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microRNA98靶向N-RAS调控涎腺腺样囊性癌恶性生物学行为的研究

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microRNA98靶向N-RAS调控涎腺腺样囊性癌恶性生物学行为的研究

作者：刘晓楠天津医科大学

学位级别：硕士

目的探讨miR-98在涎腺腺样囊性癌组织和癌旁组织、高/低转移细胞系中的表达差异及其对腺样囊性癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,通过生物信息学软件寻找mi R-98的潜在靶基因并初步探讨miR-98参与调控涎腺腺样囊性癌的作用机理。方法1、miR... 详细信息

目的探讨miR-98在涎腺腺样囊性癌组织和癌旁组织、高/低转移细胞系中的表达差异及其对腺样囊性癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,通过生物信息学软件寻找mi R-98的潜在靶基因并初步探讨miR-98参与调控涎腺腺样囊性癌的作用机理。方法1、miR-98在涎腺腺样囊性癌中的表达及其对涎腺腺样囊性癌细胞恶性生物学行为的影响:通过real-time PCR检测3例新鲜涎腺腺样囊性癌组织以及癌旁正常组织、高转移细胞系ACC-M以及低转移细胞系SACC-83中miR-98的表达水平。采用lipofectamine2000介导转染mi R-98mimics使miR-98过表达,并通过RT-PCR验证。通过MTT实验检测细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的变化,划痕实验、趋化运动实验检测迁移能力变化,Transwell检测侵袭能力变化,Western blotting检测迁移相关蛋白的表达变化。2、miR-98靶向N-RAS通过RAS信号通路调控涎腺腺样囊性癌的作用机理:采用生物信息学软件TargetScan、PicTar、miRbase等对miR-98潜在的靶基因结合位点进行分析,发现N-RAS基因mRNA的3,非翻译区中多个软件预测的共同结合位点区域。构建包含结合位点的野生型荧光素酶报告基因载体WT-NRAS-PGL3-control及突变型的荧光素酶报告基因载体MUT-NRAS-PGL3-control。双荧光素酶报告基因实验验证N-RAS是mi R-98的靶基因。miR-98mimics转染细胞调高mi R-98的表达水平后,Western blotting以及免疫荧光技术检测N-RAS的表达变化,Western blotting检测N-RAS蛋白的表达变化以及下游MAPK/ERK信号通路中ERK、p-ERK和PI3K/AKT信号通路中AKT、p-AKT的表达变化。收集我院涎腺腺样囊性癌石蜡标本43例及临床病理资料,免疫组织化学检测涎腺腺样囊性癌石蜡标本中N-RAS的表达情况,并与临床病理因素行相关性分析。结果1、miR-98在涎腺腺样囊性癌组织和高转移细胞系中的表达水平显著低于癌旁正常组织和低转移细胞系SACC-83,差异具有统计学意义。以ACC-M作为细胞模型,转染miR-98 mimics调高miR-98的表达水平;MTT结果显示miR-98过表达后,细胞的增殖能力受到抑制;平板克隆实验结果显示细胞的克隆形成率下降;流式细胞术提示S期的细胞明显减少,而G0/G1期的细胞明显增多,表明细胞被阻滞在G0/G1期向S期的转化进程中;划痕闭合延迟、趋化实验穿膜细胞数减少,细胞的迁移能力下降;Transwell小室穿过基质的细胞数减少,细胞的侵袭能力下降;Western blotting检测迁移相关蛋白,E-cadherin的表达上调,N-cadherin、Vimentin的表达下调。2、生物信息学软件TargetScan、PicTar、miRbase分析结果显示N-RAS是miR-98的靶基因之一,3个靶基因数据库的预测结果显示的其结合位点均含有位于N-RAS基因3,端的186-192的碱基序列。miR-98 mimics转染后48h,RT-PCR验证miR-98在转染组中的表达水平上调;Western blotting结果显示miR-98过表达后N-RAS蛋白的表达水平下降;免疫荧光结果显示N-RAS的表达定位于细胞浆,miR-98过表达后胞浆的荧光信号减弱。双荧光素酶报告基因检测发现miR-98能够显著抑制野生型报告基因载体WT-NRAS-PGL3-control的荧光素酶活性,而对突变型报告基因载体MUT-NRAS-PGL3-control的荧光素酶活性没有影响。miR-98 mimics转染后48h,提取总蛋白,Western blotting结果显示miR-98过表达后MAPK/ERK信号通路中ERK蛋白的表达水平不变,而p-ERK蛋白的表达水平下调;PI3K/AKT信号通路中AKT蛋白的表达水平不变,而p-AKT蛋白的表达水平下调。N-RAS在涎腺腺样囊性癌组织中主要在胞浆中呈阳性表达,其阳性表达率为83.7%(36/43),N-RAS的表达水平与临床分期、肿瘤大小相关(P涎腺腺样囊性癌中呈低表达状态。miR-98通过阻滞细胞周期中G0/G1期向S期的转化进程,抑制涎腺腺样囊性癌细胞的增殖能力,并且抑制ACC-M细胞的迁移和侵袭能力。2、N-RAS是mi R-98的靶基因,其过表达与涎腺腺样囊性癌的临床分期及肿瘤大小相关。miR-98通过调控N-RAS下游的MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路影响腺样囊性癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。

