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梅毒螺旋体经P2X7受体激活NLRP3炎症复合体并促进巨噬细胞分泌IL-1β

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梅毒螺旋体经P2X7受体激活NLRP3炎症复合体并促进巨噬细胞分泌IL-...

作者：刘卫厦门大学

学位级别：硕士

目的:梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)感染引起的性传播疾病,其致病机制仍不清楚。IL-1β在机体对抗感染、损伤以及免疫应答中发挥重要作用,P2X7 受体(P2X7 Receptor,P2X7R)通过调节 NOD 样受体 3(NOD-like receptor family,... 详细信息

目的:梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)感染引起的性传播疾病,其致病机制仍不清楚。IL-1β在机体对抗感染、损伤以及免疫应答中发挥重要作用,P2X7 受体(P2X7 Receptor,P2X7R)通过调节 NOD 样受体 3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症复合体的活化能影响 IL-1β 的分泌。本研究探讨Tp诱导THP-1(人单核细胞)来源巨噬细胞中NOD样受体3(NLRP3)炎症复合体的活化及IL-1β成熟的分子机制,阐明P2X7受体的活化是Tp诱导NLRP3炎症复合体活化的重要因素。方法:以THP-1来源的巨噬细胞为研究对象,按照MOI(感染复数)为20:1,50:1,100:1,200:1 将与巨噬细胞共培养,采用 Realtime-PCR 和 Western blot检测细胞中P2X7R、NLRP3、caspase-1及IL-1β基因水平和蛋白水平的表达变化,同时用ELISA法检测细胞上清中IL-1β的分泌量;再选择MOI 20:1分别于0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h和48h收集细胞及上清液,观察不同时间P2X7R、NLRP3、caspase-1和IL-1p的变化情况。分别采用P2X7受体激动剂ATP(5 mM)或 P2X7 受体抑制剂 A438079(1 00 μM),100 mM KCl 或 siRNA 干扰 THP-1 来源巨噬细胞中P2X7R、NLRP3的表达,研究P2X7R、NLRP3对Tp诱导的巨噬细胞分泌IL-1β的影响。结果:不同浓度的Tp能使巨噬细胞产生IL-1β,且IL-1β的产生水平与MOI呈明显的浓度依赖性,用MOI为20:1的Tp刺激巨噬细胞后IL-1β的分泌水平随时间持续增高,在24h达到最高峰;Realtime-PCR及Western blot结果发现Tp刺激能使细胞中NLRP3、caspase-1的表达升高;P2X7受体激动剂ATP处理巨噬细胞后发现IL-1β的分泌与表达显著升高;经A438079、KCl处理巨噬细胞后,发现Tp诱导IL-1β的分泌也被显著的抑制;而经siRNA干扰巨噬细胞P2X7R、NLRP3的表达后也能抑制IL-1β的分泌。结论:Tp诱导巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β,Tp诱导成熟IL-1β的分泌依赖于P2X7受体的激活和NLRP3炎症复合体的活化。

关键词：梅毒螺旋体 P2X7受体 NLRP3炎症复合体 IL-1β

梅毒螺旋体膜脂蛋白Tpn32免疫保护作用的初步研究

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梅毒螺旋体膜脂蛋白Tpn32免疫保护作用的初步研究

作者：陈奎琳南华大学

学位级别：硕士

目的:评估梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）膜脂蛋白Tpn32免疫新西兰兔后诱导产生的细胞免疫反应、体液免疫反应以及Tp攻击后延缓病变发展的免疫保护作用研究,以验证重组蛋白Tpn32（r Tpn32）的疫苗潜力,为筛选新的候选Tp疫苗分子... 详细信息

