检索结果-南通市图书馆

作者：张刘平重庆医科大学

学位级别：硕士

目的本实验通过建立肿瘤恶病质动物模型，观察不同剂量MG132在不同给药时间对肿瘤恶病质小鼠的预防和治疗作用，并对其作用的分子机制进行初步探讨，旨在为肿瘤恶病质的防治提供新思路。方法采用小鼠结肠癌26（Colon26）细胞株皮下接种B... 详细信息

目的本实验通过建立肿瘤恶病质动物模型，观察不同剂量MG132在不同给药时间对肿瘤恶病质小鼠的预防和治疗作用，并对其作用的分子机制进行初步探讨，旨在为肿瘤恶病质的防治提供新思路。方法采用小鼠结肠癌26（Colon26）细胞株皮下接种BALB/c小鼠，建立肿瘤恶病质动物模型。88只雄性BALB/c小鼠随机分为8组：健康对照组（HC=8只）;肿瘤恶病质组（CC=16只）;MG132预防低浓度组（PL=8只）、中浓度组（PM=16只）、高浓度组（PH=8只）;MG132治疗低浓度组（TL=8只）、中浓度组（TM=16只）、高浓度组（TH=8只）。取Colon26细胞0.1ml（约1×106个）接种于实验组（后7组）每只小鼠腋窝皮下，HC组注射等量生理盐水。每天定时监测各组小鼠精神状态、毛发、体重、摄食量和肿瘤体积。从第5天触及肿瘤结节开始，MG132预防的PL，PM和PH组小鼠每天分别腹腔注射三种不同浓度MG132，其余各组注射等量生理盐水。接种后第12天小鼠进入恶病质期开始，MG132治基金项目重庆市卫生局医学科研计划项目（2011-2-101）疗的TL，TM和TH组小鼠开始每天分别腹腔注射三种不同浓度MG132，其余各组小鼠维持原处理。第19天采集各组8只小鼠的血清、腓肠肌、附睾脂肪和肿瘤组织，CC组、PM组和TM组剩余8只小鼠分别原处理至死亡，记录每只小鼠生存时间。采用自发活动实验视频分析系统记录每组小鼠1小时内自发性活动总路程;采用全自动生化分析仪检测各项生化指标;采用Image Pro Plus6.0软件测量腓肠肌纤维横切面积;采用ELISA法检测血清和腓肠肌中TNF-a和IL-6的水平;采用RT-PCR和Western blot法检测腓肠肌和肿瘤组织中IKBa、P65、MAFbx和MuRF1的mRNA和蛋白表达水平;采用SPSS17.0软件进行数据分析。结果1一般情况从接种Colon26后第5天开始所有荷瘤小鼠皮下均可触及肿瘤结节，接种后第12天，CC组、TL组、TM组和TH组小鼠出现体重明显下降(P体重和肿瘤组织实验开始前各组小鼠间体重无统计学差异(P>0.05)。与HC组比较，终末体重除PM组外均减轻(P体重各组荷瘤小鼠均减轻(P体重均增加(P体积减小(P0.05)。5活动量和生存时间实验开始前各组小鼠1小时总路程无统计学差异(P>0.05)。与HC组比较，CC组小鼠1小时总路程减少(P<0.05);与CC组比较，MG132预防和治疗组小鼠1小时总路程增加(P<0.05)，不同剂量间分别以PM组和TM组最明显，且PM组较TM组增加明显(P<0.05)。与CC组比较，MG132预防和治疗组小鼠中位数生存时间延长(分别是27、36、32天)(P<0.05)，生存率提高(P<0.05)，且PM组优于TM组(P<0.05)。6血清和腓肠肌组织中炎性因子水平与HC组比较，CC组小鼠TNF-a和IL-6水平均显著升高(P<0.05

关键词：肿瘤恶病质 MG132 NF-κB 泛素-蛋白酶体途径炎症

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宫颈癌中Rap1GAP表达下调机制的研究

宫颈癌中Rap1GAP表达下调机制的研究

作者：孙悦大连医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨宫颈癌中Rap1GAP表达下调机制，为进一步揭示宫颈癌发生发展的分子生物学机制奠定理论基础。宫颈癌位于世界女性恶性肿瘤死亡顺位的第二位。据WHO报道，每年近有51万宫颈癌新发病例和28.8万死亡病例，其中发展中国家约占80%:... 详细信息

