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作者：张俊梅延安大学

学位级别：硕士

汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染可引起肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),其主要临床表现为发热、出血和肾脏功能损伤。目前缺乏针对HTNV感染的特异性抗病毒治疗药物,临床上尤其需要研发高效、低毒的抗HTN... 详细信息

汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染可引起肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),其主要临床表现为发热、出血和肾脏功能损伤。目前缺乏针对HTNV感染的特异性抗病毒治疗药物,临床上尤其需要研发高效、低毒的抗HTNV治疗药物。由于病毒生命周期的各个阶段依赖于宿主蛋白的参与,因此我们通过筛选病毒感染过程中发挥关键作用的宿主分子并探索HTNV与宿主细胞相互作用机制,有望为HTNV感染的防治提供新的药物靶点。研究目的:激酶在多种病毒感染过程中发挥非常重要的作用,可作为抗病毒药物的靶点。本课题利用高内涵分析系统的荧光成像功能和体外HTNV感染模型,利用siRNA文库从含有709个基因的人蛋白激酶中筛选与HTNV感染相关的宿主基因,将筛选获得的宿主基因在HTNV感染过程中发挥的作用与机制进行研究,并以此宿主基因为靶点开展抗HTNV候选药物的研究。研究方法与结果:***感染相关宿主依赖因子的筛选本研究从包含709个基因的人蛋白激酶siRNA文库中筛选与HTNV感染相关的宿主基因,通过A549细胞转染siRNA后感染HTNV,以免疫荧光实验为检验方法、高内涵分析系统及R语言包辅助分析,筛选发现391个基因敲低后影响细胞生长,计算剩余318个基因的Z-Score并排序,得到5个Z-Score>2(敲低后促进HTNV感染)的抑制HTNV感染的宿主基因。经过进一步分析,将宿主基因糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)作为研究的主要基因,敲低GSK3β后感染HTNV的A549细胞中HTNV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)显著升高,HTNV S基因表达也明显上调。***3β在HTNV感染过程中的作用及机制研究利用免疫印迹实验(Western blot)、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)、免疫荧光实验(Immunofluorescence assay,IFA)、病灶形成实验(Focus forming assay,FFA)等实验方法检测GSK3β对HTNV感染的影响。结果显示,使用GSK3β抑制剂LiCl抑制GSK3β活性后HTNV复制增强;使用GSK3β激动剂KYA1797K激活GSK3β活性后HTNV复制明显减弱。进一步激活GSK3β活性对其抗HTNV感染的机制进行研究。首先检测激活GSK3β活性对干扰素依赖的抗病毒作用的影响,结果显示,激活GSK3β活性并未促进IFN-β1与干扰素刺激基因Mx1的表达,同时敲除干扰素信号通路关键基因STAT1,其抗HTNV效应并未减弱,表明激活GSK3β活性后抗HTNV感染并非通过干扰素信号通路;通过在不同时间点加入GSK3β激动剂KYA1797K研究激活GSK3β活性在HTNV生命周期的作用阶段,Western blot及RT-qPCR检测结果显示,HTNV感染2 h内经KYA1797K处理可显著降低感染细胞中HTNV量,提示激活GSK3β活性发挥抗病毒作用在HTNV生命周期的早期阶段;通过检测HTNV感染早期的黏附和穿入阶段,RT-qPCR结果显示与对照组无明显差异,提示GSK3β发挥抗病毒作用不在HTNV感染早期的黏附和穿入过程;进一步检测HTNV感染早期内体中的病毒含量,显示激活GSK3β活性后早期内体中病毒拷贝数较对照组升高3倍以上,同时IFA可观察到早期内体标志物Rab5a与HTNV NP的共定位增加,病毒发生明显聚集,提示激活GSK3β活性可能导致HTNV滞留于感染早期内体中,从而阻断病毒在细胞中的运输以发挥抗HTNV作用。3.以GSK3β为靶点的抗病毒候选药物的研究基于以上结果,本研究进一步以GSK3β激动剂KYA1797K作为抗HTNV感染的候选药物研究其药效作用。在HTNV细胞感染模型中研究发现,KYA1797K可高效抑制HTNV感染且细胞毒性较低;利用小鼠HTNV感染模型,发现KYA1797K可显著降低BALB/C感染小鼠中主要脏器中HTNV量,且对小鼠体重没有明显影响。以上结果表明GSK3β激动剂KYA1797K可显著抑制HTNV的感染,可作为抗HTNV的候选药物。研究结论:本研究利用siRNA文库从人蛋白激酶中筛选到与HTNV感染相关的宿主基因GSK3β,进一步研究发现激活GSK3β活性可以抑制HTNV的感染,主要是通过将HTNV滞留于早期内体中,阻断病毒在细胞中的运输从而发挥其抗HTNV作用;同时本研究还明确了GSK3β激动剂KYA1797K可显著抑制HTNV感染,可为HFRS治疗候选药物的开发提供新的

