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抗bcr/abl mRNA特异性核酶作用于靶基因的细胞内外切割实验

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复旦学报（医学版） 2003年第3期30卷 259-262页

作者：陈波斌林果为陆华中范华骅郭荣肖娟高跞高峰复旦大学附属华山医院血液科上海200040 上海市血液中心上海200051

目的将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr/abl mRNA的含核酶载体,进行细胞内外实验,了解抗bcr/abl mRNA核酶的切割效应。方法含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后,其中抗CML核酶M1-GS RNA的DNA序列被构建到pUC1... 详细信息

目的将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr/abl mRNA的含核酶载体,进行细胞内外实验,了解抗bcr/abl mRNA核酶的切割效应。方法含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后,其中抗CML核酶M1-GS RNA的DNA序列被构建到pUC19上得到pGS210,并经酶切和测序鉴定;合成bcr/abl融合位点前后的一段靶序列,克隆到pGEM-7zf(+)上得到p bcr-abl经测序鉴定,将pGS210和p bcr-abl进行体外转录,获得 M1-GS RNA及其作用底物,将两者混合、孵育,通过放射自显影术检测切割的效果;将pAVGS4转染到CML细胞株K652细胞内,通过RT-PCR方法了解核酶对于目标 RNA的作用效应。结果 p bcr-abl经酶切电泳及测序证实载体中含有目标序列,Ml-GS RNA作用于底物后,放射自显影术检测显示底物 RNA被有效切割。pAVGS4转染到K562细胞48和72h后,RT-PCR显示bcr/abl mRNA被有效切割。结论 pAVGS4可以有效地切割K562细胞内的bcr/abl mRNA,预期可作为CML分子靶向治疗的工具。

关键词： bcr/abl 核酶 RNA 细胞内 CML bcr-abl 抗b 酶切测序底物

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核酶对靶RNA的体外切割反应的计算机分析

生物化学与生物物理学报 1996年第3期28卷 279-285页

作者：陆长德陈农安祁国荣中国科学院上海生物化学研究所

我们用计算机分析了锤头结构核酶的体外切割反应。计算了反应中△Ｅｓ’，△Ｅｒ’和△Ｅ三种假设的能量变化，△Ｅｓ’是底物从最稳态转变为松弛状态所需要的能量，△Ｅｒ’是核酶从最稳态转变为松弛状态所需要的能量；△Ｅ是由松弛状... 详细信息

我们用计算机分析了锤头结构核酶的体外切割反应。计算了反应中△Ｅｓ’，△Ｅｒ’和△Ｅ三种假设的能量变化，△Ｅｓ’是底物从最稳态转变为松弛状态所需要的能量，△Ｅｒ’是核酶从最稳态转变为松弛状态所需要的能量；△Ｅ是由松弛状态的核酶和底物相互作用时的能量降低。我们发现，△Ｅｓ’或△Ｅｒ’高则反应切割效率低，而△Ｅ则既与反应切割效率又与反应的最适温度有关。△Ｅｓ’，△Ｅｒ＇和△Ｅ可以根据核酶和废物的核苷酸序列进行计算，因此我们的模型可以用于核酶的设计。

关键词：核酶计算机分析

核酶阻断per1表达对吗啡成瘾小鼠海马c-fos转录及表达的影响

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航天医学与医学工程 2005年第2期18卷 151-153页

作者：刘英辉彭涛陈立国肖静王正荣刘延友四川大学基础与法医学院生物化学与分子生物学教研室四川成都610041 四川大学基础与法医学院生物医学工程研究室四川成都610041 天津市儿童医院检验科天津300074

目的研究用特异性核酶阻断生物节律基因per1的表达对吗啡成瘾小鼠海马c-fos基因转录及表达的影响。方法制备吗啡成瘾小鼠模型,向小鼠脑室内注射脂质体包裹的重组质粒pcDNA3.1—per1RZDNA,在脑内产生特异性核酶-per1RZ,阻断小鼠脑内生物... 详细信息

目的研究用特异性核酶阻断生物节律基因per1的表达对吗啡成瘾小鼠海马c-fos基因转录及表达的影响。方法制备吗啡成瘾小鼠模型,向小鼠脑室内注射脂质体包裹的重组质粒pcDNA3.1—per1RZDNA,在脑内产生特异性核酶-per1RZ,阻断小鼠脑内生物节律基因per1的表达。作脑组织冰冻切片,用原位杂交和免疫组化法测定小鼠海马c-fos基因转录及表达的变化。结果per1RZ能使吗啡成瘾小鼠海马的c-fos基因转录及表达明显减弱。结论重组质粒表达的per1RZ可以干扰生物节律基因per1的表达,抑制海马c-fos基因的转录和表达,从而控制吗啡成瘾的发生。

