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CCS52A基因与核内复制在新疆野生樱桃李巨细胞发育中的作用

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中国农业大学学报 2018年第7期23卷 43-52页

作者：陈伟阳乔峰马凯王继勋胡建芳中国农业大学园艺学院北京100193 新疆农业科学院园艺作物研究所乌鲁木齐830091

为探究新疆野生樱桃李在接种南方根结线虫形成根结的过程中,线虫建立的取食位点诱导巨细胞形成过程中常出现的核内复制现象的原因,以扦插繁殖的新疆野生樱桃李为材料接种南方根结线虫进一步鉴定其抗性,通过石蜡切片观察根结发育以及核... 详细信息

为探究新疆野生樱桃李在接种南方根结线虫形成根结的过程中,线虫建立的取食位点诱导巨细胞形成过程中常出现的核内复制现象的原因,以扦插繁殖的新疆野生樱桃李为材料接种南方根结线虫进一步鉴定其抗性,通过石蜡切片观察根结发育以及核内复制现象,并分析了相关酶活性变化以及CCS52A基因表达方面的差异。结果显示:新疆野生樱桃李实生群体中大约1/4的个体表现为抗病。抗病植株中的POD、SOD和GLU酶活性在接种南方根结线虫6d时达到峰值并明显高于感病植株,而CHI酶活性在接种后8d达到最高,一直到14d都明显高于感病植株。组织学观察发现,接种后5d巨细胞内可以观察到正在分裂的细胞,到7d巨细胞内细胞核开始聚集,这种状态一直维持到接种后21d。说明接种后5~7d是巨细胞核进行分裂的时期,而7~21d是进行核内复制的主要过程。CCS52A基因在接种后7d也开始大量表达并持续到21d,与核内复制过程正好吻合。同时原位杂交结果也显示CCS52A基因主要在巨细胞中表达。说明CCS52A基因在巨细胞进行的核内复制过程中起作用,其高表达有利于线虫取食位点的成功建立。

关键词：樱桃李南方根结线虫巨细胞核内复制 CCS52A基因

Hsp70与Fzr在昆虫核内复制过程中的互作机制研究

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Hsp70与Fzr在昆虫核内复制过程中的互作机制研究

作者：吴宇婷西南大学

学位级别：硕士

核内复制是一种存在于动植物特定发育阶段特定器官中的特殊细胞周期,也称为核内周期,其主要特征是特定组织的细胞只进行DNA的复制而不能发生胞质分裂,从而形成多倍体细胞。昆虫中研究较多的核内复制器官是幼虫期的家蚕丝腺和果蝇唾液腺... 详细信息

