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ID1在涎腺腺样囊性癌发生发展中的作用及功能

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ID1在涎腺腺样囊性癌发生发展中的作用及功能

作者：胡小梦福建医科大学

学位级别：硕士

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是口腔颌面部常见的唾液腺恶性肿瘤之一,它浸润性极强,术后易复发,是头颈部最具破坏性和不可预见性的肿瘤[1]。因而寻找有效的治疗靶标对于改善涎腺腺样囊性癌的治疗及预后至关重要。DNA结合... 详细信息

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是口腔颌面部常见的唾液腺恶性肿瘤之一,它浸润性极强,术后易复发,是头颈部最具破坏性和不可预见性的肿瘤[1]。因而寻找有效的治疗靶标对于改善涎腺腺样囊性癌的治疗及预后至关重要。DNA结合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1,ID1),该基因可编码螺旋-环-螺旋蛋白(HLH),HLH蛋白可抑制DNA结合及转录激活能力,在细胞生长、衰老和分化等生物学过程中发挥重要作用。研究表明,在多种肿瘤中都有发现ID1基因的异常表达,ID1发挥着类似于癌基因的作用,参与了肿瘤的生长、分化、侵袭及转移。本课题通过基因测序和生物学信息分析发现涎腺腺样囊性癌的差异表达基因ID1,进而研究ID1在涎腺腺样囊性癌发生发展中的作用及功能。研究分为两个部分,分述如下:一、涎腺腺样囊性癌差异表达基因筛选及其临床意义目的:筛选涎腺腺样囊性癌中差异表达基因并分析其临床意义。方法:对涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞(SACC-M、SACC-2)提取细胞总RNA,送至苏州众信生物有限公司采用第二代基因测序技术进行RNA测序,对测序结果进行生物学信息分析,筛选SACC细胞的差异表达基因。采用实时荧光定量PCR检测ID1在SACC细胞中的表达量,验证测序结果。通过收集68例涎腺腺样囊性癌组织和50例对应的癌旁正常组织标本,采用免疫组化染色实验研究ID1在涎腺腺样囊性癌临床样本中的表达情况。结果:基因测序结果显示ID1在SACC-M细胞中的表达明显高于SACC-2。GO富集分析显示SACC-M相对SACC-2表达上调的基因大部分都是和细胞移动黏附能力相关的基因,包括基因ID1。实时荧光定量PCR结果显示ID1在SACC-M中的表达明显高于SACC-2。免疫组化染色实验结果显示ID1在涎腺腺样囊性癌组织样本中的表达明显高于癌旁正常组织的样本。结论:ID1在涎腺腺样囊性癌中特异性高表达,且与涎腺腺样囊性癌的高转移有关。二、ID1对涎腺腺样囊性癌细胞生物学行为的影响目的:研究ID1对涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法:Real-time PCR检测si RNA转染SACC-M细胞后ID1的表达情况。采用CCK-8法、平板克隆形成实验研究ID1表达被抑制后SACC-M细胞增殖能力的变化。分别使用Transwell细胞迁移及侵袭实验研究ID1表达下调后SACC-M细胞迁移及侵袭能力的变化。结果:Real-time PCR结果显示si RNA干扰后ID1在SACC-M中的表达量下降。CCK-8实验结果表明si RNA干扰组SACC-M细胞增殖能力明显弱于阴性对照组。平板克隆形成实验结果显示si RNA干扰ID1的表达后,SACC-M细胞增殖能力随之下降。Transwell细胞迁移及侵袭实验研究结果表明,ID1表达下调后,SACC-M细胞的迁移、侵袭能力也随之下降。结论:ID1对涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-M)的增殖、侵袭及迁移起促进作用。

关键词：涎腺腺样囊性癌 ID1 实时荧光定量PCR si RNA

滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞增殖抑制及其机制的研究

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滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞增殖抑制及其机制的研究

作者：何秋敏昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]探讨滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞的增殖抑制作用及其相关机制,为滇重楼治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。[方法]1、MTT法检测涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞生长活性,测定细胞生长曲线,选取合适细胞种板密度。实验用药分... 详细信息

