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滑液支原体WVU1853株热不稳定延伸因子的表达及黏附特性分析

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畜牧兽医学报 2022年第2期53卷 520-528页

作者：岳亚辉邢小勇武小椿温峰琴张宏燕龙翠琴张立马海云包世俊甘肃农业大学动物医学院兰州730000

旨在探究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)热不稳定延伸因子(elongation factor thermo unstable,EF-Tu)的黏附特性。参照GenBank中MS WVU1853株EF-Tu序列,设计引物对Tu-F/Tu-R,利用PCR扩增获得MS EF-Tu基因后,将其克隆入pET-28a(+)构建重组质粒pET-EF-Tu,继而转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导表达。纯化表达产物免疫新西兰兔制备抗血清,进而利用Western blot、ELISA和免疫荧光试验分别分析重组蛋白的免疫原性及EF-Tu在MS中的分布,利用补体介导的杀菌试验分析重组蛋白抗血清的补体介导杀支原体活性,利用黏附及抑制试验分析EF-Tu的黏附特性。结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,其相对分子质量约43 ku,并具有良好的免疫原性,其抗血清具有补体介导的杀支原体活性;EF-Tu在MS的细胞膜和细胞质中均有分布,且是MS的一种黏附相关蛋白。EF-Tu是MS膜表面黏附相关的免疫原性蛋白,研究结果为深入研究MS EF-Tu生物学功能奠定了基础。

关键词：滑液支原体热不稳定延伸因子免疫原性膜蛋白黏附

滑液支原体间接ELISA检测方法的建立及其单克隆抗体的制备

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滑液支原体间接ELISA检测方法的建立及其单克隆抗体的制备

作者：刘素敏安徽农业大学

学位级别：硕士

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是禽类的一种重要病原,主要感染鸡和火鸡,国内尚没有有效的疫苗。目前滑液支原体的检测和诊断主要应用进口的抗体检测ELISA试剂盒。因其价格昂贵,限制了其在临床大规模使用。因此,开发经济实用的MS... 详细信息

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是禽类的一种重要病原,主要感染鸡和火鸡,国内尚没有有效的疫苗。目前滑液支原体的检测和诊断主要应用进口的抗体检测ELISA试剂盒。因其价格昂贵,限制了其在临床大规模使用。因此,开发经济实用的MS抗体检测试剂盒替代进口产品十分必要。1、重组滑液支原体MSPB、PYK、P80蛋白的制备根据NCBI公布的MS序列设计合成MSPB、PYK和P80蛋白基因,分别克隆至p ColdⅠ载体中,获得重组质粒p Cold-MSPB、p Cold-PYK和p Cold-P80。将三个重组质粒分别转化至BL21(DE3)工程菌中,通过IPTG诱导表达、提取和镍柱纯化,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,获得重组蛋白MSPB、PYK和P80。2、MS抗体检测间接ELISA方法的建立用纯化的重组蛋白MSPB、PYK、P80分别作为包被抗原,以MS阳性血清为对照,筛选出MSPB蛋白为最佳包被抗原。随后,以重组蛋白MSPB为包被抗原,建立MS抗体间接ELISA方法并对其反应条件进行优化。结果显示,MSPB最佳包被浓度为2μg/ml,包被条件为4℃过夜,封闭液为0.4%明胶,显色时间为8min,检测MS阳性血清最低效价为1:12800,敏感性良好。特异性试验结果显示,MSPB蛋白不与MG、AIV(H、H、H)、NDV、IBDV阳性血清反应。批内、批间变异系数小于10%,重复性良好。应用该方法和IDEXX ELISA(MS)试剂盒对204份临床样品进行检测比对。结果显示,r MSPB ELISA的阳性样品的符合率为96.55%(140/145),阴性样品的符合率为92.18%(59/64),两者总符合率为97.54%(199/204)。3、MS单克隆抗体的制备制备灭活的MS全菌免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。应用r MSPB ELISA方法筛选阳性细胞株。经过四次亚克隆,筛选到一株能分泌重组MSPB抗体的杂交瘤细胞,命名为C6。制备腹水,用rMSPB ELISA检测到腹水效价为1:2×10。综上所述,本研究通过原核表达MS外膜蛋白MSPB作为包被抗原,建立了MS抗体ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。用上述建立的r MSPB ELISA方法筛选到一株能分泌MSPB单克隆抗体的杂交瘤细胞。本研究为我国鸡场MS的流行病学监测和调查提供了技术支撑。

关键词：滑液支原体间接ELISA 原核表达单克隆抗体

滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位

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中国兽医科学 2020年第8期50卷 1029-1036页

作者：刘佳张生英邢小勇武小椿温峰琴包世俊甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS DnaK的生物学功能奠定了基础。