目的:评估梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）膜脂蛋白Tpn32免疫新西兰兔后诱导产生的细胞免疫反应、体液免疫反应以及Tp攻击后延缓病变发展的免疫保护作用研究,以验证重组蛋白Tpn32（r Tpn32）的疫苗潜力,为筛选新的候选Tp疫苗分子奠定基础。方法:1.构建并验证原核表达载体p ET-28a/Tpn32后,将其转化至大肠杆菌中诱导表达并进行Western Blot鉴定;2.随机将11只新西兰兔分为r Tpn32组（5只）、PBS组（3只）和佐剂组（3只）,通过肌肉和皮下向新西兰兔体内注射r Tpn32、PBS或弗氏佐剂,2w免疫一次,共免疫3次,每次免疫前取新西兰兔耳缘静脉血,分离血清后检测特异性抗体效价;取末次免疫2w后的新西兰兔血清,用酶联免疫试剂盒分别检测免疫新西兰兔血清中IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌水平;3.末次免疫2w后对新西兰兔进行Tp感染,观察并记录新西兰兔背部皮损的出现时间及直径大小,然后采用RT-PCR方法对不同免疫组新西兰兔的皮损部位、血液和肝脏等组织的Tp载量进行检测,以及经病理切片观察背部皮损与睾丸组织中的炎症细胞浸润情况。结果:1.通过菌液PCR鉴定和p ET-28a/Tpn32重组质粒测序结果验证,p ET-28a/Tpn32原核表达载体构建成功;*** Blot结果证实在相应分子量大小32k Da处出现一特异性条带;3.与PBS组和佐剂组相比,免疫后第2 w r Tpn32免疫组开始产生特异性抗体,并且随着免疫次数的递增,抗体水平也不断增加,在第6w时,蛋白免疫组Ig G抗体水平达到1:125600,此时r Tpn32免疫组的特异性抗体水平与PBS组和佐剂组相比均具有显著性差异（P＜0.0001）;4.通过兔IFN-γ酶联免疫试剂盒结果显示,r Tpn32蛋白免疫组的IFN-γ分泌水平明显高于PBS组（P＜0.0001）和佐剂组,而PBS组与佐剂组之间IFN-γ分泌无明显差异;5.根据兔IL-6酶联免疫试剂盒和兔IL-8酶联免疫试剂盒结果显示,r Tpn32蛋白免疫组IL-8含量明显高于PBS组和佐剂组;***组和佐剂组新西兰兔的背部感染部位在第9 d时全部已出现了不同程度的皮疹或硬结,而r Tpn32免疫组则在第12 d才都出现了皮肤损伤,同时,在Tp感染期间,r Tpn32免疫组的背部皮损直径明显小于PBS组和佐剂组,且PBS组和佐剂组的背部皮损溃疡率也明显高于r Tpn32免疫组;***-PCR结果显示r Tpn32免疫组新西兰兔感染部位Tp的载量与PBS组和佐剂组无明显差异,而r Tpn32免疫组新西兰兔的血液、睾丸等远端组织中的Tp载量明显少于PBS组和佐剂组（P＜0.01）;8.r Tpn32免疫组背部皮损部位的病理染色中出现大量的炎性细胞浸润;而与PBS组和佐剂组相比,r Tpn32免疫组的睾丸中淋巴细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润较少。结论:***32免疫诱导新西兰兔产生了较高水平的特异性Ig G抗体和Th1型细胞因子IFN-γ;2.r Tpn32免疫新西兰兔减缓了其背部皮损的病变发展,并可能延缓了体内Tp向远端器官的播散。

关键词：梅毒螺旋体 Tpn32 膜脂蛋白免疫保护性

梅毒螺旋体黏附素Tp0750免疫保护性及诊断价值评估

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梅毒螺旋体黏附素Tp0750免疫保护性及诊断价值评估

作者：符波南华大学

学位级别：硕士

目的:评估重组梅毒螺旋体（Tp）黏附素蛋白Tp0750（rTp0750）在新西兰兔体内诱导的免疫保护性及体外诊断价值,以筛选新的梅毒候选疫苗分子与诊断抗原。方法:1.构建原核表达载体pET-28a/Tp0750,转化入大肠埃希菌中诱导表达rTp0750并以Wes... 详细信息