关键词：汉滩病毒感染 siRNA筛选 GSK3β

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NKG2A-HLA-E轴介导的NK细胞免疫应答在汉滩病毒感染中的作用及机制研究

NKG2A-HLA-E轴介导的NK细胞免疫应答在汉滩病毒感染中的作用及机...

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作者：薛鳗玲延安大学

学位级别：硕士

目的:汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）是引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）的重要病原体之一,人感染后可发生肾功能损害、发热、出血、血小板减少等临床表现,重症患者可发展为难治性休克甚至死亡。自... 详细信息

目的:汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）是引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）的重要病原体之一,人感染后可发生肾功能损害、发热、出血、血小板减少等临床表现,重症患者可发展为难治性休克甚至死亡。自然杀伤（natural killer,NK）细胞在抗病毒免疫中发挥重要作用,其表型和功能的变化与疾病的发展密切相关,但尚不完全清楚HTNV感染引起的NK细胞应答在HFRS发病机制中的作用。研究提示病毒感染细胞表面人类白细胞抗原E（human leukocyte antigen E,HLA-E）表达上调,并且可与病毒蛋白来源的多肽结合形成复合物,通过与抑制性受体自然杀伤细胞2组成员A（natural-killer group 2,member A,NKG2A）互作调控NK细胞功能,从而参与疾病发病过程。本课题拟研究NKG2A-HLA-E轴介导的NK细胞免疫应答在HTNV感染中的分子机制及作用,为阐明NK细胞在HFRS疾病中的免疫效应提供科学依据。方法:（1）利用单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq,sc RNA-Seq）检测急性期HFRS患者外周血NK细胞的亚群类型及转录组特征;（2）结合流式细胞术（flow cytometry,FCM）和胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining,ICS）检测HFRS患者外周血NK细胞表面NKG2A和自然杀伤细胞2组成员C（natural-killer group 2,member C,NKG2C）的表达水平,并验证NK细胞的表型、活化水平、增殖能力、分泌细胞因子和杀伤介质的能力,分析各项指标与HFRS患者病情病程的关系;（3）通过建立HTNV体外感染人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）模型,FCM检测HUVEC细胞HLA-E及经典HLA-Ⅰ类分子（HLA-Ⅰa）水平。利用K562/HLA-E细胞结合试验筛选高亲和力结合HLA-E分子的HTNV抗原肽,并测定HLA-E/肽复合物稳定性及肽浓度依赖性。利用配受体结合实验测定HLA-E/HTNV抗原肽复合物与CD94/NKG2A（C）的结合程度。用四聚体（tetramer）染色技术检测HFRS患者外周血HTNV抗原肽/HLA-E*0103 tetramer+NKG2A+NK细胞频率变化;（4）分选HFRS患者NK细胞与加载HTNV抗原肽的K562/HLA-E细胞体外共培养,检测NKG2A+NK细胞对加载HTNV抗原肽的K562/HLA-E细胞的杀伤能力及其活化、增殖、细胞因子和杀伤介质分泌水平的变化。结果:第一部分中,（1）HFRS急性期患者外周血存在三个主要的NK细胞亚群;（2）HFRS患者NK细胞亚群主要呈现CD56dimCD16+NKG2A+NKG2CloCD57-表型(将具有以上表型的细胞简称为CD56dimNKG2A+NK细胞,为后续研究的目标亚群);（3）患者CD56dimNKG2A+NK细胞呈现高增殖及炎性信号特征。第二部分中,（1）HFRS患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中NK细胞表面NKG2A的表达水平显著高于NKG2C,存在CD56dimCD16+NKG2A+NKG2C-CD57-NK细胞亚群且频率高于未感染对照组;（2）与对照组相比,患者CD56dimNKG2A+NK细胞的活化程度增加且与病程进展呈正相关;其增殖能力增强与病情呈正相关,与病期呈负相关;急性期HFRS患者CD56dimNKG2A+NK细胞分泌干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α的能力强于恢复期患者;恢复期患者CD56dimNKG2A+NK细胞较急性期患者表达更高水平的穿孔素和CD107a,而颗粒酶B的表达水平无显著差异。第三部分中,（1）HTNV感染HUVECs表面HLA-E及HLA-Ⅰa分子水平升高;（2）筛选得到4条HLA-E*0103分子高亲和力结合的HTNV抗原肽,即HTNV核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）5、糖蛋白（glycoprotein,GP）7、GP8和GP20,其稳定程度呈肽浓度依赖性;（3）HLA-E/HTNV抗原肽复合物不结合CD94/NKG2A（C）受体;HFRS患者外周血中HTNV抗原肽/HLA-E*0103tetramer+CD56dimNKG2A+NK细胞频率较低,与对照组无差异。第四部分中,（1）HLA-E/