核内复制是一种存在于动植物特定发育阶段特定器官中的特殊细胞周期,也称为核内周期,其主要特征是特定组织的细胞只进行DNA的复制而不能发生胞质分裂,从而形成多倍体细胞。昆虫中研究较多的核内复制器官是幼虫期的家蚕丝腺和果蝇唾液腺。研究表明,支架蛋白Fzr在胚胎发育期的上调表达是细胞从有丝分裂转入核内复制的关键,而幼虫期的稳定表达维持了核内复制的持续进行。尽管已清楚Fzr的蛋白水平是核内复制发生与维持的关键,但其稳定性的调控机制尚不清楚。前期研究中,我们在人胚肾来源的HEK273-FT细胞中鉴定了与Fzr蛋白发生互作的候选蛋白,并重点关注了热激蛋白Hsp70,因为Hsp70可作为分子伴侣参与调控靶蛋白构象及稳定性。本研究中,我们对家蚕及果蝇Fzr与Hsp70的潜在互作关系进行了分析,探索了Hsp70影响Fzr稳定性的机制及其在核内复制中的功能。主要的结果如下:1.家蚕及果蝇的Fzr与Hsp70发生蛋白互作通过序列同源性比对分析,我们获得了家蚕和果蝇基因组注释基因中与人Hsp70基因同源的Hsp70基因。以此为基础,我们构建了家蚕、果蝇和人的Hsp70和Fzr基因的细胞过表达载体,并分别在家蚕BmE细胞、果蝇S2细胞和人HEK293-FT细胞中进行共转染。亚细胞定位分析发现,Hsp70与Fzr都定位于细胞核。我们进一步采用免疫共沉淀(Co-IP)实验对Hsp70和Fzr的蛋白互作关系进行了分析,结果显示家蚕、果蝇和人的Hsp70能分别与Fzr发生蛋白互作,表明两者之间的这种互作具有保守性。利用影响Hsp70蛋白互作的抑制剂PES处理过表达Hsp70和Fzr基因的细胞再进行Co-IP分析,结果显示抑制剂处理可解除两者之间的相互作用。Fzr蛋白通常包含6次重复的WD40结构域,该类结构域主要参与介导蛋白互作。我们采用删除突变的方法对家蚕Fzr蛋白中可能与Hsp70发生互作的WD40结构域进行了分析。首先对WD40结构域依次进行两两删除突变,构建细胞过表达载体并转染家蚕BmE细胞;Co-IP实验表明,1-2和3-4WD40结构域的删除不影响Hsp70与Fzr的互作,但5-6WD40结构域的删除则干扰了两者的互作。进一步对第5个和第6个WD40结构域分别进行删除突变,同时以第3个和第4个WD40结构域的删除突变作为对照,结果表明单独删除第5个或第6个WD40结构域均能抑制Hsp70与Fzr之间的蛋白互作。综合分析表明,Fzr蛋白的第5和第6个WD40结构域介导了Fzr与Hsp70之间的蛋白互作。2.家蚕及果蝇的Hsp70参与调节Fzr蛋白的稳定性考虑到Hsp70蛋白可以参与维持互作蛋白的稳定性,我们进一步分析了Hsp70对Fzr蛋白稳定性的调节作用。基于RNA干涉(RNAi)技术的原理,我们根据家蚕和果蝇Hsp70基因的编码序列设计引物并合成双链RNA(dsRNA),在家蚕BmE细胞和果蝇S2细胞中分别干涉内源Hsp70基因的表达,继而检测过表达外源Fzr蛋白水平的变化。RT-PCR结果显示,Hsp70基因的RNAi不影响Fzr基因的转录表达。Western杂交结果显示,Hsp70的RNAi导致Fzr的蛋白水平显著降低,而受Fzr泛素化修饰降解的参与细胞分裂的细胞周期蛋白Cyclin B的蛋白水平发生积累。综合分析表明Hsp70参与了Fzr蛋白稳定性的维持。我们进一步对Hsp70调控Fzr蛋白稳定性的方式进行了研究。鉴于降低家蚕和果蝇Hsp70基因的表达水平可导致Fzr的蛋白水平下调,而蛋白的泛素化修饰是蛋白降解的重要途径之一,我们因而推测Fzr蛋白水平的这种下调可能是Fzr蛋白发生了泛素化修饰降解。因此,我们开展了细胞水平的体内泛素化实验。Co-IP实验结果显示,家蚕Hsp70基因的RNAi导致Fzr的泛素化修饰水平升高,Fzr的蛋白水平降低;在家蚕BmE细胞中过表达Hsp70基因,结果导致Fzr的泛素化水平降低,但蛋白水平升高。这表明家蚕Hsp70与Fzr间的互作抑制了Fzr的泛素化修饰,进而维持其蛋白稳定性。鉴于蛋白的泛素化修饰降解主要有蛋白酶体和溶酶体途径,我们进而分析了家蚕Fzr蛋白发生泛素化降解的可能途径。利用可抑制蛋白合成的放线菌酮(CHX)处理过表达家蚕Hsp70和Fzr的BmE细胞,Western杂交结果显示,Fzr的蛋白水平随着CHX处理时间的延长而逐渐降低,表明Fzr蛋白发生降解。以此为参照,用CHX处理家蚕BmE细胞12h后,再分别采用蛋白酶体抑制剂(MG132)和溶酶体抑制剂(NH4Cl)进行处理,结果显示MG132处理明显阻碍了Fzr蛋白水平的降低,而NH4Cl处理则对Fzr的蛋白水平无明显影响,这表明家蚕Fzr蛋白的泛素化降解应该是通过蛋白酶体途径。3.Hsp70在果蝇唾液腺细胞核内复制中的功能鉴于Fzr是核内复制细胞周期发生的关键调控因子以及Hsp70参与了Fzr蛋白稳定性的维持,我们进一步利用果蝇中成熟的