目的：探讨宫颈癌中Rap1GAP表达下调机制，为进一步揭示宫颈癌发生发展的分子生物学机制奠定理论基础。宫颈癌位于世界女性恶性肿瘤死亡顺位的第二位。据WHO报道，每年近有51万宫颈癌新发病例和28.8万死亡病例，其中发展中国家约占80%:非洲6.8万、拉丁美洲7.7万、亚洲24.5万。肿瘤的发生发展与多种因素有关，原癌基因的激活和抑癌基因的失活是其重要的分子生物学机制。流行病学研究证实宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒HPV的感染密切相关，其致癌机制主要通过高危型人乳头瘤病毒癌蛋白E6对癌基因或抑癌基因的激活、失活起作用，如E6通过泛素-蛋白酶体途径降解Rap1GAP同家族成员E6TP1（E6target protein1），这一机制与宫颈癌的发生发展密切相关。抑癌基因Rap1GAP（Rap1GTPase-activatingprotein）在多种肿瘤中表达下调，体外过表达Rap1GAP后肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等生物学功能受到抑制，进而发挥其肿瘤抑制功能。本研究组前期实验显示，宫颈癌组织内Rap1GAP表达下调，并且Rap1GAP蛋白表达水平与HPV感染呈负相关。因此本文将探讨高危型人乳头瘤病毒癌蛋白E6对Rap1GAP蛋白降解的影响，以期阐明宫颈癌中Rap1GAP表达下调的分子生物学机制。方法：1.采用脂质体转染法将HPV16E6质粒转染入细胞中，荧光显微镜下及RT-PCR法检测外源基因转染效率2.采用Western blot方法观察HPV16E6对细胞中内源性Rap1GAP蛋白降解的影响3.采用MTT法观察不同浓度MG132对细胞增殖的抑制情况4.采用脂质体法将Rap1GAP及HPV16E6质粒共转染入细胞中，Western blot方法观察MG132对HPV16E6降解Rap1GAP的影响。结果：1.荧光显微镜观察显示，vector共转染组与E6共转染组转染效率约60%-70%。2.在Hela细胞中，过表达HPV16E6后，Rap1GAP蛋白的相对表达量（0.777±0.150）明显低于未转染组（1.150±0.092），差异具有显著性（p蛋白的相对表达量（0.890±0.128）与未转染组（1.140±0.203）相比差异无显著性（p>0.05）。3.不同浓度MG132对细胞增殖影响的实验表明，与空白组和DMSO组相比，当MG132为1μM时，其对细胞增殖无明显抑制作用（p>0.05）;MG132为3μM时，第三天起对细胞增殖产生抑制作用（p5μM时,第二天起即对细胞增殖产生抑制作用（p蛋白的相对表达量（0.860±0.028）低于对照组（1.050±0.014），差异具有显著性（p蛋白的相对表达量分别为（1.085±0.064）和（1.045±0.050），与对照组（1.055±0.106）和（1.015±0.120）相比，差异均无显著性（p>0.05）;而在HEK293细胞中，无MG132时，E6共转染组外源性Rap1GAP蛋白的相对表达量（1.130±0.212）与对照组（1.085±0.148）相比差异无显著性（p>0.05）;加入MG132（1μM、3μM）后，E6共转染组外源性Rap1GAP蛋白的相对表达量分别为（1.155±0.050）和（1.125±0.107），与对照组（1.145±0.177）和（1.185±0.106）相比，差异均无显著性（p>0.05）。结论：1.过表达HPV16E6可下调Hela细胞中的Rap1GAP蛋白;而HEK293细胞中则无此作用。***16E6通过泛素-蛋白酶体途径下调Rap1GAP蛋白的表达。

关键词：宫颈癌 Rap1GAP HPV16E6 蛋白降解泛素-蛋白酶体途径

秦川牛宰后肉品质变化对蛋白酶体活性的响应机理

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秦川牛宰后肉品质变化对蛋白酶体活性的响应机理

作者：胡丽筠宁夏大学

学位级别：硕士

蛋白酶体在肉品质指标方面有着重要的作用。虽然目前关于蛋白酶体与宰后肌肉嫩化的研究较为深入,但是仍缺少蛋白酶体与其他肌肉品质关系以及其介导的泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对肉品质影响的研究。本研究以... 详细信息

蛋白酶体在肉品质指标方面有着重要的作用。虽然目前关于蛋白酶体与宰后肌肉嫩化的研究较为深入,但是仍缺少蛋白酶体与其他肌肉品质关系以及其介导的泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对肉品质影响的研究。本研究以宰后4℃条件下不同贮藏期的秦川牛背最长肌为研究对象,测定品质指标、能量水平、蛋白酶体活性变化,鉴定与蛋白酶体相关的差异蛋白质(Differential expression proteins,DEPs),利用生物信息学方法分析蛋白酶体对宰后牛肉品质及能量代谢的响应机制,再通过注射蛋白酶体抑制剂MG-132,探究蛋白酶体介导的UPP途径对宰后秦川牛肉贮藏过程的影响,为宰后牛肉品质的精确调控途径提供理论支撑。主要研究结果如下:1、分析了宰后贮藏期间蛋白酶体活性与能量水平及其与肉品质的关系。随贮藏时间的延长,pH值呈先降低后升高趋势;b*值和肌原纤维小片化指数(Myofibrillar fragmentation index,MFI)呈上升趋势;L*值、a*值、离心损失、蒸煮损失及剪切力呈先上升后下降趋势;能量基本物质ATP、ADP、AMP含量呈下降趋势;20S蛋白酶体活性显著降低(P蛋白酶体活性与b*值呈显著负相关(P蛋白酶体活性与牛肉能量代谢及品质间存在密切联系。2、初步揭示了宰后贮藏期间蛋白酶体调控肉品质的潜在机制。基于4D-非标定量(4D-Label Free Quantification,4D-LFQ)蛋白质组学技术,鉴定出 8 种差异表达的蛋白酶体亚基,并与筛选的DEPs表达量作相关性分析,结合String进行PPI互作分析,最终筛选出27种相关的DEPs;GO分析和KEGG Pathway分析发现,这些蛋白酶体亚基及其相关的DEPs具有内肽酶活性、肌动蛋白结合、微丝运动活性等分子功能,参与泛素依赖性蛋白质分解代谢、骨骼肌收缩、肌肉收缩、糖酵解等生物过程,引起秦川牛肉品质变化;宰后初期蛋白酶体通过消耗能量物质分解代谢蛋白调控生物途径,后期能量物质耗尽,蛋白酶体可通过糖酵解提供的能量以及非ATP依赖型蛋白酶体亚基,实现对宰后蛋白的分解代谢,最终影响牛肉的品质。3、明确了蛋白酶体及其介导的UPP途径对宰后蛋白降解的影响。随着贮藏时间的延长,MG-132组中的蛋白酶体活性低于对照组,总可溶性蛋白含量、泛素蛋白含量高于对照组;SDS-PAGE结果显示,MG-132组总可溶性蛋白条带整体深于对照组;MG-132组的牛背最长肌结构保留较好,Z线以及明暗带的边界都较对照组清晰;且总可溶性蛋白与泛素蛋白含量变化呈显著正相关(P蛋白酶体活性以及UPP途径中泛素化蛋白的降解,进而改变了宰后蛋白的降解,减少肌肉超微结构的破坏,说明宰后UPP途径对肉质形成具有潜在作用,蛋白酶体除了可以单独降解蛋白,破坏宰后肌原纤维结构,还通过介导UPP途径影响宰后牛肉蛋白的降解,最终影响宰后牛肉的品质。