关键词：滑液支原体 dnaK基因免疫原性亚细胞定位

滑液支原体NADH氧化酶的酶学活性及亚细胞定位研究

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微生物学通报 2020年第3期47卷 801-812页

作者：李浩然祁晶晶王宇尚原冰王桂军于圣青安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121000

【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病... 详细信息

【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用。【方法】对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX(rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况。【结果】在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53 kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率Vmax为21.8μmol/(L·min),米氏常数Km(NADH)为244.0μmol/L;rMSNOX蛋白与MS阳性血清特异性结合,证明具有良好的免疫原性;亚细胞定位研究表明NOX蛋白主要存在于MS的胞浆中,细胞膜上有少量的分布。【结论】首次证实MS的NOX不仅具有NADH氧化酶活性,也是MS具有免疫原性的膜蛋白,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。

关键词：滑液支原体 NADH氧化酶酶学活性免疫原性亚细胞定位

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滑液支原体分子分型及免疫原性蛋白研究进展

中国动物检疫 2023年第6期40卷 62-68页

作者：刘子卿尚佳静刘冠慧周守长许金朋河北工程大学生命科学与食品工程学院河北邯郸056038 华裕农业科技有限公司河北邯郸057153 河北省蛋鸡产业技术研究院河北邯郸056000

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是感染鸡和火鸡的主要病原体之一,对全球养禽业造成了巨大经济损失。为了选择分子分型方法进行分子生物学鉴定分析,以便研制出安全有效的亚单位疫苗,从病原特征、分子分型和免疫原性蛋白等方面对MS... 详细信息

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是感染鸡和火鸡的主要病原体之一,对全球养禽业造成了巨大经济损失。为了选择分子分型方法进行分子生物学鉴定分析,以便研制出安全有效的亚单位疫苗,从病原特征、分子分型和免疫原性蛋白等方面对MS进行了综述。病原特征主要包括MS生长条件、传播方式和敏感性。MS分型方法众多,目前较为常用的是可变脂蛋白血凝素(vlhA)基因序列分析,其识别力较高,但具有多变性,有时难以确定分离株亲缘关系的相关性;多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)具有分子分型能力强的特点,更适合流行病学调查。目前,亚单位疫苗是支原体疫苗研发的重要方向,而筛选出合适的抗原是制备亚单位疫苗的前提,现已报道多种免疫原性蛋白,如NADH氧化酶、PDHA、MSPB、P35等。未来还需对MS毒力基因、致病机制和传播机制等深入研究,采用统一的分型方法对全球MS菌株进行分子生物学鉴定分析,积极研究免疫原性良好的抗原蛋白。本文为MS分子生物学鉴定及亚单位疫苗研制提供了参考。

关键词：滑液支原体病原特征分子分型免疫原性蛋白

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滑液支原体醛缩酶的亚细胞定位及免疫原性

微生物学通报 2019年第4期46卷 780-789页

作者：王宇祁晶晶刘婷温政闫遵祥高崧于圣青扬州大学兽医学院江苏扬州225009 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 山东农业大学动物科技学院山东泰安271099

【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协... 详细信息

【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞。已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究。【目的】对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础。【方法】通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA(rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Westernblot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况。【结果】生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99%,与其他种属FBA相似性在61%-78%之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasm acricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布。【结论】首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础。

关键词：滑液支原体醛缩酶原核表达亚细胞定位免疫原性

滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析

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畜牧兽医学报 2017年第2期48卷 316-323页

作者：包世俊丁小琴邢小勇伏小平薛慧文温峰琴甘肃农业大学动物医学院兰州730070

膜蛋白是病原菌膜结构的主要组分,其不仅在病原菌的生命活动中具有重要的生理功能,且部分膜蛋白还与病原菌的感染及免疫应答密切相关。因此,本研究旨在应用免疫蛋白质组学方法分离、筛选并鉴定出滑液支原体免疫相关膜蛋白,以期为滑液支... 详细信息

膜蛋白是病原菌膜结构的主要组分,其不仅在病原菌的生命活动中具有重要的生理功能,且部分膜蛋白还与病原菌的感染及免疫应答密切相关。因此,本研究旨在应用免疫蛋白质组学方法分离、筛选并鉴定出滑液支原体免疫相关膜蛋白,以期为滑液支原体感染和免疫机制的研究及相关疾病诊断和防治方法措施的建立奠定基础。笔者应用培养至对数生长中后期的滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株全菌分别免疫鸡和新西兰兔,制备滑液支原体鸡多抗和兔多抗。提取滑液支原体WVU1853株的膜蛋白,应用二维电泳技术对其进行分离,继而应用所制多抗进行Western blot,筛选出免疫原性膜蛋白,并通过质谱分析进行鉴定。结果表明,在筛选的8个蛋白质点中,3个蛋白质点为延伸因子EF-Tu,其余蛋白质点分别是丙酮酸脱羧酶α亚基、β亚基、NADH氧化酶、组氨酰-tRNA合成酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶。其中组氨酰-tRNA合成酶的质谱分析得分太低,尚需进一步验证,而丙酮酸脱羧酶α、β亚基与作为滑液支原体的免疫相关膜蛋白首次被证实。本研究筛选并初步鉴定出滑液支原体7种免疫相关膜蛋白,为深入研究目标蛋白质的生物学特性及新型亚单位疫苗和诊断试剂的研发奠定了基础。

