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桃潜隐花叶类病毒中国分离株P_3的克隆与序列分析

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植物病理学报 2005年第4期35卷 300-304页

作者：徐文兴王国平何云蔚洪霓华中农业大学植物科技学院武汉430070

本研究以提取的类病毒cRNA为模板,采用RT-PCR方法,从5株表现明显花叶症状的'雨花露'桃树上检测到桃潜隐花叶类病毒(PLMVd),并对其中的样品P3通过2次RT-PCR扩增,然后分别将扩增产物回收、克隆测序,确定了该分离株(命名为PLMVd-P3分离株)... 详细信息

本研究以提取的类病毒cRNA为模板,采用RT-PCR方法,从5株表现明显花叶症状的'雨花露'桃树上检测到桃潜隐花叶类病毒(PLMVd),并对其中的样品P3通过2次RT-PCR扩增,然后分别将扩增产物回收、克隆测序,确定了该分离株(命名为PLMVd-P3分离株)的全长核苷酸序列,其cDNA分子全长为337 nt,这与已经报道的PLMVd典型分离株基因组大小相似.序列比较分析结果表明,该分离株与已经报道的不同地区来源的其它分离株相似性为90%～96%.

关键词：桃潜隐花叶类病毒 RT-PCR 克隆序列生物学特性

桃潜隐花叶类病毒茎环结构变异对复制及转运影响的研究

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桃潜隐花叶类病毒茎环结构变异对复制及转运影响的研究

作者：罗帅东北林业大学

学位级别：硕士

RNA二级结构是RNA发挥生物学功能的关键因子。茎环结构是类病毒RNA二级结构中的关键结构,不同碱基组成可形成不同的空间结构,影响环区与不同的细胞因子或蛋白相结合,从而影响其生物学功能。本研究鉴定了一个桃潜隐花叶类病毒(Peach late... 详细信息

RNA二级结构是RNA发挥生物学功能的关键因子。茎环结构是类病毒RNA二级结构中的关键结构,不同碱基组成可形成不同的空间结构,影响环区与不同的细胞因子或蛋白相结合,从而影响其生物学功能。本研究鉴定了一个桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid,PLMVd)分离物,并以此为基础,通过制备关闭不同茎环结构的突变体,利用原位杂交技术和荧光定量PCR技术分析关闭不同茎环结构对类病毒复制及转运的影响。主要内容如下:(1)以桃叶片为实验材料,提取总RNA,通过常规RT-PCR方法扩增得到339 bp特异性条带,经克隆、测序,结果显示其与GenBank中已报道的桃潜隐花叶类病毒分离物的同源性为96-100%。系统发育树分析显示,此分离物与美国桃潜隐花叶类病毒亲缘关系较近,而与希腊和土耳其分离物亲缘关系较远。在进化树中,不同地域分离物间较分散,未见明显地理相关性。(2)通过设计突变引物,利用定点突变试剂盒,获得包含关闭不同茎环结构的桃潜隐花叶类病毒的质粒。再通过体外转录技术,将闭环突变体质粒体外转录成类病毒RNA,从而获得可能具有侵染能力的关闭不同茎环结构的桃潜隐花叶类病毒突变体。(3)以健康的烟草叶片为实验材料,避光酶解;筛网过滤,通过W5溶液清洗离心后悬浮于MMg溶液中,再利用聚乙二醇法(PEG)将突变体导入原生质体中,经培养后提取RNA,利用荧光定量PCR技术分析类病毒的复制能力。(4)将病毒突变体通过摩擦接种法接种到健康的烟草幼苗上,分别取不同叶片组织为实验材料,制备石蜡切片,通过原位杂交以及全组织原位杂交方法检测病毒在组织中的分布。最后通过结合荧光定量PCR与原位杂交结果,综合分析显示关闭茎环结构后,Loop7的转运和复制均未受到影响;Loop1、6、10、12、17、18、19、20转运功能受到破坏。这些环大部分集中在基因组的可变区和右端区,以及致病区和中心区之间的连接处。关闭茎环结构后,Loop5、11、14、16转运功能部分受到破坏;Loop4、8、9、13、15复制功能受到破坏;Loo2、Loop3复制能力减弱。

关键词：桃潜隐花叶类病毒 RNA转运突变原位杂交实时定量RT-PCR

桃潜隐花叶类病毒RT-PCR和分子杂交检测技术的建立

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植物检疫 2005年第5期19卷 268-271页

作者：徐文兴王国平洪霓华中农业大学植物科技学院武汉430070

本研究从武汉周边采集表现典型花叶症状的桃样品,提取总RNA为模板,采用RT-PCR方法对这些样品进了分析,结果显示所分析的5个样品(P1～P5)均获得了预期大小约为337bp的目标扩增条带,表明样品均带有PLMVd.通过回收RT-PCR产物,用生物素标记... 详细信息

本研究从武汉周边采集表现典型花叶症状的桃样品,提取总RNA为模板,采用RT-PCR方法对这些样品进了分析,结果显示所分析的5个样品(P1～P5)均获得了预期大小约为337bp的目标扩增条带,表明样品均带有PLMVd.通过回收RT-PCR产物,用生物素标记制备探针,分别采用DNA斑点杂交、RNA斑点杂交和组织印迹杂交3种杂交方法对这些样品进行检测比较,3种杂交方法中,组织印迹杂交操作步骤相对简单快捷,适合于对PLMVd进行大田快速检测.

