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灰毡毛忍冬花器官发育相关LmSOC1基因克隆及表达分析

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中南林业科技大学学报 2024年第5期44卷 181-190页

作者：龙丽君马英姿曾慧杰李昌珠张岗刘思思李依民湖南省林业科学院经济林研究所湖南长沙410004 中南林业科技大学生命科学与技术学院湖南长沙410004 陕西中医药大学陕西省中医药管理局“秦药”研发重点实验室陕西西安712046 陕西中医药大学省部共建特色秦药资源研究开发国家重点实验室(培育)陕西咸阳712083

【目的】克隆灰毡毛忍冬MADS-box家族基因SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1),对其进行生物信息学和表达模式分析,为探究灰毡毛忍冬花冠不开放机制奠定理论基础。【方法】基于花蕾型灰毡毛忍冬转录组数据,筛选到开花调控基因LmS... 详细信息

【目的】克隆灰毡毛忍冬MADS-box家族基因SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1),对其进行生物信息学和表达模式分析,为探究灰毡毛忍冬花冠不开放机制奠定理论基础。【方法】基于花蕾型灰毡毛忍冬转录组数据,筛选到开花调控基因LmSOC1的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过生物信息学分析和实时荧光定量PCR技术分析编码蛋白特性和不同品种中LmSOC1基因的表达特异性,最后将LmSOC1基因插入到原核表达质粒载体pTOPO-D1中,并在表达宿主BL21(DE3)中进行蛋白表达。【结果】LmSOC1基因包含645bp的ORF区,LmSOC1蛋白不含信号肽、无跨膜区,为稳定的亲水性蛋白。系统进化树分析表明,LmSOC1蛋白与黄花蒿、榴莲、可可等的SOC1蛋白亲缘关系更近。实时荧光定量PCR分析表明,在2个花蕾型灰毡毛忍冬品种的花蕾和叶片中均检测到LmSOC1基因的表达,而叶片中表达量明显高于花蕾。同时,在早期花蕾中LmSOC1基因的表达量高于晚期花蕾,在‘金翠蕾’品种中这一表达差异极显著(P灰毡毛忍冬花器官发育过程中发挥重要作用,为进一步研究该基因在植物花发育中的生物学功能奠定了基础。

关键词：灰毡毛忍冬 MADS-box LmSOC1 基因克隆表达分析原核表达

灰毡毛忍冬AP1同源基因的克隆及互作蛋白鉴定

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药学学报 2024年

作者：俞亚欣龙丽君李昌珠曾慧杰乔中全刘思思马英姿中南林业科技大学生命与环境科学学院湖南省林业科学院省部共建木本油料资源利用国家重点实验室

MADS-box家族基因是一类十分重要的转录调控基因，在植物的整个生长发育过程中发挥重要作用。其中家族成员APETALA1 (AP1) 基因不仅在植物开花转变过程中发挥调控作用，还控制着花器官的特征发育。灰毡毛忍冬以干燥花蕾和初开的花入药... 详细信息

MADS-box家族基因是一类十分重要的转录调控基因，在植物的整个生长发育过程中发挥重要作用。其中家族成员APETALA1 (AP1) 基因不仅在植物开花转变过程中发挥调控作用，还控制着花器官的特征发育。灰毡毛忍冬以干燥花蕾和初开的花入药，因此研究AP1基因参与调控灰毡毛忍冬花器官发育的潜在机制可以为分子手段提高其药用价值提供基础。本研究采用逆转录PCR (RT-PCR) 对AP1同源基因的cDNA全长进行扩增，并将其命名为LmMADS4。结果显示， LmMADS4基因CDS序列长729 bp，编码242个氨基酸，且LmMADS4蛋白不含信号肽，无跨膜结构，为不稳定的亲水性蛋白。通过序列比对及系统进化分析， LmMADS4与忍冬MADS27蛋白聚为一类，亲缘关系最近。最后利用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应 (qRT-PCR)、酵母双杂交技术对LmMADS4基因的表达模式、蛋白间的相互作用进行了分析。qRT-PCR 结果表明， LmMADS4基因在灰毡毛忍冬花蕾型龙花和野生型白云的茎、叶以及花蕾不同发育时期均有差异表达; 其中LmMADS4基因主要在龙花和白云生殖器官花蕾中高表达，且随着灰毡毛忍冬花蕾的发育， LmMADS4基因在花蕾型品种龙花中呈现持续上调表达的趋势，而在白云花蕾末期的表达水平较花蕾晚期有所降低，但差异不显著。酵母双杂交结果表明，构建的诱饵载体pGBKT7-LmMADS4对酵母菌株无毒性，也无自激活活性， LmMADS4蛋白与LmSVP1蛋白、LmSVP3蛋白和LmSOC1s蛋白间均存在相互作用。该研究可为分子层面探索灰毡毛忍冬蕾期长和花冠不展开的作用机制以及品种改良提供理论依据。