关键词：秦川牛肉蛋白酶体 4D-LFQ技术泛素-蛋白酶体途径肉品质

间隙连接蛋白31.1相互作用蛋白鉴定及降解途径的研究

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间隙连接蛋白31.1相互作用蛋白鉴定及降解途径的研究

作者：阮振超复旦大学

学位级别：硕士

间隙连接(gap junction)是细胞间连接的一种,介导细胞间电信号直接传递和小分子亲水物质的交换,是细胞间直接通讯的一种重要方式。间隙连接在卵泡的形成、发生、发育过程中有着非常重要的作用,在受精过程中也起到一定的调控作用,在哺乳... 详细信息

间隙连接(gap junction)是细胞间连接的一种,介导细胞间电信号直接传递和小分子亲水物质的交换,是细胞间直接通讯的一种重要方式。间隙连接在卵泡的形成、发生、发育过程中有着非常重要的作用,在受精过程中也起到一定的调控作用,在哺乳动物胚胎着床前已经建立。间隙连接蛋白(connexin)是组成细胞间隙连接通道的基本单位,在哺乳动物早期胚胎发育过程中具有表达的特异性。间隙连接蛋白在内质网上合成,是一类四次跨膜的膜蛋白,在反式高尔基体上开始装配成多聚体,六个间隙连接蛋白相互作用形成六聚体,构成一个六角形的亲水通道,称为连接子(connexon)。间隙连接是由位于两个相邻细胞的细胞膜上的两个连接子相互对接形成。Cx31.1由273个氨基酸组成,其分子量为31.088kD,主要在睾丸及皮肤等上皮组织表达,在生殖方面具有一定的生物学作用。我们采用免疫共沉淀技术,从细胞中分离Cx31.1相互作用蛋白质,酶解后进行高效液相色谱-串级质谱分析(HPLC-MS/MS),鉴定出Cx31.1结合蛋白,结果中包含有5个与生殖相关的蛋白。选取GAGE家族进行进一步基因表达水平的检测,结果显示细胞中Cx31.1表达量上升时,GAGE家族基因的表达水平均有显著下降。间隙连接蛋白家族在细胞中半衰期都比较短。Cx31.1在最近的报道中发现其表达水平在非小细胞肺癌细胞系当中有显著下降,Cx31.1在抑制细胞增殖、转移、侵袭等方面都有一定作用,可认为是一个肿瘤抑制因子。然而,目前对细胞如何维持Cx31.1的含量没有相应的研究。在细胞中,蛋白总是被不断地合成和降解,因此我们针对Cx31.1在细胞中的降解机制进行了研究。我们的实验结果显示,Cx31.1可能通过泛素-蛋白酶体途径(UPS)和自噬-溶酶体途径进行降解。用MG-132抑制UPS之后,细胞中Cx31.1的含量有所上升但是不能完全抑制Cx31.1在细胞中的降解。自噬是一种能被例如饥饿等细胞应激诱导发生的降解过程,与一些疾病相关。在稳定表达Ca31.1的H1299细胞中,饥饿或者Brefeldin A诱导自噬发生后,细胞中Cx31.1的水平有显著的下降;用3-MA或氯喹抑制自噬过程的情况下,细胞中Cx31.1的含量有所上升。用siRNA干扰自噬相关基因atg5的表达之后,Cx31.1的减少水平有了很大的抑制。之后,我们观察到Cx31.1在细胞中与自噬体膜的marker LC3有共定位的现象。将Cx31.1用胶体金二抗免疫标记后,我们在透射电子显微镜下观察,看到Cx31.1可以被包裹在一个双层膜的结构当中,提示了Cx31.1会被自噬体所包裹而进行降解。泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径并不是完全相互独立的,它们可能通过一些例如p62等联结蛋白发生相互的联系。我们用siRNA干扰的方法下调p62在细胞中的表达水平,发现细胞中Cx31.1的含量有所上升,意味着Cx31.1的降解可能受到了影响。综合得到的实验结果,本课题的研究显示了Cx31.1可能在生殖相关方面发挥一定的作用。在细胞中,泛素-蛋白酶体途径或者自噬-溶酶体途径都参与了Cx31.1的降解过程,这两条途径可能通过p62产生一定的联系。