[目的]探讨滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞的增殖抑制作用及其相关机制,为滇重楼治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。[方法]1、MTT法检测涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞生长活性,测定细胞生长曲线,选取合适细胞种板密度。实验用药分别是从植物的叶、根提取精制物以及根茎、须根提取而得,通过MTT法筛选出最有药用价值的提取物。2、通过体外细胞培养,采用CCK-8法检测不同药物质量浓度(5、10、20、40、60、80、100)μg·mL-1的滇重楼总皂苷对ACC-83细胞的增殖抑制效应,计算其IC50。3、实验随机分为四组,分别为低、中、高药物质量浓度组以及阴性对照组,各实验组经过药物作用24小时后,采用AnnexinV-FITC/PI标记,流式细胞仪检测各实验组及阴性对照组的细胞凋亡率,4、采用Western blot检测巨噬细胞移动抑制因子MIF和CD74蛋白表达量。5、逆转录聚合酶链反应法RT-PCR检测巨噬细胞移动抑制因子MIF和CD74 mRNA表达量。6、免疫细胞化学法检测MIF、CD74、Ki-67在ACC-83细胞中表达。7、SPSS22.0统计软件对数据进行统计学分析。[结果]1、倒置显微镜观察细胞形态发现,ACC-83细胞贴壁生长良好,均匀分布,形状呈多边形、大小不一。测定细胞生长曲线发现细胞种板密度为3～4×104mL-1时,细胞生长活性较好。滇重楼四种药物均有不同程度的抑制细胞生长的作用,重楼植物根的提取精制物对ACC-83细胞较为敏感,抑制率达97.34%,故本实验后期设计中将选用重楼植物根的提取精制物。2、CCK-8法检测细胞增殖抑制率表明:不同药物质量浓度滇重楼对ACC-83细胞生长均有不同程度的抑制作用,且存在剂量-效应关系,各组之间细胞增殖抑制率比较,低药物浓度组未见明显统计学差异。计算其IC50值为37.956μg·mL-1,因此后续实验组设置为低、中、高三个组,其药物质量浓度分别是(25、50、100)μg·mL-1。3、流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示:各实验组细胞均发生不同程度的凋亡,药物低、中、高质量浓度组的凋亡率分别为3.29±1.18%、60.23±4.26%和81.51± 5.11%,阴性对照组为2.60±0.57%。各实验组之间凋亡率与阴性对照组凋亡率相比,低药物浓度组的凋亡率无明显差异,中、高药物浓度组凋亡率的差异有显著性(P涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞中有MIF、CD74、Ki-67的表达,免疫细胞化学法检测见MIF、CD74主要定位在细胞质中,胞核也有少量表达,;Ki-67主要定位在细胞核中,胞浆也有少量表达。[结论]滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞的生长有明显的抑制作用,抑制MIF及CD74的表达,诱导细胞凋亡。滇重楼总皂苷抑制涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞增殖和促凋亡作用可能与抑制MIF、CD74的表达有关。

关键词：滇重楼总皂苷涎腺腺样囊性癌巨噬细胞移动抑制因子

Sox2对涎腺腺样囊性癌生长和侵袭影响的体外研究

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Sox2对涎腺腺样囊性癌生长和侵袭影响的体外研究

作者：魏卓川北医学院

学位级别：硕士

目的:1探讨沉默Sox2基因对涎腺腺样囊性癌细胞增殖、凋亡、转移和侵袭等生物学行为的影响。2探讨涎腺腺样囊性癌中Sox2和Survivin表达量之间的关系。方法:1构建Sox2 RNA干扰慢病毒载体并将病毒转染成功后,以SACC-LM为阳性对照组,SACC-LM... 详细信息