关键词：灰毡毛忍冬 MADS-box 基因克隆花器官蛋白互作

灰毡毛忍冬ERF基因家族鉴定及其在衰老过程中的表达分析

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经济林研究 2024年 13-28页

作者：刘燕妮曹正艳吴佩荫李清清陈泽雄唐宁重庆三峡学院生物与食品工程学院重庆文理学院智慧农业学院重庆文理学院特色植物研究院

【目的】灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides为我国南方地区大宗道地中药材和重要经济植物，绿原酸和木犀草苷等药效物质在器官衰老过程中积累且受转录因子调控。乙烯信号转导相关ERF基因家族广泛参与植物的衰老、胁迫响应和次生代谢。... 详细信息

【目的】灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides为我国南方地区大宗道地中药材和重要经济植物，绿原酸和木犀草苷等药效物质在器官衰老过程中积累且受转录因子调控。乙烯信号转导相关ERF基因家族广泛参与植物的衰老、胁迫响应和次生代谢。鉴定灰毡毛忍冬ERF家族成员并探究其表达模式，可为该类基因调控次生代谢的功能研究提供参考。【方法】基于转录组数据鉴定灰毡毛忍冬ERF转录因子家族，通过系统发育树分析其进化关系，利用MEME在线网站分析序列的结构基序。QRT-PCR分析LmERFs基因在不同器官衰老过程以及冷胁迫和乙烯处理后的表达模式。【结果】在灰毡毛忍冬中共鉴定出65个具AP2保守结构域的LmERFs基因，可将其分为3个亚组。利用RNA-Seq技术筛选了在幼嫩和衰老叶片之间差异表达的20个LmERFs。进一步qRT-PCR分析显示，分别有18个、13个和11个LmERFs基因在叶片、茎和花的衰老过程显著差异表达，其中LmERF2、LmERF9、LmERF16、LmERF17和LmERF19基因表达在不同器官衰老过程中均具显著差异。冷胁迫后，叶和茎中7个LmERFs(LmERF1、LmERF2、LmERF6、LmERF7、LmERF8、LmERF11和LmERF12)显著上调，LmERF3、LmERF9、LmERF16和LmERF19显著下调；而乙烯处理诱导了LmERF1、LmERF8和LmERF12基因的表达，抑制了LmERF2、LmERF4、LmERF9、LmERF10、LmERF14、LmERF15、LmERF16、LmERF17、LmERF18和LmERF19基因的表达。【结论】8个LmERFs(LmERF1、LmERF2、LmERF6、LmERF9、LmERF10、LmERF15、LmERF16和LmERF19)响应了器官发育、冷胁迫和乙烯诱导的衰老过程，这为后续挖掘高效调控灰毡毛忍冬次生代谢的靶点LmERFs提供了数据支持。

关键词：灰毡毛忍冬 ERF基因家族器官衰老乙烯冷害胁迫

基于代谢组学及转录组学研究灰毡毛忍冬不同品种黄酮类成分差异积累的转录调控机制

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中国中药杂志 2024年第10期49卷 2666-2679页

作者：张惊宇龙雨青曾娟付学森何佳蔚周日宝刘湘丹湖南中医药大学药学院湖南长沙410208 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室湖南长沙410208 湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室湖南长沙410208 湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心湖南长沙410208

为探究湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的分子调控机制,该研究以灰毡毛忍冬2个品种花、茎和叶为材料,采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术和高通量转录组测序(RNA-seq)技术进行代谢组学和转录组学联合分析,筛选黄酮... 详细信息