关键词： Cx31.1 睾丸癌抗原基因蛋白降解泛素-蛋白酶体途径自噬降解

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纳米光遗传学调控靶向泛素化蛋白质降解研究

纳米光遗传学调控靶向泛素化蛋白质降解研究

作者：郝亚锋天津大学

学位级别：硕士

靶向泛素化蛋白质降解技术(Targeting ubiquitinated protein degradation technology)是一项近些年发展起来的具有颠覆作用的生物技术,其通过蛋白或小分子物质的介入,诱导细胞内固有的泛素-蛋白酶体系统直接在翻译后蛋白质水平特异性... 详细信息

靶向泛素化蛋白质降解技术(Targeting ubiquitinated protein degradation technology)是一项近些年发展起来的具有颠覆作用的生物技术,其通过蛋白或小分子物质的介入,诱导细胞内固有的泛素-蛋白酶体系统直接在翻译后蛋白质水平特异性敲低目标蛋白,与传统的干扰蛋白功能技术相比,靶向泛素化蛋白质降解技术具有特异性识别靶蛋白,直接在翻译后蛋白水平调控、不产生中间负效应等优点,在生物医学研究领域显示出广阔的应用前景。然而,现有的靶向泛素化蛋白质降解技术由于无法实现精准调控蛋白或小分子降解剂的活性,存在难以调控靶蛋白降解进程的缺陷性,阻碍了该技术实现临床应用转化。因此,在现有技术的基础上,探索一种更安全、精准、可控的新型蛋白质降解技术也成为当前研究的主要方向。光遗传学(Optogenetic)是一项将光学技术与基因工程技术联系在一起的技术,具有显著的时空精准调控特性,有望满足调控蛋白质降解的需求。基于此特性,本文设计并构建了纳米光遗传学系统用于时空调控泛素介导的蛋白质降解,该系统发挥功能的核心原理为:利用光遗传学技术合成光敏感的双功能融合蛋白Light ON/Nb-Fc,通过提供不同的光照条件调控其在胞内表达,结合泛素连接酶TRIM21,使表达后的融合蛋白既可特异性识别靶蛋白,又可招募泛素-蛋白酶体系统实现对靶蛋白的降解。本文主要通过以下内容对该系统的蛋白质降解效果进行了探讨:1.在第二章中,为了验证该系统的可行性并对其相关功能进行优化,我们以绿色荧光蛋白(GFP)为目标蛋白,通过引入光敏感蛋白Light ON/vhh GFP4-Fc,结合泛素连接酶TRIM21,成功构建了光调控蛋白降解系统。实验结果表明该系统可以在体外的不同细胞系(Hela细胞和293T细胞)中利用搭建的蓝光LED相关设备降解靶蛋白,通过改变光照时间或光照频率可进一步时空调控泛素介导的蛋白质降解,借助稀土上转换纳米材料作为基因载体与体内光源可在体内(肿瘤模型中)调控靶蛋白降解。2.在第三章中,为了评估该系统的实际应用效果,我们以影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的关键蛋白——非结构蛋白9(NSP9)为目标蛋白,通过引入光敏蛋白Light ON/vhh Nb6-Fc,将该纳米光遗传学系统用于调控NSP9降解。实验结果表明在光照条件下该系统可成功降解NSP9蛋白,抑制PRRSV复制,通过改变不同的光照条件可调控NSP9的降解程度,进一步调控PRRSV的复制状况。综上所述,我们成功构建了纳米光遗传学系统用于时空调控泛素介导的蛋白质降解,通过实验验证了该系统的可行性,对其功能进行了优化,并进一步探讨了该系统通过调控NSP9降解,对PRRSV复制的影响。我们的研究弥补了靶向泛素化蛋白质降解技术目前在调控领域的不足,满足了靶向调控目的蛋白降解的需求。我们希望该系统可以为靶向蛋白质降解技术的发展提供新的思路,并有助于蛋白质降解技术实现临床应用转化。

关键词：蛋白质降解泛素-蛋白酶体途径光遗传学稀土上转换纳米材料非结构蛋白9 猪繁殖与呼吸综合征

MORC2在肝细胞脂肪变性中的作用与机制研究

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MORC2在肝细胞脂肪变性中的作用与机制研究

作者：王涛第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)由于其广大的患病人群以及进展为慢性肝功能衰竭和肝癌等终末期肝病的可能性,已被人们高度关注。对于NAFLD的发病机制,目前仍未完全阐明,较为公认的是“二次... 详细信息

