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核盘菌γ-谷氨酰磷酸还原酶基因SsGPR1的功能分析

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中国农业科学 2018年第19期51卷 3694-3703页

作者：杜娇王娅波李雪华黄志强杨宇衡毕朝位余洋西南大学植物保护学院

【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘... 详细信息

【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘菌的生长发育与致病机理打下基础,并为作物菌核病的绿色防控提供线索。【方法】通过BLAST进行蛋白同源比对分析,并利用MEGA 5.0软件构建蛋白进化树。通过实时荧光RT-PCR检测SsGPR1在核盘菌菌丝生长、菌核发育和萌发的各个阶段以及致病不同时期的表达模式。根据RNA干扰原理构建SsGPR1的沉默载体,通过PEG介导原生质体转化的方法将沉默载体转入到野生型核盘菌菌株1980中。利用实时荧光RT-PCR鉴定基因沉默转化子,对沉默转化子的菌丝形态、生长速度和菌核形成等表型进行观察,并测定沉默转化子在氧化胁迫条件下的菌丝生长。将沉默转化子分别接种至活体油菜叶片和拟南芥植株,观察并测量病斑大小。通过酸性茚三酮法对沉默转化子中的游离脯氨酸进行测定。【结果】核盘菌SsGPR1全长1 454 bp,编码449个氨基酸,在氨基酸H-N处含有谷氨酰磷酸还原酶结构域。同源比对发现SsGPR1蛋白与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的BC1G3183蛋白和白霉病菌(Sclerotinia borealis)的SBOR215蛋白相似性最高,氨基酸序列一致性分别达95%和94%,系统进化树结果表明三者聚为一个小的分支。SsGPR1在核盘菌菌丝生长时期的表达量较高,在菌核不同发育阶段表达量相近,但均低于菌丝生长时期。SsGPR1在致病时期表达量不断升高,在接种后9 h表达量最高。将SsGPR1基因沉默载体pSIGPR1导入到核盘菌野生型菌株中,并通过实时荧光RT-PCR检测不同转化子中SsGPR1的表达水平,结果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149为SsGPR1基因沉默转化子。沉默转化子在PDA培养基上形成的菌核数量及均重与野生型菌株无显著性差异,且菌核均能萌发形成子囊盘,但菌丝生长稠密,生长速度显著下降。在含有HO的培养基中,SsGPR1基因沉默转化子菌丝生长受到更强的抑制,表明沉默转化子对氧化胁迫更加敏感。SsGPR1基因沉默转化子在活体油菜叶片和拟南芥植株上能引起发病,但病斑面积减小,表明沉默转化子致病力减弱。SsGPR1基因沉默转化子菌丝中的游离脯氨酸含量与野生型菌株相比无显著差异。【结论】SsGPR1与核盘菌的生长和菌丝形态相关,且参与核盘菌对氧化胁迫的抵御及致病过程。

关键词：核盘菌脯氨酸 γ-谷氨酰磷酸还原酶基因沉默致病性氧化压力

核盘菌和灰葡萄孢基因组中的简单重复序列分析

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遗传 2007年第9期29卷 1154-1160页

作者：李伟陈怀谷张爱香陈丽华姜伟丽江苏省农业科学院植物保护研究所南京210014

利用公共的真菌基因组数据库资源,对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)基因组中SSRs的结构类型、分布、丰度及最长序列等进行了系统分析,并与已经研究过的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum),稻瘟病菌(Magna... 详细信息

利用公共的真菌基因组数据库资源,对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)基因组中SSRs的结构类型、分布、丰度及最长序列等进行了系统分析,并与已经研究过的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum),稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和黑粉菌(Ustilago maydis)等几种植物病原真菌基因组中的SSRs进行了比较。结果表明:核盘菌和灰葡萄孢基因组中的SSRs非常丰富,分别为6539和8627个,并且在结构类型和分布规律上具有一定的相似性;与其他几种病原真菌相比,核盘菌和灰葡萄孢基因组中长重复的四、五、六核苷酸基序更为丰富,从而使得这两种真菌具有更高的变异性。同时,我们发现真菌基因组中SSRs的丰度与基因组的大小及GC含量没有必然的关系。文章对核盘菌和灰葡萄孢基因组中SSRs的丰度、出现频率及最长基序的分析为快速、便捷地设计多态性丰富的SSRs引物提供了有益的信息。