为探究湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的分子调控机制,该研究以灰毡毛忍冬2个品种花、茎和叶为材料,采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术和高通量转录组测序(RNA-seq)技术进行代谢组学和转录组学联合分析,筛选黄酮类差异代谢物、关键差异表达基因及相应转录因子,并随机挑选其中14条差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果表明,代谢组学分析共筛选出黄酮类化合物生物合成相关途径差异代谢物17个,包括柚皮苷查尔酮、芹菜素、槲皮苷等;转录组学分析共筛选出黄酮类化合物生物合成相关途径差异表达基因19条,包括2条CHS、3条CHI等;调控网络分析和加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选出调节黄酮类成分积累的关键酶基因CHS1、FLS1和HCT;同时发现MYB12和LBD4这2个转录因子可能通过调控关键酶基因CHS1、FLS1和HCT的表达来调控黄酮类成分的生物合成;qRT-PCR结果显示,随机选取的14个差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果基本一致。该研究初步解析了2个品种灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的转录调控机制,为进一步阐明其中关键酶基因及相应转录因子对灰毡毛忍冬黄酮类成分积累的调控作用奠定基础。

关键词：灰毡毛忍冬黄酮类化合物转录代谢组学联合分析转录因子调控机制

灰毡毛忍冬绿原酸生物合成关键基因LmMYB111的筛选及功能分析

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灰毡毛忍冬绿原酸生物合成关键基因LmMYB111的筛选及功能分析

作者：刘燕妮重庆三峡学院

学位级别：硕士

灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz.),又名大金银花,是忍冬科忍冬属药用植物,主要分布于重庆、湖南、贵州等省市,为我国南方地区大宗道地中药材,因其产量高、适应性强,是武陵山区乡村振兴的重要特色经济植物。绿原酸是灰毡... 详细信息

灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz.),又名大金银花,是忍冬科忍冬属药用植物,主要分布于重庆、湖南、贵州等省市,为我国南方地区大宗道地中药材,因其产量高、适应性强,是武陵山区乡村振兴的重要特色经济植物。绿原酸是灰毡毛忍冬主要苯丙烷类次生代谢产物和核心药效成分,具有抗病毒、增强免疫力等功效,是国家中医药保健产业的重要原料。因此,利用生物技术手段培育高绿原酸含量的灰毡毛忍冬新品种具有广阔的应用前景,而深入认知绿原酸生物合成的分子机制是实现这一目标的重要理论基础。研究表明,转录因子在次生代谢产物合成的调控中起了重要作用。MYB转录因子可通过结合结构基因的启动子调控绿原酸合成,但不同物种间因其代谢途径多样而存在不同的调控机制。在灰毡毛忍冬中,仅有少数MYB成员被揭示参与绿原酸生物合成,其转录调控机制尚不清晰。本研究通过多组学分析、转基因功能验证、蛋白-DNA互作等技术系统解析LmMYB111调控灰毡毛忍冬绿原酸合成和苯丙烷代谢的功能和分子机制,以期为培育高绿原酸含量的灰毡毛忍冬提供重要的理论基础和基因资源。本研究主要结果如下:(1)以灰毡毛忍冬不同发育期的花和叶片为材料,利用代谢组和转录组分析绿原酸等酚酸的含量变化和差异表达的LmMYBs,联合分析筛选获得调控灰毡毛忍冬绿原酸合成的候选转录因子LmMYB111。根据转录组数据设计引物,PCR扩增获得LmMYB111基因序列,其全长c DNA(ORF)为987bp,含328个氨基酸。与同源基因一起构建了系统发育树,发现LmMYB111与拟南芥At MYB111、黄瓜Cs MYB111、金花茶Cn MYB111和油茶Cl MYB111具有很高的同源性,多重序列比对表明LmMYB111包含保守R2R3型MYB结构域。为研究LmMYB111基因在绿原酸合成中的功能,构建超表达载体K303-35S-LmMYB111,利用农杆菌介导法遗传转化本氏烟草获得转基因植株,经PCR鉴定共获得6个阳性株系。(2)利用UPLC-MS/MS对高表达的L3、L5转基因植株进行代谢组学分析,发现与野生型相比,绿原酸生物合成的前体物质提高了2-14倍;绿原酸异构体提高了2-15倍,绿原酸含量达到野生型的3.5倍。除此之外,还检测到灰毡毛忍冬重要次生代谢物木犀草苷及其前体物质含量发生显著变化,转基因植株中木犀草素大幅下降,木犀草苷含量显著提高。这表明,LmMYB111是调控包括绿原酸在内的苯丙素类代谢物的正调控因子。RNA-Seq分析发现苯丙烷代谢途径中酶基因,包括6个Lm PALs、3个Lm C4Hs、3个Lm4CLs、4个Lm HQTs、Lm CHS、3个Lm CHIs、Lm FNS和Lm F3H基因在转基因植株显著上调表达;多个转录因子家族基因的表达在超表达LmMYB111后发生了显著变化,包括MYB、b HLH、GRAS等,表明LmMYB111可能通过调控这些结构基因和转录因子参与调控苯丙烷代谢。(3)为研究LmMYB111调控绿原酸合成的分子机制,利用DNA亲和纯化测序(DAP-Seq)筛选了LmMYB111结合的下游靶基因,两个重复共鉴定到8218个Peaks,对其进行功能分类并与转录组联合分析后获得21个可能与绿原酸合成及苯丙烷代谢相关的靶基因。进一步通过凝胶阻滞实验(EMSA)和双荧光素酶报告系统(DLR)从体外和体内两个角度验证了LmMYB111与LmMYB4、Lm PAL、Lm4CL、Lm DFR、Lm TT5五个靶基因的启动子的互作情况,确定LmMYB111能够结合LmMYB4、Lm PAL、Lm4CL、Lm DFR、Lm TT5启动子,并促进它们表达,进而促进灰毡毛忍冬绿原酸合成和苯丙烷代谢。综上所述,本文利用多组学筛选了调控灰毡毛忍冬绿原酸合成的关键转录因子LmMYB111;通过异源转基因功能分析明确了LmMYB111对绿原酸合成起正调控作用;运用DAP-Seq、EMSA、DLR等蛋白-DNA互作技术筛选鉴定了LmMYB111的下游LmMYB4、Lm PAL等绿原酸合成相关靶基因;研究结果系统解析了LmMYB111调控绿原酸生物合成的分子机制,为高绿原酸含量灰毡毛忍冬的分子育种提供了重要的基因资源。

