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汉滩病毒S基因及其5'端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

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中国病毒学 2002年第1期17卷 47-50页

作者：潘蕾白雪帆黄长形李光玉陈红梅韦三华杨为松第四军医大学唐都医院传染科西安710038

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义，为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物，用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５... 详细信息

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义，为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物，用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ），用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中，成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体，并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中，进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率，目　的基因能在宿主细胞中表达，有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。

关键词：汉滩病毒 S基因5'端核蛋白真核表达载体

汉滩病毒感染体外培养神经元损伤及抗体对其保护作用

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中国病毒学 2002年第1期17卷 42-46页

作者：王航雁彭立明杨为松李光玉解放军总医院儿内科北京100853 烟台市人民医院外科烟台264001 第四军医大学唐都医院传染科西安710038

用体外培养的昆明小鼠胚胎脑皮质神经元，感染汉滩病毒后，　检测原癌基因ＦＯＳ的表达，加入ＨＦＲＳ病人恢复期血清，观察其对神经元的保护作用。将病毒　感染的神经元经免疫组化染色，检测原癌基因ＦＯＳ的快速表达；在病毒感染的神... 详细信息

用体外培养的昆明小鼠胚胎脑皮质神经元，感染汉滩病毒后，　检测原癌基因ＦＯＳ的表达，加入ＨＦＲＳ病人恢复期血清，观察其对神经元的保护作用。将病毒　感染的神经元经免疫组化染色，检测原癌基因ＦＯＳ的快速表达；在病毒感染的神经元内加入Ｈ　ＦＲＳ病人恢复期血清，使用ＭＴＴ比色试验检测神经元存活情况。病毒感染的神经元ＦＯＳ表达明　显　增高，与对照组相比有显著性差异（Ｐ＜０．００１）；　ＨＦＲＳ病人恢复期血清保护病毒感染的神经元　组　与感染对照组神经元活性明显不同，有显著性差异（Ｐ＜０．００１）。　ＨＴＮＶ感染体外培养的神经元　，会使细胞内产生ＦＯＳ的快速表达，ＨＦＲＳ病人恢复期血清对病毒感染的神经元有一定的保护　作用。

关键词：汉滩病毒神经元损伤细胞培养肾综合征出血热免疫保护

用于汉滩病毒固有免疫应答研究的永生化人脐静脉内皮细胞系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2021年第12期37卷 1057-1065页

作者：张惠贾岩靳嘉岩叶伟程林峰雷迎峰张芳琳刘赫空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院学员三大队十一队陕西西安710032

目的通过导入人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因构建永生化人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC-hTERT),探索永生化HUVEC对汉滩病毒(HTNV)感染效率及细胞固有免疫调控的影响,评价HUVEC-hTERT作为研究HTNV细胞模型的潜能。方法将hTERT基因克隆入慢病... 详细信息

目的通过导入人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因构建永生化人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC-hTERT),探索永生化HUVEC对汉滩病毒(HTNV)感染效率及细胞固有免疫调控的影响,评价HUVEC-hTERT作为研究HTNV细胞模型的潜能。方法将hTERT基因克隆入慢病毒载体,构建pCDH-CMV-hTERT-EF1-puro质粒后包装慢病毒并感染HUVEC;嘌呤霉素筛选稳定表达hTERT基因的HUVEC命名为HUVEC-hTERT;利用显微镜观察和免疫荧光细胞化学染色法对HUVEC-hTERT的形态及内皮细胞标志分子人血管性假血友病因子(vWF)、CD31和血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)进行鉴定;利用免疫荧光法检测HTNV感染后核衣壳蛋白(NP)阳性细胞百分比,观察HTNV对HUVEC和HUVEC-hTERT的感染效率差异;利用实时定量PCR和Western blot法分别检测感染HTNV后,病毒基因组小片段(S)及其编码的NP在不同时间点的复制水平,验证HTNV在细胞中的增殖效率;利用实时定量PCR检测细胞β干扰素(IFN-β)、黏病毒抗性蛋白A(MxA)、MxB、干扰素诱导蛋白2(IFIT2)、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)及炎症因子环加氧酶2(COX2)、细胞间黏附因子(ICAM)和CC趋化因子配体5(CCL5)的mRNA水平并利用Western blot法检测IFIT2、IFITM3和MxA的蛋白水平,观察细胞固有免疫对HTNV的反应是否一致。利用Western blot、实时定量PCR检测感染HTNV后细胞上述分子的表达情况,观察永生化后细胞固有免疫对HTNV的反应是否一致。结果成功筛选出永生化细胞系HUVEC-hTERT,鉴定出其与HUVEC具有相同的表型并表达内皮细胞标志分子vWF、CD31、VE-cadherin;HUVEC-hTERT和HUVEC均可被HTNV感染且感染效率基本相同;在HTNV感染过程中,HUVEC-hTERT的固有免疫分子,如IFN-β、MxA、MxB、IFIT2、IFITM3、COX2、ICAM及CCL5的表达情况与HUVEC相同,表明HUVEC-hTERT固有免疫调控未发生改变。结论HUVEC-hTERT可在一定程度上代替原代HUVEC用于HTNV感染致固有免疫应答调控的研究。