关键词：涎腺腺样囊性癌 miR-98 N-RAS 迁移侵袭

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M期促进因子在涎腺腺样囊性癌中的表达

M期促进因子在涎腺腺样囊性癌中的表达

作者：戚忠政中国医科大学

学位级别：硕士

前言腺样囊性癌是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一,在涎腺恶性肿瘤中居第二位。它的生物学特性为生长较缓慢,但侵袭性强,常沿神经、血管生长,易复发和转移。目前有关涎腺腺样囊性癌的增殖、分化、侵袭和转移等生物学机制尚不十分清楚。 ... 详细信息

前言腺样囊性癌是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一,在涎腺恶性肿瘤中居第二位。它的生物学特性为生长较缓慢,但侵袭性强,常沿神经、血管生长,易复发和转移。目前有关涎腺腺样囊性癌的增殖、分化、侵袭和转移等生物学机制尚不十分清楚。 M期促进因子(M-phase promoting factor,MPF)是调节细胞进出M期所必需的蛋白激酶,具有广泛的生物功能,是细胞周期变化的一个关键物质。MPF由两个亚基构成,其一是作为调节亚基的周期蛋白B(CyclinB),另一亚基为催化亚基P34。MPF作为M期的调节因素,近年来关于其在肿瘤方面的研究越来越多,有研究显示MPF在癌细胞系和原发性肿瘤中呈过度表达。本实验应用免疫组织化学和Western blot对MPF在涎腺腺样囊性癌中的表达进行研究,探讨MPF与涎腺腺样囊性癌发生和发展的关系。材料及方法 1.标本来源:收集涎腺腺样囊性癌蜡块标本40例,正常涎腺组织蜡块标本40例。全部标本均取自中国医科大学附属第一医院病理室,经基础医学院病理教研室两位教授确诊病理分型,涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83和肺高转移细胞系SACC-LM均由北京大学口腔医学院获得。 2.主要试剂:RPMI-1640培养基(Gibco公司)、胰蛋白酶(华美生物工程公司)、[γ-P]ATP、胎牛血清(天津生化制品厂)、HRP-马抗鼠IgG(二抗)、硝酸纤维素膜、丙烯酰胺(Arcylamide)、N,N甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟基氨基甲烷(Tris-base)、CyclinB单克隆抗体和p34单克隆抗体(北京中山公司)、SP试剂盒(福州迈新)等。 3.实验方法:本实验应用免疫组织化学和Western blot,对MPF在涎腺

关键词： M期促进因子涎腺腺样囊性癌免疫组织化学 Western blot

芳香化酶抑制剂对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞影响的实验研究

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芳香化酶抑制剂对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞影响的实验研究

作者：施延安昆明医科大学

学位级别：硕士

目的：利用转基因技术构建腺样囊性癌细胞株ACC-83-CYP19,观测芳香化酶抑制剂对转基因涎腺腺样囊性癌ACC-83-CYP19细胞的影响,为临床内分泌法治疗涎腺涎腺腺样囊性癌提供科学理论依据。材料与方法：1、免疫细胞化学方法分别检测ACC-83、... 详细信息

