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滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

中草药 2017年第9期48卷 1839-1844页

作者：许燕赵爽董栩叶鑫云南中医学院药学院云南昆明650500

目的克隆滇重楼Paris polyphylla ***三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为c... 详细信息

目的克隆滇重楼Paris polyphylla ***三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。

关键词：滇重楼鲨烯环氧酶基因克隆原核表达荧光定量PCR

红外光谱结合化学计量学对不同采收期滇重楼的定性定量分析

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光谱学与光谱分析 2017年第6期37卷 1754-1758页

作者：吴喆张霁金航王元忠张金渝云南省农业科学院药用植物研究所云南昆明650200 云南省省级中药原材料质量监测技术服务中心云南昆明650200 云南中医学院中药学院云南昆明650500

傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和偏最小二乘回归(PLSR)对不同采收期滇重楼(Paris polyphylla ***)分别进行定性鉴别与定量分析,以期为滇重楼合理采收和鉴别评价提供科学依据。采集46份不同采收期滇重楼样品... 详细信息

傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和偏最小二乘回归(PLSR)对不同采收期滇重楼(Paris polyphylla ***)分别进行定性鉴别与定量分析,以期为滇重楼合理采收和鉴别评价提供科学依据。采集46份不同采收期滇重楼样品的红外光谱,对光谱数据进行自动基线校正+纵坐标归一化+自动平滑+小波去噪(WD)预处理后进行PLS-DA分析;采用超高效液相色谱测定样品中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的含量,将液相测定数据与红外光谱数据进行拟合,经自动基线校正+纵坐标归一化+自动平滑+一阶求导+正交信号校正(OSC)优化处理后,建立滇重楼中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的快速预测模型。结果显示,(1)原始红外光谱中主要吸收区域在950~700,1 200~950,1 800~1 500和2 800~3500cm-1附近。(2)PLS-DA得分图可准确区分不同采收期滇重楼样品。(3)液相数据显示重楼总皂苷含量随着年限的增加先成倍增加,再逐渐减少,最后呈现缓慢增加的趋势。(4)重楼总皂苷含量定量模型的预测值与真实值间无显著性差异,表明模型预测效果好。FTIR结合化学计量学可准确区分不同采收期滇重楼并快速预测其皂苷含量,为不同采收期滇重楼的鉴别和皂苷含量预测提供一种新方法,同时为确定滇重楼的最佳采收期提供参考依据。

关键词：红外光谱采收期滇重楼重楼皂苷 PLS-DA PLSR

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ICP-AES法测定滇重楼中的微量元素

光谱学与光谱分析 2009年第8期29卷 2247-2249页

作者：张金渝王元忠金航杨维泽云南大学生命科学学院生态遗传学实验室云南昆明650091 云南省农业科学院药用植物研究所云南昆明650223 中国农业科学院研究生院北京100081

探讨滇重楼中多种金属元素的测定方法,采用湿法硝酸-双氧水进行消解,用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)同时测定试样中钾、镁及多种微量元素铅、铜、铁、铬、锌和锰等的方法。其检出限为0.0013～0.0846μ***-1,变异系数为0.7%... 详细信息

探讨滇重楼中多种金属元素的测定方法,采用湿法硝酸-双氧水进行消解,用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)同时测定试样中钾、镁及多种微量元素铅、铜、铁、铬、锌和锰等的方法。其检出限为0.0013～0.0846μ***-1,变异系数为0.7%～4.6%,回收率在93.7%～108.2%,结果令人满意。发现中药滇重楼中含有比较丰富的铁元素,微量元素在中药中可能起到一定的药理作用,用ICP-AES测定中药微量元素以评价中药价值具有重要的意义。

关键词： ICP-AES 微量元素滇重楼硝酸-双氧水消解

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滇重楼灰霉病及其病原鉴定

中国中药杂志 2018年第14期43卷 2918-2927页

作者：马维思陈君严世武王馨董志渊李林玉杨丽英杨斌云南省农业科学院药用植物研究所云南昆明650205 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193

灰霉病是滇重楼的主要病害之一,常引起滇重楼花器腐烂而导致种子绝收,该研究通过田间病害调查,掌握了该病发生的基本情况,通过带病组织和菌核培养分离获得病原菌,并依据柯赫氏法则验证其致病性。结果表明,病原菌分生孢子梗葡萄状分枝,... 详细信息