关键词：滑液支原体免疫蛋白质组学膜蛋白鉴定

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冀南地区滑液支原体分离鉴定及耐药性分析

中国畜牧兽医 2023年第10期50卷 4270-4278页

作者：刘子卿熊威振任豆豆周守长刘冠慧许金朋河北工程大学生命科学与食品工程学院邯郸056038 华裕农业科技有限公司邯郸056000 河北省蛋鸡产业技术研究院邯郸056000

【目的】了解中国冀南地区滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的流行和耐药情况,为该地区防控MS感染提供科学依据。【方法】于2019—2022年采集冀南地区疑似MS感染的7个规模化鸡场样品(发病鸡的气囊、腭裂或爪垫渗出液)进行病原分离培... 详细信息

【目的】了解中国冀南地区滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的流行和耐药情况,为该地区防控MS感染提供科学依据。【方法】于2019—2022年采集冀南地区疑似MS感染的7个规模化鸡场样品(发病鸡的气囊、腭裂或爪垫渗出液)进行病原分离培养及PCR鉴定,对分离株进行vlhA基因分型序列分析,采用微量肉汤稀释法测定分离株最小抑菌浓度(MIC)。【结果】所采集样品中分离出9株疑似MS菌株,均可使液体培养基颜色变为橘黄,在固体培养基中菌落形态为典型的“煎荷包蛋”样;PCR鉴定及测序结果显示,9株分离株与MS HN01株相似性为100%,表明分离株均为MS;vlhA基因分型序列结果显示,9株MS富含脯氨酸重复序列(PRR)区均为35个氨基酸,属于L型,核苷酸序列相似性为99.7%~100%,与中国其他地区L型菌株亲缘关系较近,与泰国L型菌株亲缘关系较远;MIC测定结果显示,9株MS对泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、恩诺沙星的MIC 50/90值分别为0.25/0.25、0.5/0.5、0.5/0.5、1/1、≤0.016/≤0.016、0.062/0.125、1/1、2/2、4/4和32/32μg/mL。【结论】本研究于冀南地区成功分离到9株L型MS,与国内其他地区MS差异较小、遗传进化相对稳定,治疗当地MS感染可选用泰妙菌素、沃尼妙林、泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素,其次为林可霉素、多西环素、土霉素。本研究结果可为当地防控MS感染提供科学依据。

关键词：滑液支原体分离鉴定 vlhA基因最小抑菌浓度

抗滑液支原体FolD单链抗体的制备及活性鉴定

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中国动物传染病学报 2023年

作者：何肖肖张立马海云赵云海王青岳亚辉邢小勇武小椿权国梅包世俊甘肃农业大学动物医学院

旨在制备抗滑液支原体(MS)FolD的小分子单链抗体(ScFv)，并对其活性进行鉴定。本研究从分泌抗FolD单克隆抗体杂交瘤细胞中提取总RNA，利用鼠源抗体前导肽和恒定区的通用引物，通过RT-PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，... 详细信息

旨在制备抗滑液支原体(MS)FolD的小分子单链抗体(ScFv)，并对其活性进行鉴定。本研究从分泌抗FolD单克隆抗体杂交瘤细胞中提取总RNA，利用鼠源抗体前导肽和恒定区的通用引物，通过RT-PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并利用短肽(Gly4Ser)3连接形成VH-linker-VL，将其插入到表达载体pBAD18-Cm中，转化至E.coli BL21(DE3)，经0.15%阿拉伯糖于16℃条件下诱导表达，并利用SDS-PAGE和Western blot分析表达结果，进而利用Western blot和间接ELISA检测ScFv的活性。结果显示，FolD单克隆抗体VH和VL基因大小分别为357 bp和333 bp，应用Linker拼接形成的VH-linker-VL基因大小为753 bp。SDS-PAGE和Western blot结果显示，ScFv在E.coli中以可溶性形式表达，其相对分子质量约为31 ku。Western blot和ELISA检测结果表明ScFv与抗原FolD有较好的结合活性。本研究成功获得了抗MS FolD的ScFv，为进一步优化ScFv的活性奠定了基础，也为后续研究MS快速检测方法提供生物学材料。

关键词：滑液支原体单链抗体原核表达活性鉴定