目的:1探讨沉默Sox2基因对涎腺腺样囊性癌细胞增殖、凋亡、转移和侵袭等生物学行为的影响。2探讨涎腺腺样囊性癌中Sox2和Survivin表达量之间的关系。方法:1构建Sox2 RNA干扰慢病毒载体并将病毒转染成功后,以SACC-LM为阳性对照组,SACC-LM-sh-NC-376为阴性对照组,SACC-LM-sh-Sox2为实验组。应用荧光定量PCR和Western blot检测Sox2基因沉默效果及Survivin的表达变化,流式细胞术检测细胞凋亡能力,CCK-8法检测细胞增殖能力,细胞划痕愈合实验和Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力,Westernblot检测Survivin、MAP4K4、MMP-2及上皮间充质相关的N-cadherin、E-cadherin的蛋白表达。2构建Survivin RNA干扰慢病毒载体并将病毒转染成功后,以SACC-LM为阳性对照组,SACC-LM-sh-NC-376为阴性对照组,SACC-LM-sh-Survivin为实验组。应用荧光定量PCR和Western blot检测Survivin基因沉默效果及Sox2的表达变化以分析二者的相关性。结果:1 成功构建抑制 Sox2、Survivin 基因表达的FVO55-ShRNA-Sox2、FVO55-ShRNA-Survivin 重组慢病毒载体,实验组Sox2以及Survivin的mRNA和蛋白表达量均明显下调,与两个对照组相比,差异均具有统计学意义(P涎腺腺样囊性癌高转移细胞株SACC-LM中,采用ShRNA干扰技术靶向沉默Sox2基因的表达能够增加细胞的凋亡能力,抑制细胞的迁移和侵袭能力;2沉默Sox2的表达可以改变EMT相关标志性蛋白和MMP-2的表达水平,推测Sox2可能参与了 SACC的上皮间充质转化过程;3 Sox2和Survivin在基因和蛋白表达上显著相关,Sox2正向调节Survivin的表达,推测在SACC中,Sox2可能是Survivin的上游调控基因。

关键词：涎腺腺样囊性癌 RNA干扰 Sox2 survivin 凋亡侵袭迁移

沉默HIF-1α对人涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞生长、侵袭及血管形成的影响

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沉默HIF-1α对人涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞生长、侵袭及血管形成...

作者：肖楚南昌大学

学位级别：硕士

目的:探讨人涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞在常氧和低氧环境中缺氧诱导因子HIF-1α表达及细胞生物学行为的变化,沉默HIF-1α对低氧环境中的SACC-83细胞生长、迁移和侵袭能力的影响及对血管生成的影响和机制。方法:1、shRNA-HIF-1α质粒转染... 详细信息

目的:探讨人涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞在常氧和低氧环境中缺氧诱导因子HIF-1α表达及细胞生物学行为的变化,沉默HIF-1α对低氧环境中的SACC-83细胞生长、迁移和侵袭能力的影响及对血管生成的影响和机制。方法:1、shRNA-HIF-1α质粒转染SACC-83细胞,经G418筛选和挑取阳性集落细胞扩增培养,Western blot鉴定沉默效率。2、Western blot、双抗体夹心ELISA法检测SACC-83细胞在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)环境中HIF-1α、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达水平的差异及血管内皮生长因子(VEGF)的分泌情况;沉默HIF-1α对低氧(5%O2)环境中SACC-83细胞MMP-2蛋白表达及VEGF分泌的影响。3、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外三维培养法分析常氧(21%O2)和低氧(5%O2)环境中培养的SACC-83细胞分泌物促血管形成能力的差别以及沉默HIF-1α对低氧(5%O2)环境中SACC-83细胞分泌物促血管形成能力的影响。4、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验观察SACC-83细胞在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)环境中的迁移、侵袭能力以及沉默HIF-1α对低氧(5%O2)环境中SACC-83细胞的迁移、侵袭能力的影响。5、MTT比色法、流式细胞分析法检测SACC-83细胞在常氧(21%O2)和低氧(5%O2)环境中增殖、凋亡和细胞周期的变化情况以及沉默HIF-1α对低氧(5%O2)环境中SACC-83细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:1、成功构建HIF-1α低表达的稳定细胞株(SACC-83/shHIF-1α)。2、Western blot和ELISA结果显示,SACC-83细胞在低氧环境下HIF-1α、MMP-2蛋白表达水平及培养上清VEGF分泌明显增加(P0.05)。3、在低氧环境中,SACC-83/shHIF-1α细胞MMP-2蛋白、培养上清中VEGF蛋白含量均降低(P0.05)。结论:低氧环境促进SACC-83细胞中HIF-1α、MMP-2蛋白过表达,VEGF分泌增多,并且细胞侵袭、迁移能力及促血管形成能力增强,但增殖、凋亡和细胞周期无明显变化。沉默HIF-1α可以降低SACC-83细胞在低氧环境中MMP-2蛋白的表达,减少VEGF分泌,同时减弱细胞增殖、侵袭和迁移能力,增加细胞凋亡,但细胞周期变化不明显。

关键词：低氧涎腺腺样囊性癌缺氧诱导因子血管内皮生长因子基质金属蛋白酶-2

基于RNA-Seq技术筛选涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭相关差异表达基因

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基于RNA-Seq技术筛选涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭相关差异表达基因