目的：利用转基因技术构建腺样囊性癌细胞株ACC-83-CYP19,观测芳香化酶抑制剂对转基因涎腺腺样囊性癌ACC-83-CYP19细胞的影响,为临床内分泌法治疗涎腺涎腺腺样囊性癌提供科学理论依据。材料与方法：1、免疫细胞化学方法分别检测ACC-83、ACC-LM、ACC-2细胞系中芳香化酶的表达情况。2、利用基因转染技术构建重组ACC-83-CYP19细胞,通过Western blot检测芳香化酶表达情况。3、利用不同浓度芳香化酶抑制剂对ACC-83细胞和重组ACC-83-CYP19细胞进行处理,MTT和流式细胞术分别检测ACC-83细胞和重组ACC-83-CYP19细胞的增殖和凋亡情况,Western blot检测实验组与对照组芳香化酶表达的变化情况。空白对照组添加溶媒DMSO,不添加药物。结果：1、免疫细胞化学分别检测ACC-2、ACC-LM、ACC-83细胞株,结果显示ACC-2、ACC-LM、ACC-83细胞的胞浆内存在芳香化酶P450的表达。2、抗生素G418筛选ACC-83-CYP19细胞后,通过Western blot检测芳香化酶表达,ACC-83-CYP19细胞的芳香化酶P450的表达高于未转染的ACC-83细胞。3、通过MTT检测,结果显示在25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L的来曲唑药物浓度作用下,ACC-83-CYP19细胞抑制率分别为62.93%、74.82%、82.50%、85.51%、ACC-83细胞的抑制率分别为65.27%、69.71%、70.59%、67.43%,差异具有统计学意义;芳香化酶抑制剂对涎腺腺样囊性癌细胞具有抑制细胞生长作用。4、流式细胞术检测ACC-83和ACC-83-CYP19细胞的凋亡情况,结果显示来曲唑对ACC-83和ACC-83-CYP19细胞有促进细胞凋亡的作用,细胞凋亡率随着药物浓度增大而增大。5、来曲唑可降低ACC-83-CYP19和ACC-83细胞中芳香化酶的表达。结论：1、涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-83, ACC-LM,ACC-2中存在芳香化酶的阳性表达,腺样囊性癌的发生可能与芳香化酶的异常表达有关。2、来曲唑对ACC-83和ACC-83-CYP19细胞促进凋亡作用有促进凋亡,抑制增殖作用。

关键词：涎腺腺样囊性癌 CYP19 芳香化酶抑制剂来曲唑

涎腺腺样囊性癌中RUNX3的表达、甲基化状态及其临床意义

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浙江医学 2010年第12期32卷 1763-1766页

作者：郑传铭葛明华凌志强谭卓徐家杰陈超浙江省肿瘤医院头颈外科杭州310022 浙江省肿瘤医院肿瘤研究所杭州310022

目的探讨RUNX3基因的异常表达与人涎腺腺样囊性癌发生、发展的关系.方法以定量甲基化特异性PCR（qM-SP）法检测41例涎腺腺样囊性癌及其相应的正常涎腺组织中RUNX3基因的甲基化状态,并比较RUNX3基因启动子甲基化与腺样囊性癌临床病理... 详细信息

目的探讨RUNX3基因的异常表达与人涎腺腺样囊性癌发生、发展的关系.方法以定量甲基化特异性PCR（qM-SP）法检测41例涎腺腺样囊性癌及其相应的正常涎腺组织中RUNX3基因的甲基化状态,并比较RUNX3基因启动子甲基化与腺样囊性癌临床病理因素之间的相关性.同时用Western blot法检测其中19例腺样囊性癌及其匹配的正常涎腺组织中RUNX3蛋白的表达,以分析RUNX3基因启动子甲基化对蛋白表达的影响.结果实时定量qMSP结果显示腺样囊性癌及其相应正常涎腺组织中其RUNX3基因甲基化阳性率分别为（48.81±5.81）%和（27.98±3.84）%,两者存在显著差异（P＜0.001）.Western blot结果显示腺样囊性癌中RUNX3蛋白的表达量显著低于匹配的正常涎腺组织中的表达（P＜0.001）,提示RUNX3基因甲基化是引起RUNX3蛋白表达下调的原因之一,也与肿瘤的发生相关.结论 RUNX3基因启动子5＇-CpG岛高甲基化在人涎腺腺样囊性癌中是一高频分子事件,与该基因的表达缺失显著相关,是RUNX3基因表达缺失的主要机制之一.RUNX3基因甲基化与腺样囊性癌的发生存在密切联系.

关键词：涎腺腺样囊性癌 RUNX3 甲基化甲基化特异性PCR Western blot

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涎腺腺样囊性癌二例

浙江大学学报（医学版） 1998年第1期27卷 46-46,45页

作者：金秀梅陈关福浙江医科大学附属第二医院口腔颌面外科

例1，男，52岁。逐渐张口受限3年余．右耳听力下降3个月。发病前有左下牙疼痛，继而出现面颊部肿胀和张口受限，经抗炎治疗症状有所好转。3年来症状反复发作。近3个月来左耳听力下降，眶下区麻木，牙关紧闭，进食困难。诊断为“假性颞... 详细信息