目的:评估重组梅毒螺旋体（Tp）黏附素蛋白Tp0750（rTp0750）在新西兰兔体内诱导的免疫保护性及体外诊断价值,以筛选新的梅毒候选疫苗分子与诊断抗原。方法:1.构建原核表达载体pET-28a/Tp0750,转化入大肠埃希菌中诱导表达rTp0750并以Western blot鉴定;2.将新西兰兔随机分为三个组,即A:rTp0750（实验组）,B:rTp0751（阳性对照组）,C:PBS（阴性对照组）,用纯化重组蛋白/PBS肌注和皮下注射新西兰兔,间隔两周共免疫四次,每次免疫前收集血清检测特异性IgG抗体水平;取末次免疫后2周兔脾细胞,用CCK-8细胞增殖试剂盒及逆转录PCR（RT-PCR）试剂盒分别检测脾淋巴细胞增殖及IFN-γ的mRNA转录水平;同时在新西兰兔背部皮内注射Tp攻击感染,观察皮损直径变化及皮肤溃疡形成,实时荧光定量PCR（qPCR）检测新西兰兔不同组织部位Tp-DNA载量,光镜下观察皮损与肾脏病理组织中炎症细胞浸润。3.建立基于rTp0750的间接ELISA,检测不同时期的梅毒患者血清、正常人血清、交叉血清的特异性IgG抗体水平,评估Tp0750的诊断价值。结果:*** blot结果显示,所构建原核表达重组质粒pET-28a/Tp0750表达一分子量25kDa大小的特异性蛋白;2.A与B组在免疫后第2周出现相应特异性抗体并逐渐增加,于第8周达到高峰（P＜0.01）,此时B组特异性IgG滴度高于A组（P＜0.05）;***-8结果显示,A组与B组兔淋巴细胞的刺激指数（SI）均明显高于C组（P＜0.01）,但A组与B组之间无明显差异;qPCR结果显示,A组与B组兔脾细胞中IFN-γ转录水平均明显高于C组（P＜0.01）,B组高于A组（P＜0.05）;4.攻击后第14天A组和B组皮损直径均小于C组（P＜0.01）,B组小于A组（P＜0.05）;攻击后第21天,A组和B组皮肤溃疡发生率组小于C组,B组低于A组;***结果显示,Tp载量最多的部位为皮肤与血液;皮损中Tp载量三组间无明显差异,但兔肝脏、脾脏、血液、肾脏组织中Tp载量A组与B组明显少于C组（P＜0.01）,A与B组间无明显差异;6.组织病理结果显示,三组兔皮损部位均出现炎性细胞浸润,但C组炎性细胞数量少于A组与B组,A组与B组无明显差异;C组兔肾脏出现明显地炎性细胞浸润,而A组和B组不明显;***0750-ELISA检测临床样本结果显示灵敏度为51.7%,特异度95.2%。结论:***0750可在新西兰兔体内诱导高水平的特异性抗体产生和细胞免疫应答;***0750免疫新西兰兔有效减轻感染部位皮损发展并抑制Tp在体内播散;***0750具有较高的诊断特异性但灵敏度较低,不适于作为梅毒血清学诊断抗原。

关键词：梅毒螺旋体 Tp0750 黏附素免疫保护性血清学诊断

梅毒螺旋体Tp0463蛋白的表达及其在临床血清学诊断中应用的初步评价

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梅毒螺旋体Tp0463蛋白的表达及其在临床血清学诊断中应用的初步评...

作者：刘小军南华大学

学位级别：硕士

目的：通过基因工程技术，表达梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）重组蛋白Tp0463，探讨其在梅毒临床血清学诊断中的价值，为发现Tp新的候选诊断抗原提供实验依据。方法：从Genbank获取Tp0463蛋白的基因序列，以Tp Nichols标准株的... 详细信息

目的：通过基因工程技术，表达梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）重组蛋白Tp0463，探讨其在梅毒临床血清学诊断中的价值，为发现Tp新的候选诊断抗原提供实验依据。方法：从Genbank获取Tp0463蛋白的基因序列，以Tp Nichols标准株的全基因组DNA为模板，PCR扩增该基因编码第8-110号氨基酸的基因片段;将目的基因克隆入T-A克隆载体pMD18-T中，再亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a(+)/Tp0463，经PCR、双酶切与测序鉴定后转化至表达宿主菌*** BL21(DE3)中，IPTG诱导表达蛋白，SDS-PAGE分析目的产物的表达形式，用Ni-NTA亲和层析法纯化目的重组蛋白，SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度，BCA法测定纯化蛋白浓度;Western blot鉴定表达产物的免疫反应性（抗原性）和特异性。以纯化重组蛋白TP0463包被微孔板，建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，检测标准梅毒阳性血清、阴性血清共40份，优化ELISA反应条件;以优化的ELISA检测体系随机检测临床诊断明确的梅毒患者血清150份、健康人血清份150份、易发生交叉反应的人群（类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、结核病患者及孕妇）血清40份，与金标准梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）进行平行比较，初步评价重组抗原Tp0463在梅毒血清学诊断中的应用价值。结果： PCR扩增出一大小约330bp的目的片段（含引物），重组质粒经PCR、双酶切和测序（测序结果与GenBank登录序列完全一致）鉴定证实插入片段为目的基因Tp0463;SDS-PAGE分析显示，构建的pET28a(+)/Tp0463原核重组表达菌在IPTG诱导下表达了一相对分子量约为16kDa的重组蛋白，在宿主菌体细胞内主要以可溶性方式存在，经Ni-NTA亲和纯化后，纯度在95%以上;Western-blot结果显示目的蛋白仅能与标准梅毒阳性混合血清发生特异性反应，而不与非梅毒混合血清反应。以重组蛋白为已知抗原建立间接ELISA法，检测标准梅毒阳性和阴性血清，其阳、阴性符合率分别为95.45%和100%，总符合率为97.5%;对340份临床标本随机进行检测，与金标准TPPA法比较，建立的ELISA法的总灵敏度为88.7%，低于TPPA法(P＜0.05)，特异度为100%，两种方法的总符合率为95.0%。结论：1.成功构建Tp0463原核表达重组质粒，在宿主菌内诱导高效表达重组目的蛋白，该蛋白有良好的免疫反应性。2.与金标准TPPA方法相比，基于重组Tp0463抗原的ELISA方法具有较好的敏感性和高度特异性，显示出重组Tp0463蛋白潜在的临床诊断价值，但其临床应用有待进一步评价。