关键词：永生化人脐静脉血管内皮细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT) 汉滩病毒固有免疫

SFTS病毒、登革病毒、汉滩病毒快速荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

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中华实验和临床病毒学杂志 2022年第2期36卷 230-235页

作者：胡停停朱禹李阿茜孙丽娜黄晓霞芜为李川王芹李建东李德新王世文柳燕梁米芳王晓芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委生物安全重点实验室北京102206 安徽医科大学合肥230032

目的建立针对发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)三种常见病毒性出血热病毒的现场应急快速检测方法。方法基于传统的TaqMan荧光探针技术,利用国产快速一步法RT-PCR试剂盒,结合magnetic induction cycler(Mic)qPCR仪,建立三种常见病毒性出血热病毒的快速荧光定量RT-PCR检测方法。利用三种病毒体外转录RNA及模拟样本、其他相关病毒临床样本及健康人血标本进行灵敏度、特异性、重复性验证。结果相较于传统的实时荧光定量RT-PCR方法,此方法所需时间大大缩短,可在35 min内完成检测。SFTSV、DENV、HTNV的最低检出限均小于100拷贝/PCR,与模拟对照样本及其他病毒临床样本无交叉反应,模拟阳性样本验证均可检出,且各组验证结果的Ct值变异系数均小于4%。结论本研究建立的快速荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性。对于现场应急检测和媒介生物标本筛查具有一定的应用前景。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒登革病毒汉滩病毒快速荧光定量RT-PCR

抗汉滩病毒双链抗体重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达

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免疫学杂志 2005年第2期21卷 84-87页

作者：胡刚徐志凯张芳琳吴兴安阎岩白文涛于澜王海涛第四军医大学微生物学教研室西安710032

目的　应用Bac to Bac杆状病毒表达系统构建具有抗汉滩病毒(HTNV)G2 糖蛋白(GP)鼠源性mAb 3G1与抗HTNV核蛋白(NP)鼠源性mAb 1A8嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达抗HTNV双链抗体并对表达产物进行初步鉴定。方法　构建含有嵌合基... 详细信息

目的　应用Bac to Bac杆状病毒表达系统构建具有抗汉滩病毒(HTNV)G2 糖蛋白(GP)鼠源性mAb 3G1与抗HTNV核蛋白(NP)鼠源性mAb 1A8嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达抗HTNV双链抗体并对表达产物进行初步鉴定。方法　构建含有嵌合基因的杆状病毒表达载体ScFv pFBD ScFv’,转化DH10Bac致敏菌,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上,快速筛选出含有抗HTNV双链抗体嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中进行表达,并利用间接免疫荧光试验检测表达产物。结果　构建了含抗HTNV双链抗体嵌合基因之重组杆状病毒,并在昆虫细胞中表达出特异性抗体,该抗体能被兔抗人Cκ抗体所识别并可与HTNVNP和GP特异性结合。结论　成功地在昆虫细胞中表达出抗HTNV双链抗体,且该抗体具有与HTNVNP抗原和GP抗原结合的活性。

关键词：单链抗体双链抗体汉滩病毒杆状病毒昆虫细胞

TLR4介导汉滩病毒引起血管内皮细胞分泌IL-6和TNF-α

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中国人兽共患病学报 2009年第1期25卷 1-3页

作者：姜泓王平忠王丽梅张野黄长形王九平徐哲孙利白雪帆第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心西安710038 第四军医大学微生物学教研室

目的检测汉滩病毒感染血管内皮细胞后IL-6,IL-8和TNF-α的分泌变化及其与TLR4的关系。方法用5LgTCID50/mL的HTNV76-1180.2mL感染EVC-304细胞(TLR4+)和EVC-304TS4(TLR4-)分别为实验组,以病毒未感染为阴性对照组,以LPS(2μg/mL)刺激作为阳性对照。48h后取细胞培养上清,用人IL-6,IL-8和TNF-α定量EIA试剂盒分别检测IL-6,IL-8和TNF-α在两个细胞系感染前后的分泌水平。结果IL-8在两个细胞系中感染前后的变化不明显,IL-6和TNF-α在EVC-304细胞系中,HTNV感染后升高,而在TLR4表达阴性的EVC-304细胞中,感染前后变化不明显。结论在TLR4表达阳性的EVC-304细胞中IL-6和TNF-α分泌增加,血管内皮细胞EVC-304在HTNV感染后的IL-6和TNF-α分泌可能是TLR4介导的。