研究背景与目的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)由于其广大的患病人群以及进展为慢性肝功能衰竭和肝癌等终末期肝病的可能性,已被人们高度关注。对于NAFLD的发病机制,目前仍未完全阐明,较为公认的是“二次打击”理论:第一次打击主要指肝细胞发生脂肪变性,使肝细胞更容易受到细胞内外各种损伤因子的攻击;第二次打击是肝细胞内蓄积过多的脂类产生脂毒性,造成膜结构、DNA与细胞器等损伤,最终使肝细胞死亡。肝脏脂肪代谢紊乱是NAFLD发生的病理基础。在肝细胞脂代谢稳态的维持中,核转录因子在其中发挥重要作用。核转录因子MORC2(Microrchidia family CW-type zinc finger 2,也称ZCWCC1)蛋白由970个氨基酸残基组成,其中的核定位序列可使成熟的MORC2蛋白主要定位于胞核,为其调控基因转录提供了细胞定位的前提;序列中锌指结构有利于MORC2结合DNA片段,发挥转录调控作用。另外,MORC2蛋白含有特征性GHKL-ATPase保守结构域,可参与异染色质形成,通过封闭基因转录起始部位达到使基因沉默的作用。MORC2也可与组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)形成蛋白复合物,通过表观遗传的方式发挥负性转录调控作用。现已鉴定出了第一个直接受MORC2负性调控的下游基因CAIX,人们对MORC2作为抑制性核转录因子的研究将继续深入。少量表达于胞浆中的MORC2也可发挥与调控转录的功能无关的效应:在前脂肪细胞向脂肪细胞分化时,胞质中的MORC2含量上升,且可与ATP-柠檬酸裂解酶相互作用,促进后者的活化。ATP-柠檬酸裂解酶是催化乙酰辅酶A形成的重要分子,而后者则是糖、脂等能量代谢中的核心。由于前脂肪细胞在分化过程中发生了成脂基因激活、甘油三酯(triglyceride,TG)蓄积等与肝细胞脂肪变性类似的分子事件,故上述发现为本课题的研究提供了至关重要的线索和依据。为此,我们尝试研究MORC2在肝细胞脂肪变性过程中是否发生含量变化、是否通过调控脂代谢相关基因进而参与了脂肪代谢稳态失衡和脂肪变性的发生。本研究为进一步阐明“第一次打击”及NAFLD的发病机理提供了新的实验依据及思路。方法1.构建永生化人肝细胞株l02(以下简称l02肝细胞)的脂肪变性模型,并使用oro染色及细胞tg含量检测对模型进行鉴定;2.免疫荧光及westernblotting技术检测morc2在l02肝细胞脂肪变性诱导过程中的核浆蛋白水平变化;3.检测morc2在l02肝细胞脂肪变性过程中的蛋白合成与降解水平3.1qrt-pcr检测l02肝细胞脂肪变性诱导前后morc2的mrna水平变化;3.2ubipred网站及ubiprober软件预测morc2蛋白氨基酸序列上可能的泛素化修饰位点;3.3westernblotting检测增强或抑制泛素-蛋白酶体途径后的morc2蛋白水平;4.构建慢病毒并转染l02肝细胞,使其稳定过表达morc2;并使用westernblotting对过表达效果进行鉴定;***染色及tg含量测定比较过表达morc2前后l02肝细胞的脂肪变性程度;6.基因表达谱芯片筛选morc2可能影响的脂代谢相关基因或通路;***检测l02肝细胞中p53蛋白水平在过表达morc2前后的变化;***6-xl5-p53质粒转染l02肝细胞以过表达p53,并使用westernblotting进行效果鉴定;***染色及tg含量测定观察morc2过表达后,再过表达p53时,l02肝细胞的脂肪变性程度;10.使用stepone软件、spss18.0软件对数据进行分析。结果1.l02肝细胞脂肪变性模型的建立与鉴定oro染色及tg含量测定可见对照组细胞脂肪含量极少,而脂肪变性诱导组细胞脂肪蓄积程度明显,且具有时间依赖性;2.免疫荧光及westernblotting检测morc2在l02肝细胞脂肪变性诱导过程中的蛋白水平变化morc2蛋白主要表达在l02肝细胞核内,胞浆表达少,在脂肪变性诱导的前12h,morc2的核、浆含量均无显著变化;在诱导12h后,胞核中morc2的含量出现明显下降,而胞浆中的含量无明显变化;***2在l02肝细胞脂肪变性过程中的蛋白水平下降与泛素-蛋白酶体途径有关3.1qrt-pcr检测中发现,相比于对照组,脂肪变性诱导组细胞的morc2mrna水平并无明显变化;3.2ubipred网站ubiprober软件预测结果显示,在morc2的氨基酸序列中存在9个可能性在80%以上的泛素化修饰位点;3.3加用nem提取蛋白可使胞核中morc2蛋白含量降低,但胞浆中morc2无明显变化;3.4使用mg-132抑制蛋白酶体可解除morc2在l0

关键词：非酒精性脂肪性肝病脂肪变性 MORC2 泛素-蛋白酶体途径 p53

长牡蛎泛素连接酶CgE3Rv1免疫调节机制的初步探究

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长牡蛎泛素连接酶CgE3Rv1免疫调节机制的初步探究

作者：程琪大连工业大学

学位级别：硕士

泛素-蛋白酶体途径是重要的蛋白质翻译后的修饰过程,在细胞周期、信号转导、转录调控、DNA修复和形态发生等各种生命过程中扮演着关键角色。目前,在无脊椎动物中关于泛素的研究相对较少,特别是软体动物中仅发现了泛素化过程的存在,但具... 详细信息