关键词：灰毡毛忍冬绿原酸合成 MYB转录因子转录调控功能研究

基于代谢组及转录组学研究灰毡毛忍冬不同品种黄酮类成分差异积累的转录调控机制

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中国中药杂志 2024年

作者：张惊宇龙雨青曾娟付学森何佳蔚周日宝刘湘丹湖南中医药大学药学院湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室

为探究湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的分子调控机制，该研究以灰毡毛忍冬两品种花、茎和叶为材料，采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）技术和高通量转录组测序（RNA-seq）技术进行代谢组学和转录组学联合分析，筛... 详细信息

为探究湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的分子调控机制，该研究以灰毡毛忍冬两品种花、茎和叶为材料，采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）技术和高通量转录组测序（RNA-seq）技术进行代谢组学和转录组学联合分析，筛选黄酮类差异代谢物、关键差异表达基因及及相应转录因子，并随机挑选其中14条差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果表明，通过代谢组学分析发现在黄酮类化合物生物合成相关途径中共获得17个差异代谢物，包括柚皮苷查尔酮、芹菜素、槲皮苷等；通过转录组学分析发现黄酮类化合物生物合成相关途径中共筛选出19条差异表达基因，包括2条CHS、3条CHI等；调控网络分析和WGCNA分析筛选出调节黄酮类成分积累的关键酶基因CHS1、FLS1和HCT；同时发现MYB12和LBD4 这2个转录因子可能通过调控关键酶基因CHS1、FLS1和HCT的表达来调控黄酮类成分的生物合成；qRT-PCR结果显示，随机选取的14个差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果基本一致。该研究初步解析了两品种灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的转录调控机制，为进一步阐明其中关键酶基因及相应转录因子对灰毡毛忍冬黄酮类成分积累的调控作用奠定基础。

关键词：灰毡毛忍冬黄酮类化合物转录代谢组学联合分析转录因子调控机制

灰毡毛忍冬bZIP25基因的克隆及其表达模式分析

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中南药学 2024年第2期22卷 335-340页

作者：王珊曾娟谢瑜周日宝刘湘丹童巧珍龙雨青陈言刘小丽湖南中医药大学第二附属医院长沙410005 湖南中医药大学药学院长沙410208 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室长沙410208 湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室长沙410208 焦作市产品质量检验检测中心河南焦作454000