作者：李欢中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)的嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)特性非常独特,与其它头颈部肿瘤常见的生物学特征不相符。近些年不断有学者提出肿瘤的研究应在全基因组层面上研究所有基因的相互作用... 详细信息

唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)的嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)特性非常独特,与其它头颈部肿瘤常见的生物学特征不相符。近些年不断有学者提出肿瘤的研究应在全基因组层面上研究所有基因的相互作用,从而对肿瘤有全面系统的认识。而传统的基因芯片(genechip)分析依赖于已知的基因组信息,这也是该技术的最大局限。RNA-seq技术可以揭示未知的转录本、遗传多态性(genetic polymorphism)以及基因融合(gene fusion),而基因芯片只能检出明确的已知目标。如果测序深度足够,RNA-seq技术相比于基因芯片更能高效的检测出高丰度以及低丰度的转录本。目前RNA-seq技术被广泛运用到分析差异表达基因(differential gene express,DGE),研究可变剪切(alternative splicing)以及发现新转录本(transcript)等方面,其相对于传统的测序方法具有压倒性优势。并且随着第二代测序技术的成熟、发展以及未来测序成本的进一步降低,RNA-seq技术的应用领域也会越来越广泛。本项目采用RNA-Seq技术分析共培养前后的唾液腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)和施万细胞的基因表达水平变化,以挖掘PNI高度相关差异表达基因。结合筛选到的PNI高度相关差异基因的实验结果,课题组前期实验基础以及文献复习结果,我们认为施万细胞通过NT-3/Trk C信号通路促进了SACC-83细胞的嗜神经侵袭(PNI)特性。故我们采用ELISA、q RT-PCR、Western免疫印迹、划痕实验、Transwell嗜神经侵袭及3D培养实验等方法,明确在唾液腺腺样囊性癌独特的PNI演进过程中,NT-3/Trk C信号通路是否扮演了重要角色。并进一步采用腺样囊性癌肿瘤标本进行免疫组化实验,对前期结论进行验证,并且对患者进行随访以及查阅相关病例,研究分析NT-3、Trk C在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达与临床PNI及患者预后之间的关联。第一部分实验目的:基于RNA-Seq技术分析共培养前后的涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)和施万细胞的基因表达水平变化,挖掘嗜神经侵袭相关基因。方法:采用腺样囊性癌细胞与SD大鼠仔鼠坐骨神经施万细胞共培养模型,分析共培养前后SACC-83细胞和施万细胞基因表达水平变化,对差异表达基因进行聚类分析、GO(gene ontology)功能富集分析、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,并采用q RT-PCR对其中6个关键差异表达基因进行验证。采用edge R软件(3.12.1)进行表达差异显著性分析,将p≤0.05,差异表达倍数(foldchange)的绝对值大于1作为差异显著性标准。结果:在腺样囊性癌细胞单独培养组与共培养组之间发现395个差异表达基因(p-value≤0.05,|log FC|≥1.0),其内有135个基因上调(34.2%),260个基因下调(65.8%);在施万细胞单独培养组与共培养组之间发现1239个差异基因(p-value≤0.05,|log FC|≥1.0),其内有757个基因上调(61%),482个基因下调(39%)。GO功能富集分析结果表明这些PNI相关差异表达基因参与了血管再生、细胞外基质的组成、细胞的增殖、凋亡、上皮形态发生、细胞迁移和细胞运动等生物过程;KEGG通路富集分析结果表明其参与组氨酸代谢、肿瘤坏死因子、趋化因子等细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt通路,黏着斑通路,ECM受体相互作用等重要生物学通路。采用q RT-PCR技术对其中6个关键差异表达基因进行验证,验证结果与RNA-Seq结果趋势一致。结论:通过RNA-Seq技术得到了涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭(PNI)高度相关差异基因,为阐明SACC的嗜神经侵袭机制提供重要实验依据,也为临床治疗嗜神经侵袭提供新策略和新靶点。第二部分实验目的:研究肿瘤-神经共培养状态下施万细胞对SACC-83细胞的侵袭、迁移能力的影响及具体分子机制。方法:Schwann cells的原代培养来自于SD大鼠仔鼠的坐骨神经,获取细胞后进行纯化。将施万细胞和肿瘤细胞通过Transwell共培养系统共同培养72小时。酶联免疫吸附实验检测各培养组培养基中NT-3的含量,实时定量PCR、Western免疫印迹法检测NT-3、Trk C在各组细胞内的表达情况,共培养条件下肿瘤细胞和神经细胞的侵袭、迁移能力利用侵袭、迁移实验来评价。嗜神经侵袭3D模型动态观察肿瘤微环境的变化以及SACC-83细胞和SCs定向迁移的时空特征。实验结果采用SPSS17.0软件包进行统计学处理。