泛素-蛋白酶体途径是重要的蛋白质翻译后的修饰过程,在细胞周期、信号转导、转录调控、DNA修复和形态发生等各种生命过程中扮演着关键角色。目前,在无脊椎动物中关于泛素的研究相对较少,特别是软体动物中仅发现了泛素化过程的存在,但具体的泛素分子及其作用机制尚不明确。在本研究中,我们从长牡蛎(Crassostrea gigas)中鉴定了一个泛素连接酶(ubiquitin-protein ligase)E3,研究了其在长牡蛎组织中的分布特点及在脂多糖(LPS)刺激下的免疫应答过程中的作用。CgE3Rv1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)包含1455个碱基,编码484个氨基酸的多肽,预测分子质量为54.89 kDa。CgE3Rv1的蛋白序列中含有两个跨膜区域和一个RING-variant(RINGv)功能结构域。CgE3Rv1的RINGv结构域具有典型的C4HC3 zinc-finger-like骨架,与脊椎动物和无脊椎动物中已鉴定的泛素连接酶E3极为相似;同时,通过系统进化分析发现CgE3Rv1是一类与膜相关的RING-CH2(MARCH2)型泛素连接酶E3。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,CgE3Rv1基因的mRNA在长牡蛎的性腺和血细胞中的表达水平较高。在LPS刺激后6 h,血淋巴细胞中CgE3Rv1 mRNA的表达水平显著升高(p蛋白质水平和mRNA水平证明了CgE3Rv1主要分布于性腺组织中。此外,通过细胞定位发现,CgE3Rv1主要分布在长牡蛎血淋巴细胞的细胞核周围,但还有一部分散乱地分布于细胞质中和细胞膜上。利用体外泛素化实验证明具有RINGv结构域的重组蛋白rCg E3Rv1-RINGv,能够在与泛素激活酶E1和泛素结合酶E2共孵育的情况下,激活泛素化反应。以上结果表明,CgE3Rv1是长牡蛎中的一个泛素连接酶E3成员,其在长牡蛎免疫应答的调节过程中扮演重要角色。

关键词：太平洋牡蛎泛素-蛋白酶体途径免疫应答脂多糖泛素连接酶E3

小鼠JB6 P+细胞中IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展机制的研究

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小鼠JB6 P+细胞中IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展机制的研究

作者：许凯悦河北大学

学位级别：硕士

目的:利用成熟肿瘤模型小鼠JB6 P+细胞,在细胞和分子水平探索IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展的作用机制,为肿瘤化学预防寻找新的药物提供实验依据和分子靶标。方法:1.研究醉茄素A(Withaferin A,WA)在皮肤肿瘤早期发生发展过程中稳... 详细信息

目的:利用成熟肿瘤模型小鼠JB6 P+细胞,在细胞和分子水平探索IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展的作用机制,为肿瘤化学预防寻找新的药物提供实验依据和分子靶标。方法:1.研究醉茄素A(Withaferin A,WA)在皮肤肿瘤早期发生发展过程中稳定IDH1的机制。肿瘤促进剂TPA或/和WA处理小鼠JB6 P+细胞,检测IDH1蛋白,观察WA对IDH1蛋白表达的影响。分别在转录、翻译和翻译后水平研究WA稳定IDH1的机制:首先,检测IDH1 mRNA水平;其次,蛋白合成抑制剂CHX预处理后检测IDH1蛋白表达;随后,测定蛋白酶体20S活性;蛋白酶体抑制剂MG132预处理后检测IDH1蛋白表达;最后,免疫沉淀检测IDH1泛素化水平。2.研究IDH1作为抑癌基因抑制皮肤肿瘤早期发生发展的机制。利用过表达载体pcDNA3.1-IDH1和siRNA分别在小鼠JB6 P+细胞过表达和沉默IDH1,检测IDH1对其产物α-KG及线粒体复合体I的影响;同时检测糖酵解中重要代谢酶LDH的表达和活性,观察IDH1对线粒体功能及糖酵解的影响。3.研究IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展的调控机制。TPA或/和WA处理小鼠JB6 P+细胞,分别检测HIF-1α及其下游Glut-1蛋白表达,VEGF和IDH1下游PHD的活性;LDH蛋白表达,观察WA对HIF-1α通路及糖酵解的影响。在JB6 P+细胞中分别过表达和沉默IDH1,检测上述参数,观察IDH1对HIF-1α通路的影响。4.运用one-way ANOVA分析实验结果,利用Student-Newman-Keuls比较多组均值差异性。结果:***通过抑制泛素-蛋白酶体途径稳定IDH1。1.1 WA抑制TPA诱导的IDH1蛋白表达和活力下调(P0.05)。1.3 CHX预处理前后,WA均抑制TPA诱导的IDH1表达下调(P蛋白酶体活性增强(P蛋白的影响,IDH1蛋白表达接近正常水平(P>0.05)。1.5免疫沉淀前后检测IDH1蛋白及其泛素化水平,WA抑制TPA诱导的IDH1表达下调及泛素化水平增强(P体的正常功能。IDH1高表达促进其催化产物α-KG的积累,增强线粒体复合体I活性,抑制LDH蛋白表达及活性(P体复合体I活性(P蛋白表达。***通过调控IDH1,阻滞HIF-1α通路及糖酵解。3.1 WA抑制TPA诱导的HIF-1α和Glut1蛋白表达上调,VEGF活性增强以及PHD活性降低(P泛素-蛋白酶体途径,稳定TPA诱导的IDH1蛋白表达下调。***1通过抑制有氧糖酵解,维持线粒体的正常功能发挥抑癌基因的作用。***通过稳定IDH1抑制HIF-1α通路和糖酵解,发挥肿瘤化学预防的作用。

关键词：醉茄素A 皮肤癌泛素-蛋白酶体途径异柠檬酸脱氢酶1 化学预防

抑制缝隙连接蛋白43促进新生大鼠脑缺血损伤后神经功能的恢复

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抑制缝隙连接蛋白43促进新生大鼠脑缺血损伤后神经功能的恢复