关键词：梅毒螺旋体 Tp0463 重组抗原酶联免疫吸附试验血清学诊断

梅毒螺旋体膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971通过TLR2途径诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子

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梅毒螺旋体膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971通过TLR2途径诱导巨噬...

作者：张跃军南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971能否诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子(CKs)IL-6和IL-1β;通过观察TLR2抗体、CD14抗体、NF-κB特异抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对三种膜脂蛋白诱导巨... 详细信息

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971能否诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子(CKs)IL-6和IL-1β;通过观察TLR2抗体、CD14抗体、NF-κB特异抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对三种膜脂蛋白诱导巨噬细胞产生CKs的影响,研究这些膜脂蛋白诱导产生前炎症CKs是否与TLR2、CD14及NF-κB介导的信号转导途径有关。方法:①通过Genbank获取选Tp0663、Tp0821和Tp0971的基因序列,以Tp Nichols株基因组DNA为模板,PCR扩增目的片段,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中构建重组质粒pET28a(+)/Tp0663、pET28a(+)/Tp0821和pET28a(+)/Tp0971,经PCR、双酶切、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌*** Rosseta中,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度;Detoxi-Gel?内毒素去除胶去除重组蛋白中的内毒素,经鲎试剂测定内毒素含量。②佛波酯(PMA)诱导人单核细胞THP-1转化为巨噬细胞,用Tp0663、Tp0821和Tp0971重组蛋白刺激巨噬细胞,ELISA双抗体夹心法检测诱生其前炎症细胞因子IL-6和IL-1β的情况;用TLR2抗体、CD14抗体和PDTC预处理巨噬细胞后,用Tp0663、Tp0821和p0971重组蛋白分别刺激巨噬细胞,ELISA分析TLR2抗体、CD14抗体和PDTC对重组蛋白诱导巨噬细胞产生IL-6和IL-1β的影响。结果:构建的重组质粒经酶切和测序鉴定证实插入片段为目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致;SDS-PAGE结果显示,在IPTG诱导下,重组表达菌分别表达了一相对分子量(Mr)约为34kDa(Tp0663)和36 kDa(Tp0821),29 kDa(Tp0971)的重组蛋白,目的蛋白在菌体细胞内以可溶性和包涵体形式存在,经Ni-NTA亲和纯化后,纯度在95%以上,Western blot结果显示其与目的蛋白大小相符;内毒素去除胶处理重组蛋白,经鲎试剂检测内毒素小于0.04EU/mL;THP-1细胞经PMA刺激转化为巨噬细胞,不同浓度的重组蛋白(0.5μg/ml～10μg/ml)能明显诱导巨噬细胞产生IL-6和IL-1β;当重组蛋白浓度高于3μg/ml(Tp0663)和5μg/ml(Tp0821和Tp0971)时,IL-6和IL-1β产生的量无明显增加。TLR2抗体处理后,Tp0663, Tp0821和Tp0971诱导IL-6的产生量分别降至66.0%、64.0%和60.0%,IL-1β的产生量分别降至63.0%、62.0%和62.0%;经CD14抗体处理后, IL-6的产生量分别降至71.0%、73.0%和69.0%,IL-1β的产生量分别降至69.0%、70.0%和66.0%,经TLR2和CD14抗体联合处理后IL-6的产生量分别降至54.0%、55.0%和56.0%,IL-1β的产生量分别降至51.0%、50.0%和52.0%,NF-κB特异性抑制剂PDTC处理后IL-6和IL-1β的产生量分别降至20%以下,各处理组与对照组(同型抗体)比较(P<0.05)有明显差异。结论:1. Tp0663、Tp0821和Tp0971重组蛋白能诱导巨噬细胞产生前炎症CKs IL-6和IL-1β;2. Tp0663、Tp0821和Tp0971重组蛋白诱导巨噬细胞产生前炎症CKs与TLR2和CD14及NF-κB参与的信号转导通路有关。