灰霉病是滇重楼的主要病害之一,常引起滇重楼花器腐烂而导致种子绝收,该研究通过田间病害调查,掌握了该病发生的基本情况,通过带病组织和菌核培养分离获得病原菌,并依据柯赫氏法则验证其致病性。结果表明,病原菌分生孢子梗葡萄状分枝,分生孢子椭圆形,长9.70~13.70μm,平均（11.32±0.82）μm,宽（7.05~9.12）μm,平均（8.24±0.48）μm,精孢子球形,直径（3.34±0.31）μm,病原菌在发病植株及PDA培养基上均易产生黑色菌核,基于形态特征鉴定病原菌为一种葡萄孢属Botrytis真菌。基于病原菌RPB2,HSP60,G3PDH基因及其联合基因构建的系统发育树,支持该病原菌为葡萄孢属真菌一个新种,该菌最适培养温度为20℃,最适pH为8,持续光照会抑制病原菌生长。

关键词：滇重楼灰霉病病原鉴定葡萄孢

滇重楼药材的研究进展及其质量标志物(Q-Marker)预测分析

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中草药 2023年第9期54卷 3032-3048页

作者：李早慧都晓伟黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040

对滇重楼Paris polyphylla ***化学成分、药理作用、毒性评价及构效关系进行系统综述,依据中药质量标志物(quality marker,Q-Marker)理论,结合滇重楼中化学成分与其功效主治、药性、可测性、质量传递与溯源等方面的关联性分析滇重楼潜在... 详细信息

对滇重楼Paris polyphylla ***化学成分、药理作用、毒性评价及构效关系进行系统综述,依据中药质量标志物(quality marker,Q-Marker)理论,结合滇重楼中化学成分与其功效主治、药性、可测性、质量传递与溯源等方面的关联性分析滇重楼潜在的Q-Marker。在功效与滇重楼中化学成分关联中发现,滇重楼作用于肝、肾、肺、血、胎盘等组织,干预癌症、高血压、癫痫、肝损伤、关节炎等疾病;结合中药Q-Marker理论指导原则,揭示了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、H,纤细薯蓣皂苷,蜕皮激素、多糖、黄酮等可作为滇重楼功效相关的Q-Marker,为制定更加科学全面的滇重楼质量控制标准和临床合理应用提供理论依据。

关键词：滇重楼质量标志物毒性评价构效关系重楼皂苷纤细薯蓣皂苷蜕皮激素多糖黄酮

滇重楼花药开闭运动的影响因子及细胞形态学调控机制探讨

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中国中药杂志 2017年第10期42卷 1860-1864页

作者：王艳芳李戈唐玲杨春勇李荣英中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所云南分所云南景洪666100

为了研究滇重楼花药开闭运动的影响因子及细胞形态学调控机制,观察花药开闭运动现象与对应生态因子变化,设计不同光照、温度、湿度试验和人工淋雨试验,观察各因子对花药开闭运动的影响,制作石蜡切片,观察花药开闭运动时细胞形态变化。... 详细信息

为了研究滇重楼花药开闭运动的影响因子及细胞形态学调控机制,观察花药开闭运动现象与对应生态因子变化,设计不同光照、温度、湿度试验和人工淋雨试验,观察各因子对花药开闭运动的影响,制作石蜡切片,观察花药开闭运动时细胞形态变化。结果表明花药早开晚闭运动由外界生态因子调节,总体趋势是高温、强光、低湿利于花药开裂,低温、弱光、高湿利于花药闭合。该实验中,各生态因子对花药开裂的影响从大到小依次为湿度、温度、光照,各生态因子对花药闭合的影响从大到小依次为光照、湿度、温度,雨天雨滴的直接接触导致花药的快速闭合。从其细胞形态结构变化看,花药早开晚闭运动就是一个花粉囊壁细胞失水开裂和吸水闭合的过程,推测不同光照、温度和湿度条件引发了细胞内不同的生理活动,导致细胞渗透压变化,进而导致花药开裂或闭合。而花药遇雨闭合是一个简单的物理调节过程,雨点落在花药上,直接浸泡花药,导致花药细胞渗透压变化吸水闭合。

关键词：滇重楼花药开闭运动生态因子细胞形态学调控机制

滇重楼内生真菌米曲霉中1个新的聚酮类化合物

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中草药 2020年第17期51卷 4393-4396页

作者：侯雨婷于红梅陈彦君祝丽君陈毅坚郑朝胚周敏董淼叶艳青云南民族大学化学与环境学院云南民族大学民族药资源化学国家民委教育部重点实验室云南昆明650500

目的研究滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae次生代谢产物的化学成分,以期发现新的化合物。方法采用液体发酵方式发酵,萃取后运用硅胶及大孔吸附树脂等多种色谱技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果... 详细信息