关键词：汉滩病毒内皮细胞 TLR4

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运用流式细胞术快速检测汉滩病毒滴度

细胞与分子免疫学杂志 2011年第5期27卷 579-581,584页

作者：蒋伟杨栋强潘蕾于海涛李彧王伟王平忠白雪帆第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心陕西西安710038

目的:建立用流式细胞仪快速测定汉滩病毒滴度的方法。方法:汉滩病毒76-118株感染Vero-E6细胞,以汉滩病毒核蛋白单克隆抗体(mAb)3G1为一抗,FITC标记的羊抗小鼠抗体为二抗,用流式细胞术(FCM)检测阳性细胞率,评价感染后不同时间点,以及不... 详细信息

目的:建立用流式细胞仪快速测定汉滩病毒滴度的方法。方法:汉滩病毒76-118株感染Vero-E6细胞,以汉滩病毒核蛋白单克隆抗体(mAb)3G1为一抗,FITC标记的羊抗小鼠抗体为二抗,用流式细胞术(FCM)检测阳性细胞率,评价感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率,并与间接免疫荧光法对比。结果:感染后36 h阳性细胞百分率为(10.06±0.42)%,最低检测的病毒滴度为100 TCID50/mL。结论:相对于传统的空斑实验及间接免疫荧光滴定法,FCM是一种简单、快速、有效检测汉滩病毒滴度的方法。

关键词：汉滩病毒流式细胞术空斑实验间接免疫荧光病毒滴度

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重组汉滩病毒核蛋白的纯化及鉴定

中华实验和临床病毒学杂志 2002年第4期16卷 364-366页

作者：尹文徐志凯薛小平刘勇王海涛张芳琳第四军医大学微生物学教研室西安710032

目的　纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白。方法　重组菌经IPTG诱导后 ,表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶 (GST)标签的融合蛋白 ,并以包涵体形式存在。将包涵体变性、复性后 ,采用GlutathioneSepharose 4B亲和色谱对核蛋白进行纯化 ,并... 详细信息

目的　纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白。方法　重组菌经IPTG诱导后 ,表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶 (GST)标签的融合蛋白 ,并以包涵体形式存在。将包涵体变性、复性后 ,采用GlutathioneSepharose 4B亲和色谱对核蛋白进行纯化 ,并用夹心ELISA和Westernblot检测纯化蛋白。结果　表达产物第一次过柱亲和层析后可去除杂蛋白 ,获得纯化的核蛋白与谷胱甘肽转硫酶的融合蛋白 ,再经凝血酶酶切 ,第二次过柱亲和层析后获得的穿过峰为核蛋白 ,洗脱峰为GST。纯化的融合蛋白和纯化的核蛋白均为SDS PAGE单点纯 ,并具有良好的抗原活性。结论　GlutathioneSepharose 4B亲和色谱纯化重组汉滩病毒核蛋白是一种较为有效的方法。

关键词：汉滩病毒核蛋白质类亲和色谱法蛋白质印迹法蛋白纯化蛋白鉴定

带有GFP标签的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第1期27卷 109-111页

作者：张宇丝马樱易静刘蓓徐竹蔚张春梅庄然金伯泉第四军医大学免疫学教研室陕西西安710032

目的:构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白(GP)真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法:以peGFP-C1质粒为模板扩增GFP片段,将其插入真核表达载体pFLAG-CMV3中,构建成可表达带有GFP标签分泌型蛋白的载体pFLAG-CMV3-... 详细信息

目的:构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白(GP)真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法:以peGFP-C1质粒为模板扩增GFP片段,将其插入真核表达载体pFLAG-CMV3中,构建成可表达带有GFP标签分泌型蛋白的载体pFLAG-CMV3-GFP。扩增HTNV-G1、HTNV-G2,分别插入上述载体,转染293T细胞,采用检测GFP标签蛋白的夹心ELISA法检测转染细胞培养上清中分泌型重组蛋白的含量。结果:酶切及测序证实带有GFP标签的HTNV-G1、HTNV-G2表达载体构建成功,分别命名为pFLAG-G1-GFP/pFLAG-G2-GFP,转染细胞的培养上清中可以检测出带有GFP标签的融合蛋白。结论:成功构建了带有GFP标签HTNV-GP的重组质粒并成功表达,为深入研究HTNV感染后机体针对HTNV-GP的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。

关键词：汉滩病毒糖蛋白 GFP