例1，男，52岁。逐渐张口受限3年余．右耳听力下降3个月。发病前有左下牙疼痛，继而出现面颊部肿胀和张口受限，经抗炎治疗症状有所好转。3年来症状反复发作。近3个月来左耳听力下降，眶下区麻木，牙关紧闭，进食困难。诊断为“假性颞颌关节强直”入院。体检：全身检查无异常发现。专科检查：面部对称，张口0．5cm，左侧翼颌韧带处扪及条状瘢痕样组织，粘膜表面无溃疡，周界不清。X线片显示：左侧蝶骨翼突骨质破坏吸收，骨结构模糊，并在相应部位可见软组织肿胀阴影。局部切取组织作活检，病理诊断为左侧翼颌韧带区腺样囊性癌。

关键词：左侧听力下降张口受限涎腺腺样囊性癌韧带诊断反复发作专科对称局部

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涎腺腺样囊性癌血道转移的临床分析

临床肿瘤学杂志 2000年第2期5卷 103-105页

作者：孟昭业寿柏泉杨震张森林许建辉南京军区南京总医院口腔科南京210002

目的:探讨腺样囊性癌血道转移问题,期望在临床上对此类病例的治疗引起重视。方法:对6例腺样囊性癌血道转移的病人进行回顾性分析。结果:腺样囊性癌因其生物性特征,术后容易发生局部复发和血道转移。结论:对此类病例强调首期完成根治性... 详细信息

目的:探讨腺样囊性癌血道转移问题,期望在临床上对此类病例的治疗引起重视。方法:对6例腺样囊性癌血道转移的病人进行回顾性分析。结果:腺样囊性癌因其生物性特征,术后容易发生局部复发和血道转移。结论:对此类病例强调首期完成根治性手术和进行综合治疗,密切随访,及时发现和治疗转移灶。

关键词：涎腺腺样囊性癌血道转移综合治疗

涎腺腺样囊性癌氩离子激光流式细胞术分析及其临床意义

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中国激光医学杂志 1996年第2期5卷 93-97页

作者：赵福运景捷魏明洁方真章禾李军北京医科大学口腔医学院宁夏医学院附院解放军海军总医院

为探讨流式细胞术对涎腺腺样囊性癌的诊断和预后估计的价值，对４１例腺样囊性癌行流式细胞术分析。结果，平均ＤＮＡ指数为１．１７９，Ｓ期细胞比例为２９．４９％，细胞增殖指数为４２．６７％，均明显高于正常组织。异倍体检出率为... 详细信息

为探讨流式细胞术对涎腺腺样囊性癌的诊断和预后估计的价值，对４１例腺样囊性癌行流式细胞术分析。结果，平均ＤＮＡ指数为１．１７９，Ｓ期细胞比例为２９．４９％，细胞增殖指数为４２．６７％，均明显高于正常组织。异倍体检出率为７０．７３％。随着肿瘤的增大和恶性程度的增加，其异倍体率、ＤＮＡ指数和Ｓ期细胞比例值也相应增加。流式细胞术为涎腺腺样囊性癌的病理诊断和确定恶性程度提供了有效的辅助诊断措施，但尚不能判断预后。

关键词：涎腺腺样囊性癌 DNA含量流式细胞术

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涎腺腺样囊性癌34例临床病理分析

西北国防医学杂志 2007年第6期28卷 446-447页

作者：贾江刘兰忠钱震刘冠花兰州军区兰州总医院口腔科甘肃兰州730050

1990-2004年间,收集我科采用手术治疗且全部病例资料完整的涎腺腺样囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)34例,回顾分析SACC的临床及病理特征.

关键词：涎腺腺样囊性癌病理分析

涎腺腺样囊性癌COX-2表达与肿瘤血管生成的研究

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临床口腔医学杂志 2011年第2期27卷 67-70页

作者：李晓光袁丽丽肖长杰王延秀泰安市中心医院口腔科山东泰安271000 泰安市中心医院麻醉科山东泰安271000

目的:探讨环氧化酶-2(Cycloxygenase-2,COX-2)表达与涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcino-ma,SACC)血管生成的关系。方法:免疫组化法检测SACC中COX-2、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,并测定肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:SACC中COX-2表达与VEGF、iNOS表达密切相关(P<0.05,P<0.01)。SACC中COX-2表达阳性组和阴性组MVD有显著差异(P<0.01).结论:SACC中COX-2表达和肿瘤血管生成有关,iNOS和VEGF可能参与COX-2对肿瘤血管生成的促进作用。

关键词：涎腺腺样囊性癌环氧化酶血管生成血管内皮生长因子诱导型一氧化氮合酶