目的克隆灰毡毛忍冬bZIP25基因序列全长,并进行生信分析及表达模式分析,以初步探索其在灰毡毛忍冬中的生物学功能。方法通过逆转录PCR技术克隆bZIP25基因的序列全长,采用生物信息学分析方法对bZIP25及其编码的蛋白进行分析。运用实时荧... 详细信息

目的克隆灰毡毛忍冬bZIP25基因序列全长,并进行生信分析及表达模式分析,以初步探索其在灰毡毛忍冬中的生物学功能。方法通过逆转录PCR技术克隆bZIP25基因的序列全长,采用生物信息学分析方法对bZIP25及其编码的蛋白进行分析。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定其在茎、叶及七个花期花中的表达水平。结果克隆得到LmbZIP25基因(OR551766),其编码191个氨基酸,具有典型的bZIP家族结构,在bZIP结构域中与其他植物同源性较高。LmbZIP25基因具有组织特异性,在茎中的表达量显著高于花和叶,在七个花期中黄色花蕾期的表达量最高。结论克隆得到LmbZIP25基因全长,分析其在不同器官和不同花期的表达差异,为进一步探索其在灰毡毛忍冬中花发育中的功能奠定了研究基础。

关键词：灰毡毛忍冬 bZIP25 基因克隆生物信息学分析表达模式分析

灰毡毛忍冬MADS-box基因家族鉴定与CMB1基因克隆

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湖南中医药大学学报 2024年第3期44卷 383-394页

作者：付学森刘紫璇王玲龙雨青曾娟周日宝刘湘丹湖南中医药大学药学院湖南长沙410208 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室湖南长沙410208 湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室湖南长沙410208 湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心湖南长沙410208

目的鉴定灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并进行生物信息学分析与表达模式验证,克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬MADS-box家族成员CMB1全长。方法基于转录组数据,利用在线工具对灰毡毛忍冬MADS-box进行生物信息学分析,... 详细信息

目的鉴定灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并进行生物信息学分析与表达模式验证,克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬MADS-box家族成员CMB1全长。方法基于转录组数据,利用在线工具对灰毡毛忍冬MADS-box进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR验证MADS-box基因在不同品种中的表达模式,通过RT-PCR、RACE技术克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长。结果28个灰毡毛忍冬MADS-box蛋白长度为89~359 aa,碱性蛋白占比85.7%,不稳定蛋白占比96.4%,亲水性蛋白占比96.4%,均定位于细胞核,均为无跨膜结构的非分泌蛋白。转录组显示,与野生型比较,湘蕾型中28个MADS-box基因有17.86%表达下调,MIKCC型基因中有18.75%表达下调。克隆得到在两个品种的灰毡毛忍冬花中高度特异性表达的CMB1基因全长,均包含一个738 bp的ORF,编码245个氨基酸。CMB1基因在两个品种的花中表达量存在显著差异(P灰毡毛忍冬转录组数据,鉴定了28个MADS-box家族基因,克隆得到湘蕾型与野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长,为进一步研究灰毡毛忍冬花发育、优良表型形成的分子机制提供研究基础与理论依据。

关键词：灰毡毛忍冬 MADS-box基因家族表达分析 CMB1基因基因克隆表型变异

灰毡毛忍冬花器官发育相关MADS-box基因的克隆及功能分析

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灰毡毛忍冬花器官发育相关MADS-box基因的克隆及功能分析

作者：龙丽君中南林业科技大学

学位级别：硕士

灰毡毛忍冬(Lonira mceranthoides Hand.-Mazz.)属忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物,是中药材“山银花”的一种基源植物,其花蕾具有重要的药用价值。普通灰毡毛忍冬花冠展开、蕾期较短,常造成丰产不丰收;近年来,研究员选育... 详细信息