关键词：梅毒螺旋体膜脂蛋白前炎症细胞因子信号转导途径

梅毒螺旋体鞘蛋白Tp0664经TLR2途径诱导THP-1细胞表达IL-6

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梅毒螺旋体鞘蛋白Tp0664经TLR2途径诱导THP-1细胞表达IL-6

作者：谢亚锋南华大学

学位级别：硕士

目的:构建梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）重组鞘蛋白Tp0664的原核表达载体,在纯化并鉴定表达产物后去除其中的内毒素,初步探讨其诱导THP-1细胞产生促炎细胞因子IL-6的能力。此外,通过研究TLR2负显性质粒、TLR4与TLR5干扰RNA、TLR... 详细信息

目的:构建梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）重组鞘蛋白Tp0664的原核表达载体,在纯化并鉴定表达产物后去除其中的内毒素,初步探讨其诱导THP-1细胞产生促炎细胞因子IL-6的能力。此外,通过研究TLR2负显性质粒、TLR4与TLR5干扰RNA、TLR6负显性质粒、MyD88负显性质粒、ERK特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125、p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082对Tp0664诱导THP-1细胞产生IL-6的影响,探讨其诱导THP-1细胞产生IL-6是否与TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、MyD88、ERK1/2、JNK、p38和NF-κB介导的信号转导途经有关。方法:从GenBank获取tp0664基因的完整序列,然后设计高特异性引物。提取Tp Nichols标准株DNA,以其为模板,PCR技术扩增tp0664全长基因;构建pET28a-Tp0664原核表达载体,经菌液PCR以及测序鉴定后,将其转化至*** BL21（DE3）表达宿主菌中,IPTG诱导重组蛋白Tp0664的表达。采用SDS-PAGE和Western bloting对表达产物进行分析、鉴定;使用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,二喹啉甲酸法测定蛋白浓度;多黏菌素B去除Tp0664中的内毒素后使用鲎试剂测定Tp0664中内毒素含量;Tp0664刺激THP-1细胞,RT-PCR检测IL-6 mRNA转录水平,ELISA双抗体夹心法检测IL-6表达水平,Western bloting检测相关信号分子磷酸化水平。TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和MyD88负显性质粒或干扰RNA转染至THP-1细胞后,Tp0664刺激THP-1细胞,RT-PCR、ELISA和Western bloting分别检测IL-6 mRNA转录水平、IL-6表达水平和相关信号分子的磷酸化水平。erk1/2特异性抑制剂pd98059、jnk特异性抑制剂sp600125、p38特异性抑制剂sb203580和nf-κb特异性抑制剂bay11-7082分别预处理thp-1细胞30min后,tp0664刺激thp-1细胞,rt-pcr、elisa和westernbloting分别检测il-6mrna转录水平、il-6表达水平和相关信号分子的磷酸化水平。结果:成功构建pet28a-tp0664重组质粒,经菌液pcr和测序鉴定后证实插入片段为tp0664基因序列;***21表达菌在iptg诱导后表达相对分子量mr约为34kda的目的蛋白。经分析,tp0664为可溶性蛋白。ni-nta亲和层析纯化后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page证实蛋白纯度>95%,mr与目的蛋白大小相符。westernbloting鉴定表明纯化的重组蛋白即为目的蛋白。多黏菌素b处理tp0664后稀释,鲎试剂测定该重组蛋白所含内毒素为0.036eu/ml;不同浓度tp0664（0.5μg/ml0μg/ml）刺激thp-1细胞均能引起il-6mrna转录水平升高以及il-6表达水平升高,但1.0μg/ml刺激thp-1细胞24h时il-6mrna转录水平最高,1.0μg/ml刺激thp-1细胞48h时il-6表达水平最高。thp-1细胞转染tlr2和myd88负显性质粒后,il-6mrna转录水平和il-6表达水平明显受抑。erk1/2特异性抑制剂pd98059、p38特异性抑制剂sb203580和nf-κb特异性抑制剂bay11-7082预处理thp-1细胞30min后,再以tp0664刺激thp-1细胞,il-6mrna转录水平和il-6表达水平明显受抑,处理组与对照组比较（p0.05）。结论:（1）tp重组鞘蛋白tp0664可诱导thp-1细胞表达促炎细胞因子IL-6;（2）TLR2、MyD88、ERK1/2、p38和NF-κB参与重组蛋白Tp0664诱导THP-1细胞表达促炎细胞因子IL-6。