关键词：基因控制基因表达核酶节律基因 c—fos per1 吗啡成瘾

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人端粒酶逆转录酶核酶抑制端粒酶活性

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第3期34卷 323-328页

作者：屈艺刘菽秋彭文珍刘柏林四川大学华西基础医学院分子生物学开放实验室四川大学华西基础医学院分子生物学开放实验室成都610041

为有效切割端粒酶逆转录酶mRNA以降低端粒酶活性 ,从而使肿瘤细胞生长变慢 ,凋亡增加。设计并合成了针对端粒酶逆转录酶mRNA的锤头状核酶基因 ,构建了该核酶基因的体外转录和真核表达质粒。检测了该核酶对端粒酶逆转录酶mRNA的体外切割... 详细信息

为有效切割端粒酶逆转录酶mRNA以降低端粒酶活性 ,从而使肿瘤细胞生长变慢 ,凋亡增加。设计并合成了针对端粒酶逆转录酶mRNA的锤头状核酶基因 ,构建了该核酶基因的体外转录和真核表达质粒。检测了该核酶对端粒酶逆转录酶mRNA的体外切割效力。并将该核酶基因转染至肿瘤细胞中 ,检测其对肿瘤细胞端粒酶活性和生物学性状的影响。结果表明 ,该核酶在体外和细胞内均能有效切割端粒酶逆转录酶mRNA ;在细胞内能明显抑制端粒酶活性 ,使细胞生长变慢 ,倍增时间延长。因而 ,该核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂 ,在抑制肿瘤生长中发挥作用

关键词：核酶端粒酶人端粒酶逆转录酶肿瘤

抗人组织金属蛋白酶抑制剂-1核酶的体外制备和活性鉴定

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第4期35卷 387-390页

作者：汪滋民吴建明林子豪江华宋宇虎金由辛中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031 上海200433 上海200433 上海200433 上海200031 上海200031 第二军医大学附属长征医院整形外科第二军医大学附属长征医院整形外科第二军医大学附属长征医院整形外科第二军医大学附属长征医院整形外科中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200433

研究了特异切割人瘢痕组织中组织金属蛋白酶抑制剂 1(tissueinhibitorofmetalloproteinases 1,TIMP 1)的锤头状核酶 ,测定了其体外切割活性。制备特异切割TIMP 1的U6snRNA嵌合型核酶基因克隆。TIMP 1mRNA基因片段克隆至T载体。用体外... 详细信息

研究了特异切割人瘢痕组织中组织金属蛋白酶抑制剂 1(tissueinhibitorofmetalloproteinases 1,TIMP 1)的锤头状核酶 ,测定了其体外切割活性。制备特异切割TIMP 1的U6snRNA嵌合型核酶基因克隆。TIMP 1mRNA基因片段克隆至T载体。用体外转录法大量制备以 [α 3 2 P]UTP标记的核酶及靶RNA ,进行体外切割实验。结果表明 :核酶∶底物 =1∶1时 ,活性的U6snRNA嵌合型核酶 (U6Rz35 8)在 5 0℃具有最佳切割活性 ,切割效率为 76 .34% ;37℃时 ,切割效率为 5 5 .2 1%。5 0℃时 ,Km=39.6nmol/L ,kcat=0 .2 1min-1;而点突变型核酶U6Rz35 8m 没有切割活性。制备的U6 Rz35 8有良好的特异切割活性 ,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP 1的表达。

关键词： TIMP-1 核酶转录克隆

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核酶核糖开关在基因治疗中的应用及挑战

药学学报 2014年第11期49卷 1504-1511页

作者：冯婧娴王佳稳林俊生刁勇华侨大学分子药物研究院生物医学学院福建泉州362021

在临床应用中如何根据病情按时、按需地调控基因表达,是基因治疗亟需解决的关键问题。核酶核糖开关具有基因表达水平的可调节性、结构的可组装性和靶基因的特异性等特点,是一种非常有应用前景的配体控制型基因调控系统。最新研究显示,... 详细信息

在临床应用中如何根据病情按时、按需地调控基因表达,是基因治疗亟需解决的关键问题。核酶核糖开关具有基因表达水平的可调节性、结构的可组装性和靶基因的特异性等特点,是一种非常有应用前景的配体控制型基因调控系统。最新研究显示,核酶核糖开关不仅能调控哺乳动物细胞的转基因表达,还能调控细胞功能与命运。已建立的高通量筛选平台,不仅可以在微生物宿主中快速优化核酶核糖开关,还可将选定的活性序列元件直接应用于哺乳动物细胞。另外,可定量评价核酶核糖开关性能的数学模型的成功建立,为其前瞻性合理设计奠定了基础。但是,核酶核糖开关在基因治疗的成功应用,仍有赖于调节元件的优化设计和调控配体的生物相容性等关键问题的解决。