关键词：涎腺腺样囊性癌施万细胞嗜神经侵袭 NT-3 TrkC 转录组测序技术差异表达基因

Notch1、4受体过表达对涎腺腺样囊性癌侵袭转移的影响

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Notch1、4受体过表达对涎腺腺样囊性癌侵袭转移的影响

作者：宋敏福建医科大学

学位级别：硕士

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是头颈部常见的唾液腺恶性肿瘤之一。该肿瘤具有极强的侵袭性，常沿神经侵犯周围组织，通过血源性途径向远处转移是其另外一个重要的特性，通常是肺转移或者骨转移，这些特... 详细信息

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是头颈部常见的唾液腺恶性肿瘤之一。该肿瘤具有极强的侵袭性，常沿神经侵犯周围组织，通过血源性途径向远处转移是其另外一个重要的特性，通常是肺转移或者骨转移，这些特性使得患者治疗后远期生存率大大降低，目前对于SACC的治疗仍局限在经验性的手术及放、化疗。本研究从分子水平出发，拟通过研究该病变复杂的基因调控及变化，为将来基因治疗提供实验基础。本课题组前期研究发现，Notch1和Notch4受体在两株遗传背景相同，侵袭转移能力不同的涎腺腺样囊性癌细胞株当中有明显的差异，为进一步研究Notch1和Notch4与涎腺腺样囊性癌侵袭转移的关系，本实验构建Notch1和Notch4受体胞内段基因（NICD1、NICD4）重组腺病毒表达载体，通过体外细胞的一系列功能实验分析Notch1和Notch4基因对涎腺腺样囊性癌侵袭转移的影响，进而探讨相关分子机制。第一部分目的：构建Notch1和Notch4基因重组腺病毒表达载体方法：将NICD1、NICD4片段连接pShuttle-IRES-hrGFP-1载体后与腺病毒骨架质粒同源重组，重组子转染293A细胞后获得高滴度的病毒。用该病毒液感染涎腺腺样囊性癌细胞，进行Western Blot验证NICD1、NICD4蛋白在涎腺腺样囊性癌细胞中表达的变化。结果：成功构建了Notch1和Notch4基因重组腺病毒表达载体。第二部分目的：了解Notch1和Notch4基因重组腺病毒表达载体的功能方法：分别用感染NICD1、NICD4重组腺病毒的涎腺腺样囊性癌细胞进行体外细胞增殖实验，体外细胞侵袭实验及体外细胞迁移实验。结果：体外细胞增殖实验表明过表达NICD1和NICD4蛋白的涎腺腺样囊性癌细胞可以增强SACC细胞的增殖能力;侵袭实验当中过表达NICD1和NICD4蛋白的涎腺腺样囊性癌细胞可以增强SACC细胞的体外侵袭能力;体外迁移实验当中，过表达NICD1和NICD4蛋白的涎腺腺样囊性癌细胞进行可以增强SACC细胞的体外迁移能力。结论：Notch1、Notch4在涎腺腺样囊性癌细胞内的过表达能够促进涎腺腺样囊性癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

关键词： Notch 涎腺腺样囊性癌增殖侵袭迁移

表柔比星和小檗碱对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖，凋亡，自噬的影响

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表柔比星和小檗碱对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖，凋亡，自噬的...

作者：周文博吉林大学

学位级别：硕士

背景:涎腺腺样囊性癌是发生于腮腺,颌下腺,舌下腺以及小唾液腺的肿瘤,恶性程度高,是唾液腺最常见的恶性肿瘤之一。涎腺腺样囊性癌的发生常会影响唾液腺的分泌,致使口腔干燥,进食困难,疼痛明显,又因好发于颌面部,常会影响患者的美观,极... 详细信息