目的研究滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae次生代谢产物的化学成分,以期发现新的化合物。方法采用液体发酵方式发酵,萃取后运用硅胶及大孔吸附树脂等多种色谱技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从滇重楼内生真菌米曲霉发酵产物中分离鉴定了3个化合物,分别鉴定为3-氨基-4,5-二羟基-4,6-二甲基-2-(2-甲基丁酰)环己-2-烯酮(1)、12-N-甲基-环-(L-色氨酰-L-苯丙氨酰)(2)和二聚色氨酸素(3)。结论化合物1为新的聚酮类化合物,命名为米曲霉聚酮A。

关键词：滇重楼内生真菌米曲霉次生代谢产物聚酮类米曲霉聚酮A

滇重楼甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的分子克隆与分析

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中草药 2019年第6期50卷 1435-1441页

作者：杨莉樊小莉刘琴王芳刘静徐智斌冯波周强王涛中国科学院成都生物研究所四川成都610041 中国科学院大学北京100049

目的皂苷是滇重楼的主要药效成分,获取滇重楼皂苷合成途径中关键基因(MVD)的cDNA全长序列,并对该序列进行生物信息学及表达量分析。方法通过同源克隆法得到滇重楼MVD cDNA的保守片段,利用RACE技术获得MVD c DNA全长序列,命名为PpMVD,并... 详细信息

目的皂苷是滇重楼的主要药效成分,获取滇重楼皂苷合成途径中关键基因(MVD)的cDNA全长序列,并对该序列进行生物信息学及表达量分析。方法通过同源克隆法得到滇重楼MVD cDNA的保守片段,利用RACE技术获得MVD c DNA全长序列,命名为PpMVD,并进行生物信息学分析,通过实时荧光定量(RT-PCR)法检测PpMVD在滇重楼不同组织中的表达情况。结果 PpMVD基因cDNA全长1 583 bp,开放阅读框(ORF)长1 269 bp,编码422个氨基酸,该蛋白质的相对分子质量为46 820,等电点为5.69,不稳定指数为45.40;滇重楼Pp MVD蛋白质二级结构中含有159个α-螺旋,占37.68%;19个β折叠,占4.50%;69个延伸链,占16.35%;175个无规卷曲,占41.47%;该蛋白没有跨膜螺旋区,且不存在信号肽,其全部氨基酸都位于细胞膜表面;该基因包含MVD1-Superfamily家族的保守结构域,属于GHMP激酶蛋白家族成员;RT-PCR结果显示,滇重楼PpMVD基因在种子、叶片、茎和块茎中均有表达,但表达量呈显著差异(P>0.05),由高到低依次为块茎>叶片>种子>茎,其中主要药用组织块茎中表达量最高,为最低表达量(茎)的3.3倍。结论首次克隆了滇重楼Pp MVD cDNA全长序列,并检测了该基因在滇重楼各组织中的表达量,为进一步研究Pp MVD基因在提高皂苷生物合成过程中的影响提供了基础,并对重楼药用资源的可持续利用提供了支持。

关键词：滇重楼 Pp MVD 基因克隆表达分析 RACE RT-PCR

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滇重楼内生真菌分离与多样性研究

中国中药杂志 2013年第22期38卷 3838-3844页

作者：王茜申仕康张爱丽吴春妍吴富勤张新军王跃华云南大学生命科学学院云南昆明650091

通过研究滇重楼内生真菌菌群的多样性,为探讨内生真菌作为生物活性物质的价值提供科学依据。该文通过对云南省嵩明县、鹤庆县、保山市野生滇重楼植株的采集,从其根、块茎、叶中分离内生真菌,并基于ITS序列分析和形态学方法进行分类鉴定... 详细信息

通过研究滇重楼内生真菌菌群的多样性,为探讨内生真菌作为生物活性物质的价值提供科学依据。该文通过对云南省嵩明县、鹤庆县、保山市野生滇重楼植株的采集,从其根、块茎、叶中分离内生真菌,并基于ITS序列分析和形态学方法进行分类鉴定。试验分离得到内生真菌749株,分别归属于41个属,其中3个属仅在根部出现,12个属仅在块茎出现,8个属仅在叶部出现。各个样地分离出的内生真菌表现出一定的差异,其中鹤庆样地块茎部位分离的内生真菌多样性最高,各样地间,各部位间的内生真菌组成相似性系数低。研究认为,不同样地、不同部位的滇重楼内生真菌的差异性可能与生境以及各部位结构、成分等因素有关。

关键词：滇重楼内生真菌分离鉴定多样性