灰毡毛忍冬(Lonira mceranthoides Hand.-Mazz.)属忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物,是中药材“山银花”的一种基源植物,其花蕾具有重要的药用价值。普通灰毡毛忍冬花冠展开、蕾期较短,常造成丰产不丰收;近年来,研究员选育出了蕾期长、花冠不展开的花蕾型灰毡毛忍冬,对灰毡毛忍冬的开发利用具有重要意义。研究表明,在植物花器官发育过程中,MADS-box基因家族发挥了重要调控作用,但在灰毡毛忍冬中如何行使功能还有待进一步研究。鉴于此,本研究以花蕾型灰毡毛忍冬品种‘龙花’为研究材料,采用同源克隆、生物信息学、实时荧光定量PCR、酵母双杂交以及转基因等技术,对灰毡毛忍冬MADS-box基因家族的SVP、SOC1同源基因功能进行了全面系统的研究。旨在揭示SVP、SOC1在花蕾型灰毡毛忍冬花器官发育过程中的分子调控机制,对分子选育蕾期长、花冠不展开的灰毡毛忍冬优良新品种、提高药用忍冬植物产量和品质具有十分重要的意义。主要研究结果如下:1.从灰毡毛忍冬‘龙花’花蕾中克隆得到4个MADS-box基因,分别命名为LmSVP1、LmSVP2以及LmSOC1-1、LmSOC1-2。4个基因编码蛋白均无跨膜结构、无信号肽,为亲水性的不稳定蛋白。序列结构分析表明LmSVPs和LmSOC1s基因分别隶属于StMADS11亚家族和SOC1/TM3亚家族。进化树结果显示,LmSVP1蛋白与小粒咖啡(Coffeaarabica)亲缘关系最近,LmSVP2蛋白与木樨(Osmanthusfragrans)亲缘关系最近,2个LmSOC1s蛋白聚为同一支,与菊科植物黄花蒿(Artemisiaannua)和莴苣(Lactucasativa)亲缘关系最近。2.实时荧光定量PCR检测结果显示,LmSVPs和LmSOC1s基因在花蕾品种‘龙花’和普通品种‘白云’的茎、叶、花蕾中均有表达,但在营养器官中的表达水平整体上高于生殖器官。随着花蕾发育,LmSVPs基因的表达水平总体呈下降趋势,而LmSOC1s基因表现出先升后降的变化趋势。3.将重组质粒pET28a-LmSVPs和pET28a-LmSOC1s转入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE检测结果显示,LmSVPs基因能够表达出约为35 kDa的融合蛋白,LmSOC1s基因能够表达出约为30kDa的融合蛋白,与预测的带6个组氨酸标记的蛋白分子量一致,但表达的蛋白均为包涵体蛋白。4.通过酵母双杂交技术分析了灰毡毛忍冬LmSVPs、LmSOC1s、LmAP1和LmFLC蛋白的相互作用模式。研究结果表明,LmSVP1与LmSVP2、LmSOC1-1与LmSOC1-2之间均能够形成异源二聚体,并且LmSVP2蛋白自身也能够产生互作关系;LmSVPs与LmSOC1s之间存在蛋白体外互作;LmSVPs、LmSOC1s与LmAP1之间均能形成二聚体复合物;LmSVP1还能与LmFLC产生相互作用。5.利用农杆菌介导的花序侵染法,将4个MADS-box基因分别转化至拟南芥中,对转基因拟南芥表型分析发现,LmSVP1和LmSVP2在调控植物开花方面功能存在相似性,都具有延迟开花的作用,植株的花瓣细丝状、心皮伸长和花萼叶片化。但它们的功能又存在差异,LmSVP2的过表达植株出现花蕾期延长、花瓣数量增加、花萼表皮毛增多等现象。这说明LmSVP1和LmSVP2在延迟开花的功能上存在保守性,但在花蕾期调控和花器官形态建成方面表现出不同的功能。qRT-PCR结果表明LmSVP1和LmSVP2可能通过调控FT、SOC1、FLC和AP1的表达来影响植物开花时间及参与花器官的发育。2个LmSOC1s基因都能促进植物开花,但在调控花蕾期和花器官形态发育的功能上也存在差异.LmSOC1-1过表达植株花冠不展开、花蕾期长,而LmSOC1-2过表达植株花瓣呈细丝状。qRT-PCR结果表明,过表达的LmSOC1s通过上调AGL24、LFY促使转基因植株提前开花,同时调控AP1、FUL的表达参与花器官的形态建成。本研究全面鉴定了灰毡毛忍冬转录组中LmSVPs、LmSOC1s等影响花器官发育的基因,并通过分子生物学技术验证了LmSVPs、LmSOC1s在灰毡毛忍冬花发育过程中的功能,为从分子水平上研究花蕾型灰毡毛忍冬花器官发育奠定了基础。

关键词：灰毡毛忍冬花器官发育 MADS-box基因蛋白互作功能验证