全技术研究所合肥230031

本研究旨在初步探讨灵芝酸A(GAA)对人肝癌细胞系HepG2在高LET中子和低LET的γ射线条件下的辐射敏感性的影响及差异。研究中,我们用CCK-8方法检测不同浓度GAA对HepG2增殖抑制作用。选取低浓度(5μmol/L)GAA预处理细胞24 h,分别给予不同... 详细信息

本研究旨在初步探讨灵芝酸A(GAA)对人肝癌细胞系HepG2在高LET中子和低LET的γ射线条件下的辐射敏感性的影响及差异。研究中,我们用CCK-8方法检测不同浓度GAA对HepG2增殖抑制作用。选取低浓度(5μmol/L)GAA预处理细胞24 h,分别给予不同剂量的中子辐照或γ射线辐照,分别检测克隆存活率、细胞凋亡和γH2AX蛋白的foci的形成。结果表明:在不加GAA的情况下,高LET中子辐射比低LET的γ射线对细胞产生的凋亡比例高;在添加了GAA后,与未加GAA对照组相比,诱导细胞凋亡的比例明显增加;另外,加GAA处理后,细胞增殖抑制率也随着辐照剂量的增加而增高。即GAA能增加HepG2细胞的辐射敏感性,而在同样GAA剂量下,HepG2细胞对高LET中子辐射比低LET的γ射线更敏感。由此,这项研究说明灵芝酸或可开发成为一种天然辐射增敏剂,从而为癌症特别是肝癌的放疗提供新的辅助治疗方法。

关键词：灵芝酸肝癌细胞中子 γ射线辐射增敏线性能量传递(LET) 辐射

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灵芝酸对人体糖代谢调节作用的研究

食品研究与开发 2012年第11期33卷 202-207页

作者：金德宽江苏食品职业技术学院食品与营养工程学院江苏淮安223003

研究了灵芝酸对试验小鼠肝脏糖耗量的影响,结果表明灵芝发酵液、菌丝体以及从发酵液中提取的灵芝酸均能提高糖耗量。分析了糖代谢酶活性和中间代谢产物的变化,己糖激酶活性显著增加,乳酸脱氢酶和乳酸含量均有不同程度降低,丙酮酸含量增... 详细信息

研究了灵芝酸对试验小鼠肝脏糖耗量的影响,结果表明灵芝发酵液、菌丝体以及从发酵液中提取的灵芝酸均能提高糖耗量。分析了糖代谢酶活性和中间代谢产物的变化,己糖激酶活性显著增加,乳酸脱氢酶和乳酸含量均有不同程度降低,丙酮酸含量增加,丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶活性显著增强,细胞色素氧化酶活性显著增强,灵芝酸主要通过增加糖的好氧代谢提高糖耗量,为灵芝酸广泛的药理活性提供了新的理论参考。

关键词：灵芝酸发酵液糖耗量糖代谢

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灵芝酸抗癌机制的分子模拟研究

沈阳药科大学学报 2012年第11期29卷 887-892页

作者：王健杨元帅王钢谭深鹏程卯生容士宏沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室辽宁沈阳110016

目的分析灵芝酸与肿瘤靶酶的相互作用模式,研究灵芝酸的抗肿瘤机制。方法根据灵芝酸结构寻找可能的肿瘤靶点,并基于靶点结构,利用分子对接,探讨灵芝酸与靶酶的相互作用模式以及作用强度。结果与结论预测了灵芝酸与肿瘤靶标的结合方式,... 详细信息

目的分析灵芝酸与肿瘤靶酶的相互作用模式,研究灵芝酸的抗肿瘤机制。方法根据灵芝酸结构寻找可能的肿瘤靶点,并基于靶点结构,利用分子对接,探讨灵芝酸与靶酶的相互作用模式以及作用强度。结果与结论预测了灵芝酸与肿瘤靶标的结合方式,有助于理解灵芝酸的抗肿瘤机制。

关键词：灵芝酸靶标预测分子对接抗肿瘤药物开发计算机辅助药物设计

灵芝深层发酵生产胞外多糖和灵芝酸的动力学分析

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应用与环境生物学报 2008年第4期14卷 562-565页

作者：徐鹏钱竹董亮王伟赵长新大连工业大学生物与食品工程学院辽宁省发酵工程重点实验室辽宁大连116034 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 中粮麦芽大连有限公司辽宁大连116200

利用Sigmoid函数构建了灵芝深层发酵生产胞外多糖和灵芝酸的非结构动力学模型，并根据Boltzmann拟合求解出模型参数，模型预测值能够较好地吻合实验所测值．细胞最大比生长速率μmax为4．63×10^-2h^-1，葡萄糖最大比消耗速率qs，max为6... 详细信息

利用Sigmoid函数构建了灵芝深层发酵生产胞外多糖和灵芝酸的非结构动力学模型，并根据Boltzmann拟合求解出模型参数，模型预测值能够较好地吻合实验所测值．细胞最大比生长速率μmax为4．63×10^-2h^-1，葡萄糖最大比消耗速率qs，max为6．70×10^-2h^-1，胞外多糖最大比合成速率qEPS,max为4．65×10^-3h^-1，灵芝酸最大比合成速率qGA,max为9．09×10^-4h^-1．灵芝胞外多糖的合成与细胞的生长呈现部分偶联关系；灵芝酸的合成与细胞的生长呈现偶联关系，偶联系数αGA为0．0204g g^-1．胞外多糖对葡萄糖的最大得率系数（YEPS/S）为0．214gg^-1；灵芝发酵40～80h代谢碳流迅速从菌体自身生长迁移至胞外多糖合成，用于合成胞外多糖的最大碳流为23．6％．

关键词：灵芝多糖灵芝酸动力学 Sigrnoid模型