关键词：核盘菌灰葡萄孢简单重复序列群体遗传学

核盘菌自噬相关基因SsATG5和SsATG8的功能分析

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植物保护学报 2024年第2期51卷 302-313页

作者：刘勇张宇宇付艳苹谢甲涛姜道宏程家森华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学植物科学技术学院湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室武汉430070

为探究自噬在核盘菌Sclerotinia sclerotiorum致病过程中的作用,利用酵母Saccharomyces自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)编码的蛋白序列比对核盘菌基因组,获得核盘菌假定ATG,并以核盘菌1980菌株为出发菌株,基于同源重组的原理... 详细信息

为探究自噬在核盘菌Sclerotinia sclerotiorum致病过程中的作用,利用酵母Saccharomyces自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)编码的蛋白序列比对核盘菌基因组,获得核盘菌假定ATG,并以核盘菌1980菌株为出发菌株,基于同源重组的原理对假定ATG进行敲除和回补,并测定不同突变体的生长表型和致病能力。结果表明,从核盘菌基因组中比对到2个ATG,分别命名为SsATG5和SsATG8,两者在核盘菌致病过程中均上调表达。SsATG5和SsATG8敲除突变体在菌丝生长、产草酸和侵染垫形成方面与野生型菌株无明显差异,但SsATG5敲除突变体在离体拟南芥Arabidopsis thaliana叶片上的致病力显著下降了约40%,在活体拟南芥植株上的致病力显著下降了约80%,同时SsATG5回补突变体恢复了正常的致病力。表明SsATG5参与了核盘菌的致病过程,证实自噬在核盘菌致病过程中发挥着重要作用。

关键词：核盘菌 SsATG5 SsATG8 自噬致病力侵染垫

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核盘菌角质酶的克隆、表达及活性分析

生物工程学报 2022年第1期38卷 386-395页

作者：吕蕊花史琳娜张喜荣冯昭陕西中医药大学医学技术学院陕西咸阳712046

角质酶可降解脂肪族或芳香族聚酯,对聚对苯二甲酸乙二醇酯也具有较好的降解作用,但目前市面上角质酶产品非常稀缺,因此寻求一种高效表达的角质酶用于工程酶的开发非常有必要。本研究从核盘菌中克隆得到8个角质酶基因,利用PCR结合RT-PCR... 详细信息

角质酶可降解脂肪族或芳香族聚酯,对聚对苯二甲酸乙二醇酯也具有较好的降解作用,但目前市面上角质酶产品非常稀缺,因此寻求一种高效表达的角质酶用于工程酶的开发非常有必要。本研究从核盘菌中克隆得到8个角质酶基因,利用PCR结合RT-PCR技术筛选出主效基因SsCut-52,利用大肠杆菌Escherichia coli BL21将SsCut-52进行异源表达并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化,研究重组酶的特性及其致病性。SsCut-52全长为768 bp,N端有17个信号肽,进化树分析显示其氨基酸序列和葡萄孢属(Botrytis)角质酶同源性最高,和蜡盘菌属(Rutstroemia)角质酶亲缘关系也较近。SsCut-52在核盘菌侵染植物的过程中高效表达,在菌丝形成菌核的过程中表达量也高于其他角质酶基因。异源表达检测结果显示,角质酶以包涵体的形式存在,复性的SsCut-52在pH 6.0时活性最高,比活力达到3.45 U/mg,在pH为4.0–10.0时活性均较高。最适温度为20–30℃,当温度高于50℃时该酶的残余活性低于60%。植物叶片侵染结果表明,SsCut-52对核盘菌侵染板蓝根叶片具有一定的促进作用。

关键词：核盘菌角质酶硝基苯丁酸酯原核表达蛋白活性

核盘菌热休克蛋白Hsp70基因的克隆及功能分析

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生物工程学报 2024年第10期40卷 3677-3688页

作者：吕蕊花杨大群杜雨彤冯昭吕瑞华李依民张岗陕西中医药大学医学技术学院陕西咸阳712046 陕西中医药大学陕西省中医药管理局“秦药”研发重点实验室陕西咸阳712046