关键词：梅毒螺旋体重组蛋白 Tp0664 IL-6 信号转导通路

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梅毒螺旋体的免疫组化法检测意义

梅毒螺旋体的免疫组化法检测意义

作者：陈洁浙江大学

学位级别：硕士

目的：近年来,梅毒的发病率越来越高,由于病损的多变性、临床症状的隐匿性、临床病史的不完整等因素,诊断日益困难。有时,结合血清学试验、组织病理学检查亦不能完全明确诊断。本文采用梅毒螺旋体特异性抗体的免疫组织化学法（immun... 详细信息

目的：近年来,梅毒的发病率越来越高,由于病损的多变性、临床症状的隐匿性、临床病史的不完整等因素,诊断日益困难。有时,结合血清学试验、组织病理学检查亦不能完全明确诊断。本文采用梅毒螺旋体特异性抗体的免疫组织化学法（immunohistochemistry of Treponema pallidum, TP-IHC）检测组织活检标本中的梅毒螺旋体（Treponema pallidum, TP）,观察其在各期梅毒、不同皮损中的表达数量及分布情况,并与血清学试验等经典方法进行比较,旨在探讨使用免疫组化的方法检测梅毒螺旋体以协助梅毒诊断的可行性及优势,并试图阐述其应用前景。方法：共收集到浙江大学附属邵逸夫医院2004年1月-2012年5月期间,14例梅毒血清阳性患者或窗口期疑似病人的病损组织活检标本共20份,包括一期梅毒4例,标本6份;二期梅毒8例,标本10份;三期梅毒2例,标本4份,其中三份来自同一位患者,其标本组织学表现不支持梅毒。回顾患者基本信息,包括如年龄、性别、临床病损、梅毒血清学试验结果及活检组织的HE染色病理表现等。采用梅毒螺旋体为特异抗体的免疫组化法检测病损组织中的螺旋体,并记录染色阳性的螺旋体数量和分布特点。分析总结螺旋体在病损组织的表达数量与疾病分期、临床病损之间的关系,以及治疗前后螺旋体数量的变化。采用SPSS17.0, Spearman相关分析的统计学方法,检验患者RPR滴度与其组织标本内梅毒螺旋体数量之间的相关性。结果：采用梅毒螺旋体为特异抗体的免疫组化法检测病损组织中的螺旋体表达,总阳性率为80%。6份来自4例1期梅毒病人的标本中,5份TP-IHC染色呈阳性表达（阳性率83.3%）,1份TP-IHC染色阴性的标本为梅毒直肠炎患者正规治疗后直肠活检标本。10份来自8例2期梅毒病人的标本中,10份TP-IHC染色均呈阳性表达（阳性率达100%）。4份来自2例3期梅毒病人的标本,1份TP-IHC染色呈阳性表达（阳性率25%）,3份TP-IHC染色阴性的标本来自1例梅毒血清阳性合并HIV的患者,其病损临床及病理诊断为嗜酸细胞增多性皮病,而非梅毒相关性病损。各期梅毒病人标本阳性诊断符合率、阴性诊断符合率均为100%。染色阳性的梅毒螺旋体在组织中的分布情况：1期梅毒皮肤组织标本中梅毒螺旋体主要位于表皮下部近基底细胞层、真皮血管周围;直肠粘膜标本中主要位于近浆膜层一侧,组织内及血管周围。2期梅毒标本,皮肤组织标本中梅毒螺旋体主要位于表皮全层、附属器周围、真皮血管周围;淋巴结活检标本中梅毒螺旋体主要位于滤泡周围的炎性肉芽组织中。一份3期梅毒皮肤组织标本的血管内见螺旋体分布。染色阳性的标本内螺旋体数量与临床病损有一定相关性：硬下疳、扁平湿疣皮损活检标本及梅毒性直肠炎患者肠镜活检标本中螺旋体数量最多;鳞屑性红斑、蜊壳样斑块、三期梅毒胸壁溃疡皮肤活检标本中梅毒螺旋体表达量中等;梅毒性淋巴结炎标本中螺旋体数量最少。1例梅毒性直肠炎患者,治疗前后肠镜活检标本的免疫组化检测结果提示,治疗前螺旋体阳性,治疗后检测阴性。1例二期梅毒蜊壳样斑块患者,卞星青霉素足疗程治疗前后标本中均发现螺旋体存在,且表达量均为中等。分析梅毒患者血清RPR滴度和TP-IHC染色结果的关系发现螺旋体数量与RPR滴度间无相关性（P＞0.05）。讨论与结论：采用梅毒螺旋体为特异抗体的免疫组化法检测组织中梅毒螺旋体表达有助于梅毒的诊断。本研究表明,该方法的阳性预测值、阴性预测值均达100%,由此认为,使用梅毒螺旋体为特异抗体的免疫组化法诊断梅毒病损特异性非常高,可用于协助梅毒诊断。各期梅毒患者包括窗口期疑似患者的螺旋体免疫组化法染色阳性,且早期梅毒患者皮损中螺旋体数量较多,提示该方法敏感性很高,体现了该方法在诊断早期梅毒中的优势,尤其对诊断早期血清尚未阳性的梅毒有很大帮助。一例一期梅毒直肠炎患者直肠活检标本免疫组化法检测梅毒螺旋体,治疗前阳性,治疗后阴性,提示该方法可以用于驱梅治疗的疗效评估。一例二期梅毒蜊壳样斑块患者,卞星青霉素足疗程治疗前后标本中螺旋体含量相当,表明患者对青霉素治疗反应差。因此认为,该方法可用于梅毒治疗效果的监测及对复发梅毒的判断。此外,梅毒螺旋体在皮损中的分布情况为,主要位于表皮、真皮血管周围,即其分布符合亲表皮、亲血管内皮和炎性肉芽组织三种方式。结论： 1,用梅毒螺旋体为特异抗体的免疫组化法检测病损组织中梅毒螺旋体的方法敏感性很高,特异性很强,可明显提高临床梅毒诊断阳性率;2,染色阳性的梅毒螺旋体在组织中的分布主要以亲表皮、亲血管内皮细胞和炎性肉芽组织中为特点,且表达数量与RPR滴度无关;3,该方法有利于临床难确诊病例如血清尚阴性的早期疑似梅毒、RPR滴