关键词：汉滩病毒肾综合征出血热 NK细胞 HLA-E NKG2A

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木犀草素抗汉滩病毒效果初步研究

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热带医学杂志 2024年第3期24卷 318-323,I0001页

作者：赵悦汐罗璐璐王彦博强遵先吕依雯马宏炜程林峰张芳琳陕西中医药大学医学技术学院陕西咸阳712046 空军军医大学基础医学院陕西西安710032

目的探索木犀草素对汉滩病毒(HTNV)的抑制作用。方法用0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的木犀草素处理Huh-7细胞,用0、10、20、25、50、75、100、150、200 μmol/L的木犀草素处理A549细胞,培养48 h后,细胞计数... 详细信息

目的探索木犀草素对汉滩病毒(HTNV)的抑制作用。方法用0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的木犀草素处理Huh-7细胞,用0、10、20、25、50、75、100、150、200 μmol/L的木犀草素处理A549细胞,培养48 h后,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力并计算木犀草素半数毒性浓度(CC_(50))。在HTNV感染同时Huh-7细胞分别加入0、8、10、14、16、22 μmol/L木犀草素,A549细胞分别加入0、4、6、8、10、12 μmol/L木犀草素,2 h后换液为含对应浓度药物的培养基,培养48 h后,实时荧光定量PCR检测细胞内HTNV RNA水平并计算半数抑制浓度(IC_(50))。在Huh-7细胞感染HTNV的不同时间阶段(感染前1~48 h、感染前1 h、感染0~2 h、感染后2~48 h、感染后6~48 h、感染后12~48 h、感染后24~48 h),给予25 μmol/L木犀草素处理,感染48 h后,通过蛋白质印迹、免疫荧光、实时荧光定量PCR检测细胞内HTNV蛋白和RNA水平,通过酶联斑块形成实验检测子代HTNV滴度。分别在HTNV入胞阶段(感染0~2 h)及复制阶段(感染后2~48 h),用高、中、低浓度(25、12.5、6.25 μmol/L)木犀草素处理感染HTNV的Huh-7细胞,感染48 h后检测细胞内HTNV蛋白和RNA水平。最后通过分子对接模拟木犀草素与HTNV的核衣壳蛋白(NP)和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的相互作用效果。结果与0 μmol/L木犀草素处理比较,25 μmol/L木犀草素处理的Huh-7和A549细胞的细胞存活率差异无统计学意义(F=79.94、14.64,P均>0.05);后续实验选择25 μmol/L为木犀草素的最大安全浓度;木犀草素对于Huh-7、A549细胞的CC_(50)分别为141、83 μmol/L。Huh-7、A549细胞的木犀草素的IC_(50)分别为16.18、11.64 μmol/L。在HTNV感染后2~48 h、6~48 h、12~48 h、24~48 h给予木犀草素处理,HTNV蛋白、RNA及滴度水平降低,差异均有统计学意义(F=3.48、6.29、18.69,P均<0.05)。木犀草素抑制复制组的HTNV蛋白、RNA水平随着药物浓度的增加而降低,差异均有统计学意义(F=122.90、49.49,P均<0.05)。分子对接结果显示,木犀草素可与HTNV NP和RdRp相互作用,结合能分别为-8.0、-8.1 kcal/mol。结论木犀草素有效抑制HTNV感染,该抑制效果主要作用于HTNV复制周期的转录翻译阶段。