关键词：基因治疗表达调控核糖开关核酶

DNA核酶的分类、筛选及主要应用的研究进展

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食品工业科技 2023年第1期44卷 413-419页

作者：范云庭林筱钧郑江薄军黄将远集美大学水产学院福建厦门361021 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心福建厦门361021 福建省特种水产配合饲料重点实验室福建天马科技集团股份有限公司福建福清350308 自然资源部海洋第三研究所福建厦门361005

DNA核酶是通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)筛选出来的具有催化活性的DNA分子。本文重点综述了DNA核酶的分类、筛选及主要应用。根据其催化作用方式,可将DNA核酶分为... 详细信息

DNA核酶是通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)筛选出来的具有催化活性的DNA分子。本文重点综述了DNA核酶的分类、筛选及主要应用。根据其催化作用方式,可将DNA核酶分为切割类、连接类、磷酸化类和其他类,其中切割类和连接类占的比例较大。目前DNA核酶的底物主要还是以核酸居多。DNA核酶的筛选主要是采用生物素-链霉亲和素法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法来分离有催化活性的DNA分子。目前DNA核酶在金属离子检测、基因治疗和DNA分子加密系统中都呈现出较好的应用前景。

关键词： DNA 核酶分类筛选指数富集的配体系统进化技术(SELEX)

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底物和核酶的序列对核酶作用的影响

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1997年第1期29卷 61-68页

作者：宋任涛李洁金海翎张庆琪许政皑中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室 200032

两个分别由3个单价核酶RZ1、RZ3和RZ4按不同的顺序串联而构成的三价核酶RZ134和RZ413,都能在体外分别专一切割烟草花叶病毒(TMV)RNA上3个不同位置的底物序列,对各个底物的切割效率及专一性与其相应的单价核酶相似。当3个核酶底物混合后... 详细信息

两个分别由3个单价核酶RZ1、RZ3和RZ4按不同的顺序串联而构成的三价核酶RZ134和RZ413,都能在体外分别专一切割烟草花叶病毒(TMV)RNA上3个不同位置的底物序列,对各个底物的切割效率及专一性与其相应的单价核酶相似。当3个核酶底物混合后被再作用时,三价核酶只表现出明显的单元核酶RZ4的活性,而其他2个单元核酶RZl和RZ3的活性大大减弱。这种活性的减弱是由于RZ1和RZ3所对应的底物BT2(+)和BT2(-)在靶区形成了双链,从而阻碍了RZ1和RZ3核酶序列与二者形成切割所必需的空间结构。此外,还意外发现了RZ1对BT4(-)的多位点切割作用。

关键词：核酶三价核酶 RNA结构催化活性

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核酶在细胞外切割HCV核心区RNA的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2001年第3期21卷 318-320页

作者：丁芹龚国忠郑宣鹤游学科湖南医科大学附属第二医院肝病研究中心湖南医科大学附属第二医院医学实验中心分子生物室

目的　研究核酶在细胞外切割HCV的作用。方法　设计核酶cDNA序列。构建核酶重组质粒及HCV核心区基因cDNA重组质粒。分别进行体外转录 ,并加入γ 3 2 PATP以标记HCVRNA。将核酶RNA、HCV核心区RNA、RNA酶抑制剂及反应缓冲液混合温育 ,以核... 详细信息

目的　研究核酶在细胞外切割HCV的作用。方法　设计核酶cDNA序列。构建核酶重组质粒及HCV核心区基因cDNA重组质粒。分别进行体外转录 ,并加入γ 3 2 PATP以标记HCVRNA。将核酶RNA、HCV核心区RNA、RNA酶抑制剂及反应缓冲液混合温育 ,以核酶RNA切割HCVRNA。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影来分析结果。结果　β 半乳糖苷酶表型筛选均可见蓝色及白色菌落生长 ;核酶重组质粒直接测序结果见预期核苷酸序列 ;HCV重组质粒限制性酶切分析见 410bp条带。核酶切割反应显示 :反应时间为 15和 30min时可见 45 3、30 7、146nt3条带 ;反应时间为 6 0min时仅见 30 7及 146nt2条带。结论　核酶重组质粒构建成功 ,所设计核酶对HCV有切割作用。

关键词：核酶丙型肝炎病毒基因治疗 RNA 丙型肝炎