为明确核盘菌热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)基因在菌核形成过程中的功能及其与病菌致病力的关系,本研究采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法克隆核盘菌Hsp70基因并进行序列分析,采用实时荧光定量PCR(quan... 详细信息

为明确核盘菌热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)基因在菌核形成过程中的功能及其与病菌致病力的关系,本研究采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法克隆核盘菌Hsp70基因并进行序列分析,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法测定基因在病菌不同生长阶段、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)及低温和高温胁迫下的相对表达量;对Hsp70蛋白进行耐热性检测;通过农杆菌介导法构建Hsp70基因沉默转化菌株,采用离体油菜叶片接种法进行致病力检测,在含腐霉利和甲基托布津药物培养基中进行耐药性检测。结果表明,核盘菌Hsp70基因全长1890 bp,与叶杯菌属(Ciborinia)的Hsp70亲缘关系较高;Hsp70在菌核中表达量最高,为菌丝中的30倍以上,cAMP胁迫显著诱导Hsp70的表达,40℃下,Hsp70表达量呈先升后降再升高的趋势,4℃处理无显著影响;高表达Hsp70的重组菌株耐热性显著增加;核盘菌Hsp70沉默转化子不能形成菌核,其致病力和耐药性均下降。本研究揭示了Hsp70在核盘菌菌核形成及对抗不良环境中发挥重要作用,为下一步深入解析核盘菌Hsp70的生物学功能提供参考。

关键词：核盘菌热休克蛋白表达分析基因沉默致病力

核盘菌侵染对拟南芥表皮蜡质结构及化学组成的影响

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生态学报 2014年第15期34卷 4160-4166页

作者：倪郁宋超王小清西南大学农学与生物科技学院重庆400716

以野生型拟南芥与蜡质突变体cer1、cer4为试验材料,通过研究核盘菌胁迫对拟南芥茎表皮蜡质结构及组分含量的影响,揭示核盘菌侵染与表皮蜡质的关系。扫描电镜结果显示,野生型拟南芥蜡质晶体以垂直于表面的杆状、块状结构为主;突变体cer1... 详细信息

以野生型拟南芥与蜡质突变体cer1、cer4为试验材料,通过研究核盘菌胁迫对拟南芥茎表皮蜡质结构及组分含量的影响,揭示核盘菌侵染与表皮蜡质的关系。扫描电镜结果显示,野生型拟南芥蜡质晶体以垂直于表面的杆状、块状结构为主;突变体cer1晶体类型以水平的松针状、块状结构为主;突变体cer4蜡质晶体以垂直片层结构为主。核盘菌胁迫下,拟南芥蜡质晶体结构及分布形态发生变化。蜡质层结构在核盘菌胁迫下表现为:杆状、松针状蜡质晶体减少—蜡质晶体熔融—表皮"囊状凸起"—表皮膜层破裂。这些结构变化有利于病菌突破角质层屏障而侵入到植株体内。色质谱分析结果显示:与野生型相比,cer1突变体烷、次级醇、酮类显著减少;cer4突变体表现为一级醇含量减少。接种核盘菌后,野生型拟南芥与蜡质突变体一级醇类显著增加(cer1增加不显著);烷类、次级醇类、酮类含量与蜡质总量均显著减少,表明蜡质前体物质在受到核盘菌胁迫后更多地通过酰基还原途径生成一级醇,从而减少了由脱羰基途径所生成的蜡质组分。核盘菌通过改变表皮蜡质晶体结构与化学组分分泌量来促进侵染。

关键词：拟南芥表皮蜡质核盘菌晶体结构蜡质突变体

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核盘菌多糖的理化性质

微生物学报 1995年第2期35卷 103-108页

作者：刘如林王德润于宪潮南开大学微生物系天津300071 南开大学中心实验室天津300071

核盘菌多糖(SSG)是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)通过深层发酵产生的一种胞外多糖,具有潜在的免疫调节活力和明显的抑瘤作用。研究表明,SSG是一种由β-配糖键连接的葡聚糖。在水中溶解缓慢,但粘度较高,并具有良好的流变学性质。... 详细信息