关键词：汉滩病毒肾综合征出血热木犀草素抗病毒感染

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汉滩病毒糖蛋白Gn的T细胞表位预测及其跨种属验证

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解放军医学杂志 2023年第9期48卷 1000-1010页

作者：孙报增秦聪聪张俊琦王永凯张文标刘瑞波白天原张志辉张宇丝杨琨姜东伯空军军医大学基础医学院免疫学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院生物武器损伤防治药物重点实验室陕西西安710032 空军医科大学唐都医院风湿科陕西西安710032 空军军医大学基础医学院微生物学教研室陕西西安710032

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白-N末端(Gn)上的免疫反应性表位。方法通过UniProt数据库获取HTNV 76-118株Gn蛋白序列。采用IEDB、SMMPMBEC、NetMHCpan 4.1、SYFPEITHI、Rankpep算法预测表位亲和力,VaxiJen v2.0分析免疫... 详细信息

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白-N末端(Gn)上的免疫反应性表位。方法通过UniProt数据库获取HTNV 76-118株Gn蛋白序列。采用IEDB、SMMPMBEC、NetMHCpan 4.1、SYFPEITHI、Rankpep算法预测表位亲和力,VaxiJen v2.0分析免疫原性,Blastp工具计算保守性,HPEPDOCK和EpiDOCK模拟pMHC对接,TBtools进行双向聚类分析,酶联免疫斑点(ELISpot)实验评价表位细胞免疫反应性。结果通过UniProt数据库获得了HTNV 76-118株Gn蛋白序列(PRO_0000036816)。整合5种亲和力算法,在小鼠H-2亚型中获得了61个优势表位,在人主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ亚型中得到234个优势表位,MHC-Ⅱ亚型中得到212个优势表位;VaxiJen筛选分别获得H-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ亚型强免疫原性优势表位23、110、42个;进一步采用Blastp筛选获得高亲和力、强免疫原性、种间种内保守的MHC-Ⅰ类限制性表位3个,MHC-Ⅱ类限制性表位81个。双向分层聚类分析揭示了小鼠H2-d、H2-b和部分人类白细胞分化抗原(HLA)在提呈HTNV Gn表位上的相似性。ELISpot验证了5个表位具有较强的诱导脾细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)的能力。结论预测并验证了HTNV Gn上的细胞免疫反应性表位,证实在MHC提呈中病毒抗原存在跨基因、种属、物种的交叉免疫反应性,为预防肾综合征出血热(HFRS)提供了新思路。

关键词：汉滩病毒糖蛋白表位计算机预测免疫反应性

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汉滩病毒G_2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第4期21卷 415-417页

作者：吴兴安于澜胡刚张芳琳白文涛史梦远徐志凯第四军医大学基础部微生物学教研室陕西西安710032

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、... 详细信息

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。

关键词：汉滩病毒糖蛋白G2 重组腺病毒免疫

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汉滩病毒S片段基因cDNA 3′端非编码区对核蛋白在大肠杆菌中表达的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 1997年第4期17卷 255-257页