关键词：梅毒梅毒螺旋体免疫组化法

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梅毒螺旋体血凝试剂盒的研制

中国生物制品学杂志 1991年第1期4卷 25-28页

作者：张昆范亚民王薇媛沈荣李安敏周学良辜清吾新疆地方病防治研究所乌鲁木齐830002 卫生部兰州生物制品研究所中国药品生物制品检定所

以超声波处理的梅毒螺旋体为抗原,致敏经醛化、鞣化处理的绵羊红血球,应用血凝试验检测梅毒患者血清中梅毒螺旋体特异性抗体。同时以国际上公认的标准方法——FTA-ABS作为对照试验。共检测1125份血清(其中梅毒血清205份,非梅毒血清920... 详细信息

以超声波处理的梅毒螺旋体为抗原,致敏经醛化、鞣化处理的绵羊红血球,应用血凝试验检测梅毒患者血清中梅毒螺旋体特异性抗体。同时以国际上公认的标准方法——FTA-ABS作为对照试验。共检测1125份血清(其中梅毒血清205份,非梅毒血清920份).两种方法检测结果完全相符,即敏感性皆为100％,血凝试验的特异性为99％。

关键词：梅毒密螺旋体梅毒螺旋体血凝试验

梅毒螺旋体通过内源性与外源性凋亡途径抑制人中性粒细胞凋亡

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梅毒螺旋体通过内源性与外源性凋亡途径抑制人中性粒细胞凋亡

作者：王建业南华大学

学位级别：硕士

目的:梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)是一种能够引起隐性感染的性传播病原体。虽然中性粒细胞通常存在于早期梅毒阶段的皮损中,但这种先天性免疫细胞在Tp感染中的作用几乎没有受到研究者的广泛关注。中性粒细胞是一种寿命较短的细胞... 详细信息