背景:涎腺腺样囊性癌是发生于腮腺,颌下腺,舌下腺以及小唾液腺的肿瘤,恶性程度高,是唾液腺最常见的恶性肿瘤之一。涎腺腺样囊性癌的发生常会影响唾液腺的分泌,致使口腔干燥,进食困难,疼痛明显,又因好发于颌面部,常会影响患者的美观,极大的降低了患者的生活质量。目前涎腺腺样囊性癌的治疗以手术切除为主,辅以术后放疗和化疗,但是,其复发率较高。为了降低涎腺腺样囊性癌的复发率,我们需要寻找新的富有疗效的化疗药。表柔比星是一种化疗药,已经被广泛用于膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的治疗,疗效显著,但是其对涎腺腺样囊性癌的作用尚不清楚。小檗碱是一种在我国应用很久的中药,起初被用于解热镇痛,抗菌及胃肠道疾病的治疗,近年来,科研工作者们发现其还具有抗肿瘤的作用,但目前尚无小檗碱对涎腺腺样囊性癌作用的研究。因此,我们的实验评估了表柔比星和小檗碱对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖,凋亡和自噬的影响。目的:1.评估表柔比星和小檗碱对腺样囊性癌ACC2细胞系增殖、凋亡和自噬的影响。2.研究表柔比星诱导ACC2细胞凋亡的机制。3.评估自噬与细胞耐药性的关系。方法:1.首先,利用CCK8试剂盒检测小檗碱(0μg/ml,3.5μg/ml,7.0μg/ml,14μg/ml)和表柔比星(0μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.0μg/ml)在不同浓度下对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖活性的影响。其次,检测小檗碱(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)在不同作用时间下(24 h,48 h,and 72 h)对ACC2细胞增殖活性的影响。2.分别用小檗碱(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)处理ACC2细胞后,用Annexin V-FITC/PI对细胞进行染色,后进行流式分析,评估细胞凋亡的情况。3.应用western blot实验检测小檗碱(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)处理后ACC2细胞中LC3和P62的蛋白表达量,同时应用免疫荧光技术检测自噬小点的数量,研究表柔比星和小檗碱对ACC2细胞自噬的影响。4.应用western blot实验和免疫荧光技术检测表柔比星(1.0μg/ml)处理后细胞Bax、Bcl-2、细胞色素C蛋白表达量,研究表柔比星诱导细胞凋亡的机制。应用实时荧光定量PCR技术,检测表柔比星(1.0μg/ml)处理后Bax和Bcl-2信使RNA的表达量,进一步研究药物诱导细胞凋亡的机制。5.在表柔比星处理的细胞中加入自噬抑制剂氯喹,抑制自噬。再运用CCK8实验和Annexin V/PI染色法评估自噬对药物诱导凋亡的影响。结果:1.相同作用时间下,随着表柔比星和小檗碱浓度的升高,细胞活性逐渐降低。相同浓度下,表柔比星和小檗碱作用时间越长,细胞活性越低。2.小檗碱浓度在7.0μg/ml,作用24h时,约14.2%的细胞出现凋亡,表柔比星浓度在1.0μg/ml,作用24h时,约10.4%的细胞出现凋亡。*** blot实验中,表柔比星处理的细胞中LC3II蛋白表达量增加,LC3I表达量变化不明显,P62蛋白表达量减少。而小檗碱处理的细胞中LC3I、LC3II和P62的蛋白表达量均无明显变化。免疫荧光实验中,表柔比星处理的细胞中自噬小点明显增加。*** blot实验和免疫荧光技术均显示细胞Bax和细胞色素C的蛋白表达量明显增高,而Bcl-2蛋白表达量变化不显著。实时荧光定量PCR显示Bax的mRNA相对表达量明显增高,而Bcl-2的表达量变化无统计学意义。***8实验显示:表柔比星和氯喹联合用药组细胞活性明显低于表柔比星单独用药组。Annexin V/PI染色法显示:表柔比星和氯喹联合用药组细胞凋亡比例显著高于表柔比星单独用药组。结论:1.表柔比星和小檗碱可以降低ACC2细胞增殖活性,呈剂量和时间依赖性。表柔比星对细胞的作用强于小檗碱。2.表柔比星和小檗碱均可以诱导ACC2细胞凋亡。3.表柔比星可以诱导ACC2细胞发生自噬。小檗碱对自噬无明显影响。4.表柔比星通过提高Bax的表达,促进细胞色素C的释放,最终诱导ACC2细胞凋亡。5.自噬增加了ACC2细胞对表柔比星的耐药性。

关键词：涎腺腺样囊性癌表柔比星小檗碱凋亡自噬