作者：黄长形杨为松杭长寿白雪帆李光玉李新红孙永涛张文彬第四军医大学唐都医院传染科中国预防医学科学院病毒学研究所出血热室

为了探讨汉滩病毒Ｓ片段ｃＤＮＡ３′端非编码区基因对核蛋白表达的影响，先后构建了两个核蛋白的表达质粒（ｐＢＶＳ２２和ｐＢＶＳＸ），其中ｐＢＶＳ２２不含非编码区基因，ｐＢＶＳＸ含有３′端非编码区基因。比较两者在大肠杆菌中... 详细信息

为了探讨汉滩病毒Ｓ片段ｃＤＮＡ３′端非编码区基因对核蛋白表达的影响，先后构建了两个核蛋白的表达质粒（ｐＢＶＳ２２和ｐＢＶＳＸ），其中ｐＢＶＳ２２不含非编码区基因，ｐＢＶＳＸ含有３′端非编码区基因。比较两者在大肠杆菌中表达核蛋白的水平后发现３′端非编码区对核蛋白的表达有明显的负调控作用，表达量下降近５０％。可能的原因是非编码区中含有非常丰富的ＡＴ碱基。该研究结果为进一步提高汉滩病毒核蛋白的表达量积累了经验，也为高效表达其它病毒结构蛋白提供了有益的资料。

关键词：汉滩病毒核蛋白表达非编码区基因大肠杆菌

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汉滩病毒部分核蛋白基因原核表达产物的免疫及其保护作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2001年第1期21卷 36-39页

作者：汪毅白雪帆杨为松王航雁张梦华黄长形李光玉北京军区总医院肝病研究所第四军医大学唐都医院传染科

目的　探讨汉滩病毒 (HTNV)部分核蛋白 (NP)基因 (37～ 2 94bp)原核表达产物NPAA1～ 86多肽的免疫原性及其免疫保护作用。方法　大肠杆菌表达的HTNV部分核蛋白多肽NPAA1～ 86混合福氏佐剂 ,腹腔注射免疫BALB/c小鼠 ,IFA检测抗体应答 ;3H... 详细信息

目的　探讨汉滩病毒 (HTNV)部分核蛋白 (NP)基因 (37～ 2 94bp)原核表达产物NPAA1～ 86多肽的免疫原性及其免疫保护作用。方法　大肠杆菌表达的HTNV部分核蛋白多肽NPAA1～ 86混合福氏佐剂 ,腹腔注射免疫BALB/c小鼠 ,IFA检测抗体应答 ;3H TdR掺入及 4h51Cr释放试验检测免疫小鼠脾细胞对HTNV的特异淋巴细胞增殖转化指数及细胞毒T淋巴细胞 (CTL)杀伤功能 ;免疫小鼠脾细胞转输感染HTNVA9株的乳鼠 ,观察对乳鼠致死性的免疫保护作用。结果　免疫后 1周小鼠即出现抗体应答反应 ,抗体滴度最高达 1∶12 80 0 ,与重组完整NP免疫组差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;免疫小鼠的淋巴细胞增殖转化指数、CTL杀伤率较对照组明显增高 (P 0 0 5 ) ,CTL杀伤率随效∶靶比例的增高呈逐渐上升趋势 ;免疫小鼠脾细胞转输可部分保护病毒致死性感染的乳鼠 ,保护率约 2 5 %。结论　大肠杆菌表达的汉滩病毒部分核蛋白多肽NPAA1～86不仅包含NP几乎所有的体液免疫表位 ,同时含有部分细胞免疫表位 ,对汉滩病毒感染可产生部分免疫保护作用。

关键词：汉滩病毒核蛋白表位免疫原性免疫保护

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汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期19卷 35-37页