作者：李晓静苏州大学

学位级别：硕士

第一部分 Cx43模拟肽对新生大鼠脑缺血缺氧损伤的保护作用目的：1、观察新生大鼠缺血缺氧损伤后缝隙连接蛋白43(Cx43)1周内的含量变化;2、观察Cx43模拟肽对新生大鼠脑缺血缺氧损伤是否具有保护作用。方法：出生7天的SD大鼠随机分为假手... 详细信息

第一部分 Cx43模拟肽对新生大鼠脑缺血缺氧损伤的保护作用目的：1、观察新生大鼠缺血缺氧损伤后缝隙连接蛋白43(Cx43)1周内的含量变化;2、观察Cx43模拟肽对新生大鼠脑缺血缺氧损伤是否具有保护作用。方法：出生7天的SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、假手术+Gap26 (Sham+ Gap26)组、缺血缺氧(HI)组和缺血缺氧+Gap26 (HI+Gap26)组,建立新生大鼠缺血缺氧(the hypoxia/ischemia model, HI)模型,取缺血损伤侧脑组织为标本,采用Western blot法测定缺血缺氧1周内Cx43蛋白的表达;观察缺氧前1小时给予Gap26(不同给药剂量)处理对新生大鼠脑梗死体积的影响以及缺血缺氧后连续给药1周对新生大鼠远期神经行为功能的影响。结果：1、Cx43在缺血缺氧4小时后开始增加,在8小时后明显增加,并随着时间的延长持续增加;在缺血缺氧后1周,Cx43含量相对于假手术组增加了18倍左右。2、与手术组相比,经Gap26处理后大鼠的脑梗死体积明显减小,神经行为功能明显增强。缺氧前1小时腹腔预给予Gap2625μg/kg,48小时后脑梗塞体积减小了24.56%;且该神经保护作用具有剂量依赖性。另一Cx43模拟肽Gap27(25μg/kg)预处理,相对于手术组同样减少脑梗塞体积26.21%左右。缺血缺氧后连续给药1周,分别于第2、3、4周进行前爪抓握实验和足错误实验,第4周进行水迷宫实验,给药组大鼠的抓握能力、平衡能力以及学习记忆功能明显优于手术组,各项神经行为学指标具有明显统计学差异(P蛋白含量在新生大鼠缺血缺氧早期(24小时)及晚期(24小时后)的病理生理学变化中均起到重要的作用。2、使用Gap26干预新生大鼠HI模型,大鼠的脑梗死体积明显减小,远期神经行为功能缺损明显减轻。这些均提示Gap26对新生大鼠脑缺血缺氧损伤具有神经保护作用。关键词：Gap26;脑缺血缺氧损伤;神经保护第二部分Cx43模拟肽对新生大鼠脑缺血缺氧损伤的保护机制目的：1、观察Gap26对新生大鼠缺血缺氧损伤后脑组织内凋亡相关蛋白caspase-3表达、细胞外谷氨酸含量、星形胶质细胞的激活状态的影响;2、研究Gap26对新生大鼠及元代星形胶质细胞缺氧损伤后Cx43的过量表达的影响以及两者相互作用的相关分子机制。方法：1、将出生7天的SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、假手术+Gap26 (Sham+Gap26)组、缺血缺氧(HI)组和缺血缺氧+Gap26 (HI+Gap26)组,建立HI模型,取缺血损伤侧脑组织为标本：采用Western blot法检测***. Cleaved Caspase-3的表达;采用微透析方法提取新生大鼠活体脑组织细胞外液,利用高效液相色谱法(HPLC)测定脑组织及其细胞外透析液中谷氨酸的含量;采用免疫共沉淀法检测脑组织匀浆中的Cx43与生物素(biotin)标记的Gap26有无相互作用关系;采用免疫荧光染色法观察各实验组脑组织冰冻切片星形胶质细胞的激活、Cx43的表达以及biotin-Gap26与Cx43定位关系。2、将出生2天的SD大鼠取元代星形胶质细胞种板,随机分为对照(Con)组、对照+Gap26(Con+Gap26)组、氧糖剥夺(OGD)组和氧糖剥夺+Gap26 (OGD+Gap26)组,制作细胞氧糖剥夺(OGD)模型,观察缺氧前给予Gap26处理对星形胶质细胞缺氧损伤的影响：通过Westwen blot法检测星形胶质细胞缺氧损伤后各实验组不同时间点不同处理方法下Cx43、Akt、p-Akt的表达水平;利用交联剂BS3标记细胞膜表面蛋白;采用免疫荧光染色法观察细胞爬片上星形胶质细胞biotin-Gap26与Cx43定位关系;采用MTT方法检测各实验组星形胶质细胞活力;采用免疫共沉淀法检测各实验组泛素化Cx43的含量。结果：1、Gap26明显降低脑缺血损伤后Cx43、GFAP和Cleaved Caspase-3的过量表达(P<0.05),减少缺血损伤侧脑组织及其细胞外液谷氨酸的含量(P<0.05);荧光染色显示Gap26抑制HI组星形胶质细胞过度激活以及Cx43的过量表达,Cx43与biotin-Gap26在脑组织有共定位关系;免疫共沉淀法检测脑组织匀浆中的Cx43与biotin-Gap26有相互作用关系,而作为对照组的biotin-P5则与Cx43没有相关性。2、Cx43与biotin-Gap26在星形胶质细胞存在共定位关系;Gap26/Gap27明显降低Cx43的表达(P<0.05),同样可以减少小分