关键词：桃潜隐花叶类病毒 RT-PCR 分子杂交

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桃潜隐花叶类病毒的鉴定

中国果树 2000年第1期 30-31页

作者：张少瑜张尊平洪霓王国平中国农业科学院果树研究所辽宁兴城125100

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桃树病毒病研究现状与防控对策

中国果业信息 2013年第10期30卷 80-81页

作者：李世访卢美光中国农业科学院植物保护研究所

【导读】近年来，桃树病毒的侵染日益严重，严重影响了桃产业的正常发展。目前．桃树上已经报道的病毒和类病毒病原主要有苹果褪绿叶斑病毒、李属坏死环斑病毒、李痘病毒、李矮缩病毒、樱桃绿环斑驳病毒、杏假褪绿叶斑病毒和李树皮坏死... 详细信息

【导读】近年来，桃树病毒的侵染日益严重，严重影响了桃产业的正常发展。目前．桃树上已经报道的病毒和类病毒病原主要有苹果褪绿叶斑病毒、李属坏死环斑病毒、李痘病毒、李矮缩病毒、樱桃绿环斑驳病毒、杏假褪绿叶斑病毒和李树皮坏死茎纹孔伴随病毒、桃潜隐花叶类病毒和啤酒花矮化类病毒等。

关键词：病毒病桃树防控对策苹果褪绿叶斑病毒桃潜隐花叶类病毒矮化类病毒环斑病毒斑驳病毒

PLMVd分离物的致病性鉴定及其后代分子特性分析

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PLMVd分离物的致病性鉴定及其后代分子特性分析

作者：康彦平华中农业大学

学位级别：硕士

桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid, PLMVd)是危害桃等核果类果树的一类重要病原物,导致产量降低,品质下降,树势衰退。PLMVd在桃树上可引起叶片表现花叶、褪绿和白化等症状。我们前期调查发现,我国许多栽培桃上发生一种新的... 详细信息

桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid, PLMVd)是危害桃等核果类果树的一类重要病原物,导致产量降低,品质下降,树势衰退。PLMVd在桃树上可引起叶片表现花叶、褪绿和白化等症状。我们前期调查发现,我国许多栽培桃上发生一种新的疑似PLMVd的病害,该病在多数桃树上表现沿叶脉褪绿和沿叶缘褪绿症状,在少数桃树上还表现出黄化症状,但这些症状是否由PLMVd引起不明确。本文对从田间发病植株上分离得到的PLMVd分离物进行体外构建侵染性RNA,接种GF305实生苗并与PLMVd进行症状比较分析,并对相关分离物的分子变异进行了研究。主要结果如下： 1、以来源于田间表现沿叶脉褪绿、沿叶缘褪绿症状和黄化的5个PLMVd分离物的优势分子变种克隆(DXH-2-1、DXH-14-1、DXH-12-1、DXH-5-1和WH-5-3)为试材,将该类病毒cDNA进行二聚体化连接至pGEM-18T载体,体外转录获得PLMVd二聚体RNA,温室内机械接种至桃GF305实生苗,接种后进行症状观察和RT-PCR鉴定。RT-PCR检测表明,接种15d后,5个分离物均可检测到。接种150d后,DXH-14-1和DXH-12-1表现沿叶缘褪绿症状,DXH-5-1表现轻微黄化症状,WH-5-3前期表现严重的黄化症状,后期转变为白化症状,这些症状均与PLMVd田间发病相同,表明我国桃树上沿叶缘褪绿和黄化症状系由PLMVd引起。DXH-2-1接种后一直没有表现症状,而该分离物来源于田间表现沿叶脉褪绿症状的病株,初步推测沿叶脉褪绿的症状不是由PLMVd引起。 2、对GF305实生苗中PLMVd接种后代进行了克隆测序,每个分离物选取10个克隆进行了序列分析,结果显示,各后代序列与原始序列的同源率分别为97.9-98.8%、97.9～98.5%、97.6～98.8%、99.4-100%和97.6-99.7%。在分离物DXH-5-1和WH-5-3后代序列中可以发现2-4个亲本序列或与亲本高度近似的序列(少于2个突变位点),而分离物DXH-2-1、DXH-14-1和DXH-12-1后代序列与亲本序列相比发现有4-7个突变位点。结果表明所有接种序列均在寄主内发生了变异,推测这可能是造成DXH-14-1和DXH-12-1接种植株未全部表现出与田间相同症状的原因,但接种不同序列后代变异程度存在差异的原因有待进一步研究。在PLMVd各后代序列中均发现了重组序列,数量为1-7个,PLMVd A环(203-208nt之间)上的6个碱基被完整替换为寄主的17个碱基,在原来的位置形成新的颈环结构。为排除变异和重组因体外构建侵染性RNA操作造成的可能,本研究选取DXH-14-1和DXH-12-1进行体外转录和转录产物的序列测定分析,结果显示经过转录、RT-PCR后后代序列变异程度远低于体内获得的变异。 3、为进一步了解PLMVd的分子变异规律,将以上5个分离物及分离物DXH-3-1的克隆体外合成带粘性末端的单体cDNA,接种金水二号梨离体植株,对各分离物子代序列分析表明,接种后代碱基突变的位置主要分布在Loop A、PST I臂和第150nt,各分离物后代序列与原始序列完全相同的数目分别为6(DXH-3-1)、0(DXH-2-1)、11(DXH-14-1)、1(DXH-12-1)、1(DXH-5-1)和19(WH-5-3)。而在分离物DXH-3-1、DXH-2-1、DXH-14-1、DXH-12-1、DXH-5-1和WH-5-3的变异序列间分别有1、18、8、0、8和0个子代序列与原始序列表现出很高的同源率(≥99%),且分子内的同源率分别为97.9-100.0%、97.9-100.0%、96.9-100.0%、97.3～100.0%、98.6～100.0%和98.6～100.0%。

关键词：类病毒桃潜隐花叶类病毒病原鉴定分子变异

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来源于桃的PLMVd克隆和序列分析

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