作者：张梦华杨为松黄长形李光玉王航雁汪毅白雪帆第四军医大学唐都医院传染科卫生部艾滋病预防与控制中心

目的研究汉滩病毒Ｓ片段编码区基因免疫小鼠的作用。方法利用基因重组技术，构建含汉滩病毒Ｓ片段编码区基因的真核表达质粒。用此质粒直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内进行ＤＮＡ免疫，用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒... 详细信息

目的研究汉滩病毒Ｓ片段编码区基因免疫小鼠的作用。方法利用基因重组技术，构建含汉滩病毒Ｓ片段编码区基因的真核表达质粒。用此质粒直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内进行ＤＮＡ免疫，用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体。结果在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体。加强免疫后，抗体水平显著上升，免疫荧光抗体（ＩＦＡＴ）滴度最高达１６４０。约８７％的免疫动物发生了血清抗体阳转。抗体水平及小鼠血清抗体阳转率与注射的质粒ＤＮＡ剂量及注射次数有关。

关键词：汉滩病毒基因免疫免疫荧光抗体

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汉滩病毒Gc的细胞免疫反应性评估和验证

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陆军军医大学学报 2023年第19期45卷 2007-2017页

作者：谢明阳孙报增马思婕杨端罗程王越越曹宇宸康文龙张赟杨琨姜东伯空军军医大学基础医学院免疫学教研室西安710032 中国人民武装警察部队江西总队鹰潭支队江西鹰潭335000

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒包膜糖蛋白C末端(Hantaan virus glycoprotein C-terminal,HTNV Gc)上免疫反应性表位。方法在预测覆盖率超过全球98%人群主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因基础上,通过免疫... 详细信息

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒包膜糖蛋白C末端(Hantaan virus glycoprotein C-terminal,HTNV Gc)上免疫反应性表位。方法在预测覆盖率超过全球98%人群主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因基础上,通过免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)、丹麦技术大学(Technical University of Denmark,DTU)等免疫信息学前沿算法系统分析HTNV Gc上9肽和15肽表位的亲和力,使用Vaxijen工具分析免疫原性,使用Blastp工具分析种间种内保守性;双向层次聚类比较MHC-Ⅰ类和Ⅱ类限制性表位的交叉免疫反应性;使用分子对接模拟出优势表位与MHC对接的可能结果;通过酶联免疫斑点(ELISpot)实验验证计算机分析结果。结果将多种生物信息学算法结果整合后,获得高亲和力、种间种内保守和强免疫原性的9肽和15肽表位,分别为8和80个,其中人鼠共同优势表位8个;聚类分析证明H-2基因型与HLA基因型存在部分相似;分子对接结果模拟出下优势表位与多个MHC基因型对接良好,且与亲和力分析结果一致;在非优势表位对比下,优势表位组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的量更高。结论使用多种生物信息学算法成功筛选出HTNV Gc上优势表位,并通过ELISpot实验鉴定了上述表位的细胞免疫反应性。

关键词：汉滩病毒糖蛋白表位计算机预测免疫反应性

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汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第3期19卷 215-217页

作者：刘勇徐志凯张芳琳罗雯吴兴安白文涛胡刚第四军医大学微生物学教研室陕西西安710032

目的 :在Bac to Bac杆状病毒表达系统中 ,融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法 :构建含有汉滩病毒G2S0 .7嵌合基因的表达载体 pFBDHTa G2S0 .7,并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统 ,将嵌合基因重组至... 详细信息

目的 :在Bac to Bac杆状病毒表达系统中 ,融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法 :构建含有汉滩病毒G2S0 .7嵌合基因的表达载体 pFBDHTa G2S0 .7,并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统 ,将嵌合基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中 ,并筛选含有G2S0 .7嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果 :构建了的含G2S0 .7嵌合基因的重组杆状病毒 ,感染昆虫细胞后 ,可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体 (mAb)所识别。结论 :利用杆状病毒表达系统 ,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0 .7。

关键词：汉滩病毒杆状病毒昆虫细胞核蛋白糖蛋白融合表达

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