关键词：谷氨酸细胞凋亡星形胶质细胞 PI3K/Akt通路泛素-蛋白酶体途径

泛素连接酶TRIM25在非小细胞肺癌中的功能及其机制研究

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泛素连接酶TRIM25在非小细胞肺癌中的功能及其机制研究

作者：邱冬苏州大学

学位级别：硕士

背景泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核细胞体内蛋白质降解的主要途径[1]。真核细胞体内80%-90%的蛋白质是经过泛素-蛋白酶体途径进行降解的[3],其介导的蛋白质的特异性降解参与细胞内许多重要的生理生化过程... 详细信息

背景泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核细胞体内蛋白质降解的主要途径[1]。真核细胞体内80%-90%的蛋白质是经过泛素-蛋白酶体途径进行降解的[3],其介导的蛋白质的特异性降解参与细胞内许多重要的生理生化过程。随着近年来对其研究的不断深入,发现机体内UPP功能的紊乱与许多疾病的发生发展密切相关[4,51。其中,UPP在肿瘤的发生发展过程中有着极为重要的作用。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)由泛素(ubiqutin, ub)、泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)、泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzyme,E3)、26S蛋白酶体和去泛素化酶(deubiquitination enzyme,DUB)组成[3]。TRIM25(Tripartite motif25),又名EFP (Estrogen-responsive Finger Protein),是由TRM25基因编码的蛋白质,属于TRIM家族的一员。许多TRIM家族蛋白都具有E3连接酶的功能。已有研究证实,TRIM25作为E3连接酶在乳腺癌的发生发展中有着重要的作用。迄今对TRIM25与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)发生发展的关系仍知之甚少。鉴于此,本课题就泛素连接酶TRIM25在NSCLC中的功能及其机制展开研究。第一部分泛素连接酶TRIM25在临床NSCLC中表达水平及功能研究目的TRIM25与NSCLC发生发展之间的关系仍不明确。本部分比较TRIM25在肺癌组织及癌旁组织中蛋白水平的表达差异。方法采用蛋白免疫印迹的方法,比较42例病人肺癌组织及癌旁组织中TRIM25蛋白表达水平的差异。结果Western Blot结果显示42例病人中有31例病人肺癌组织中TRIM25的蛋白水平高于癌旁组织,其中肺腺癌25例,19例(76.00%)病人肺癌组织中TRIM25的蛋白水平高于癌旁组织;肺鳞癌17例,12例(70.59%)病人肺癌组织中TRIM25的蛋白水平高于癌旁组织。结论TRIM25在临床NSCLC肺癌组织中存在异常高表达。第二部分泛素连接酶TRIM25对肺腺癌细胞株迁徙的影响目的探索过表达TRIM25对肺腺癌细胞株迁徙能力的影响。方.法选取H1299肺腺癌细胞株,构建TRIM25稳定高表达细胞株H1299(TRIM25)及其对照株H1299 (control),通过划痕实验比较两种细胞株在细胞迁徙方面的差异。结果H1299(TRIM25)细胞的迁徙能力明显强于H1299 (control)细胞。结论过表达TRIM25可以促进肺腺癌细胞的迁徙。第二部分TRIM25在发生发展中分子机制研究目的探索TRIM25促进NSCLC发生发展的机制,寻找其作用的下游信号通路方法(1)在肺腺癌细胞株中过表达TRIM25,采用Western Blot检测P相关通路基因蛋白质水平的变化： (2)利用雷帕霉素处理TRIM25稳定高表达细胞株H1299(TRIM25)及其对照细胞株诱导细胞自噬,采用Western Blot检测观察过表达TRIM25对肺腺癌细胞自噬过程的影响;(3)通过Western Blot及免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation)探究TRIM25对抑癌基因同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白质的稳定性及泛素化修饰水平的影响;(4)采用MTT的方法,检测过表达TRIM25及沉默TRIM25对肺癌细胞顺铂敏感性差异的变化。结果(1)在肺癌细胞中过表达TRIM25后,随着TRIM25蛋白水平的增高,P53的蛋白水平呈下降趋势,：在H1299肺腺癌细胞中过表达TRIM25后,随着TRIM25转录水平的增高,磷酸化AKT、磷酸化mTOR蛋白水平呈上升趋势,但是AKT、mTOR蛋白水平无明显变化;(2)分别用雷帕霉素处理TRIM25稳定高表达细胞株H1299(TRIM25)及其对照细胞株诱导自噬。结果显示,同等浓度的雷帕霉素作用下,H1299(TRIM25)自噬水平明显低于其对照株,诱导自噬所需的雷帕霉素作用浓度亦高于其对照株;(3)在人胚源肾细胞HEK293T中共转myc-TRIM25、Flag-PTEN、HA-ub质粒,当转染TRM25后,PTEN的泛素修饰水平上升,但不影响其蛋白质的稳定性;(4)在肺腺癌细胞H1299中过表达TRIM25后,细胞对顺铂的敏感性下调,将大细胞肺癌细胞H460中TRIM25沉默后,细胞

关键词：泛素-蛋白酶体途径泛素连接酶TRIM25 肺癌 AKT-mTOR通路