目的:梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)是一种能够引起隐性感染的性传播病原体。虽然中性粒细胞通常存在于早期梅毒阶段的皮损中,但这种先天性免疫细胞在Tp感染中的作用几乎没有受到研究者的广泛关注。中性粒细胞是一种寿命较短的细胞,可发生自发性凋亡,而且中性粒细胞的吞噬作用能够加速这一过程。本研究以人多形核中性粒细胞(human polymorphonuclear neutrophils,hPMNs)为研究对象,初步探索在体外hPMNs对Tp的吞噬作用和Tp对hPMNs凋亡的影响。方法:1.将Tp接种于新西兰兔的睾丸内,经传代培养后提取Tp,采用镀银染色、暗视野显微镜观察Tp的形态,以此获取有活力的Tp。2.抽取健康成年人静脉血,采用人中性粒细胞分离液分离并纯化外周血中的hPMNs,使用荧光染料对细胞核染色检测hPMNs纯度;使用改良牛鲍计数板对hPMNs计数;使用台盼蓝染色检测hPMNs活性。***感染hPMNs后,采用免疫荧光技术观察hPMNs吞噬Tp的情况。***感染hPMNs后,采用流式细胞术检测hPMNs的凋亡率;使用瑞氏-姬姆萨复合染液对细胞核染色,显微镜检测hPMNs凋亡的核型态变化;使用TUNEL检测液检测hPMNs的细胞核DNA的断裂情况。***感染hPMNs后,Western Blot检测hPMNs中的cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白表达情况;caspase酶活性检测试剂盒检测caspase-3、caspase-8和caspase-9的酶活性变化。***预感染hPMNs后,分别加入内源性凋亡诱导剂星形孢菌素(Staurosporine,STS)与外源性凋亡诱导剂抗Fas单克隆抗体(anti-Fas Ig M),流式细胞术检测hPMNs的凋亡率;Western Blot检测cleaved caspase-3的表达情况;caspase酶活性检测试剂盒检测caspase-3、caspase-8和caspase-9的酶活性变化。7.将Tp加热灭活后刺激hPMNs,流式细胞术检测hPMNs的凋亡率。***感染hPMNs后提取上清液,ELISA试剂盒检测IL-8的浓度。使用提取的上清液再培养新鲜分离的hPMNs,流式细胞术检测hPMNs的凋亡率。结果:***感染hPMNs后,荧光显微镜观察到在体外感染实验中hPMNs能够吞噬Tp,自体人血清调理后能够明显促进hPMNs对Tp的吞噬作用。***感染hPMNs后,以浓度依赖性方式抑制hPMNs凋亡,并且Tp抑制hPMNs凋亡不依赖于调理作用。***感染hPMNs后,TUNEL法检测结果显示,与对照组相比,Tp感染组中TUNEL阳性的细胞数量明显减少。瑞氏-姬姆萨染色后观察发现,Tp感染组中含有凋亡核形态的hPMNs数量较少。***感染hPMNs后,Tp能够下调hPMNs内cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9的蛋白表达水平,同时降低caspase-3、caspase-8和caspase-9的酶活性。5.凋亡诱导剂anti-Fas Ig M与STS刺激hPMNs后,分别上调cleaved caspase-8与cleaved caspase-9的蛋白表达,caspase-8和caspase-9的酶活性明显升高。并且两种凋亡诱导剂都能够上调cleaved caspase-3蛋白表达,caspase-3的酶活性升高,并促进细胞凋亡。而在Tp感染组中,加入凋亡诱导剂后,Tp延缓了以上结果的发生。6.热灭活的Tp感染hPMNs后,结果显示死菌仍然能够抑制hPMNs凋亡。***感染hPMNs后,以时间和浓度依赖性方式促进hPMNs分泌IL-8,并且不依赖于调理作用和Tp的活性。***与hPMNs共培养后的上清液再培养hPMNs,hPMNs的凋亡率显著降低,而抑制上清液中IL-8活性后,hPMNs的自发凋亡率无明显变化。结论:1.血清调理作用促进hPMNs吞噬Tp。***通过内源性凋亡途径与外源性凋亡途径抑制hPMNs凋亡。***通过诱导hPMNs分泌IL-8是其延长hPMNs寿命的潜在机制。

关键词：梅毒螺旋体中性粒细胞吞噬细胞凋亡 IL-8