核盘菌多糖(SSG)是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)通过深层发酵产生的一种胞外多糖,具有潜在的免疫调节活力和明显的抑瘤作用。研究表明,SSG是一种由β-配糖键连接的葡聚糖。在水中溶解缓慢,但粘度较高,并具有良好的流变学性质。其特性粘度几乎不随离子强度的变化而改变,在pH1.88—12.26之间,[η]值变化不显著,但当pH值为13.32时,由于分子构象的变化导致[η]值急骤下降。温度≤90℃和热处理对SSG溶液的表观粘度影响不大。

关键词：核盘菌深层发酵核盘菌多糖理化性质

油菜BnJAZ7通过调控抗氧化途径促进核盘菌侵染

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中国农业科学 2024年第19期57卷 3799-3809页

作者：杨浩蓉贾凡胡徐穆蓉刘维娜刘昌云王善之孙现超马冠华陈国康西南大学植物保护学院/植物病害生物学重庆市重点实验室万荣县农业技术推广中心

【目的】由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病是危害油菜生产的第一大病害。通过分子克隆获得甘蓝型油菜BnJAZ7，利用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段，明确甘蓝型油菜BnJAZ7的表达特征及其在核盘菌侵染过... 详细信息

【目的】由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病是危害油菜生产的第一大病害。通过分子克隆获得甘蓝型油菜BnJAZ7，利用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段，明确甘蓝型油菜BnJAZ7的表达特征及其在核盘菌侵染过程中的作用，为油菜抗菌核病分子育种打下理论基础。【方法】利用分子克隆技术扩增BnJAZ7全长，并分析其生物信息学特征，利用MEGA X构建BnJAZ7的亲缘关系树。利用实时荧光定量PCR技术测定BnJAZ7在油菜中的组织表达以及核盘菌侵染过程中的表达特征；构建BnJAZ7与GFP的融合表达载体，在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的亚细胞定位。在本氏烟叶片中瞬时表达融合蛋白，并接种核盘菌，分析BnJAZ7的表达对核盘菌侵染的影响。构建BnJAZ7-OE过表达转基因油菜，在其T2代叶片上接种核盘菌，观察其对核盘菌侵染的影响。利用生化技术检测核盘菌侵染BnJAZ7-OE后抗氧化酶SOD、POD、CAT以及PAL活性；通过实时荧光定量PCR技术分析核盘菌侵染BnJAZ7-OE油菜后相关基因BnSOD、BnPOD、BnPAL和BnCAT的转录水平。【结果】BnJAZ7全长801 bp，编码266个氨基酸，由TIFY和CCT＿2两个结构域组成，分子式为C1244H2000N358O384S13，等电点为9.57，理论分子量为28.53 kDa，不具跨膜结构域。BnJAZ7与油菜TIFY 7的亲缘关系最近，在油菜茎中表达量最高，并且核盘菌侵染后6、12、24、48 h其表达量持续上升。亚细胞定位显示eGFP:BnJAZ7定位于细胞膜和细胞核。在本氏烟叶片中异源瞬时表达eGFP:BnJAZ7促进核盘菌侵染；BnJAZ7过表达的BnJAZ7-OE转基因油菜也促进核盘菌侵染。核盘菌在BnJAZ7-OE植株中侵染后显著降低了BnPOD、BnSOD和BnPAL的转录水平，显著增加了BnCAT的转录水平，从而降低POD、SOD和PAL活性，增加CAT活性。【结论】甘蓝型油菜BnJAZ7的表达受到核盘菌侵染诱导，且BnJAZ7过表达显著加快了核盘菌的侵染速度。核盘菌通过诱导BnJAZ7上升后降低抗氧化酶编码基因BnPOD、BnSOD和BnPAL转录水平、增加BnCAT转录水平，从而调控抗氧化酶活性来进一步加快侵染。

关键词：甘蓝型油菜 BnJAZ7 核盘菌基因表达油菜菌核病抗氧化酶

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1的SSH文库构建

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中国油料作物学报 2011年第2期33卷 157-161页

作者：周晓婴陈松戚存扣江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)对幼苗进行接种,提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正... 详细信息

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)对幼苗进行接种,提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cD-NA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。

关键词：甘蓝型油菜核盘菌抑制消减杂交 cDNA文库