关键词：昆虫核内复制 Fzr Hsp70 蛋白相互作用

拟南芥SUD3基因调控核内复制及器官发育的分子机理

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拟南芥SUD3基因调控核内复制及器官发育的分子机理

作者：张怡兰河南大学

学位级别：硕士

器官大小是植物重要的性状之一,探究器官发育分子机制也是一个重要的发育生物学问题。植物器官的大小受到细胞分裂和细胞扩展的调控,在细胞分裂和细胞扩展的过程中,又常常伴随着核内复制。核内复制水平能调控植物器官大小,但是目前核内... 详细信息

器官大小是植物重要的性状之一,探究器官发育分子机制也是一个重要的发育生物学问题。植物器官的大小受到细胞分裂和细胞扩展的调控,在细胞分裂和细胞扩展的过程中,又常常伴随着核内复制。核内复制水平能调控植物器官大小,但是目前核内复制调控植物器官大小的分子机制了解的比较少。在之前报道的研究中,发现DA3基因编码拟南芥中的去泛素化酶UBP14（UBIQUITIN-SPECIFIC PROTEASE14）,它是拟南芥中控制器官大小的一个很重要的基因,其突变体da3-1相较于野生型具有大的子叶,大的花器官及叶片卷曲的表型。同时UBP14与UVI4（ULTRAVIOLETB INSENSITIVE4）相互作用,影响细胞相关周期蛋白的稳定性,进而调控核内复制,最终影响细胞和器官大小的发育。为了进一步了解核内复制与器官大小的具体分子机制,实验人员在da3-1突变体背景下通过EMS诱变分离和鉴定了多个抑制子sud（suppressor of da3-1）。从备选抑制子中我们选择sud3为研究对象,并在sud3-1 da3-1和da3-1之间的杂交F2群体中,通过MutMap方法鉴定sud3-1突变。网上预测发现SUD3包含一个SKIP-SNW结构域,而SKIP（SKI-interacting protein）作为SKI互作蛋白,在酵母到人类的高级生物体中都广泛存在且高度保守,SKIP参与生物钟调控和非生物胁迫,同时SKIP是一个协同调控因子,它可能参与剪切和转录的起始,在酵母中有转录激活活性。我们发现sud3-1能部分抑制da3-1较大的花和种子,并能部分恢复da3-1突变体莲座叶卷曲的表型,这表明DA3和SUD3在一个共同的途径中发挥作用。我们证明,遗传上SUD3抑制了DA3和UVI4在核内复制中的影响。生化结果上,SUD3在体内和体外与UBP14和UVI4都存在相互作用。研究发现SUD3/AtSKIP通过与调节因子UBP14和UVI4的相互作用,以调节核内复制和器官生长。利用遗传、生化和分子生物学技术,结合生物信息学分析,我们探究了SUD3基因对核内复制的调控和其对器官大小的影响,并进一步阐明其可能的作用机理。

关键词：核内复制抑制子 SUD3 DA3 UVI4

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大豆根瘤大小与核内复制关系研究

大豆根瘤大小与核内复制关系研究

作者：米晓慧华中农业大学

学位级别：硕士

根瘤大小是大豆根瘤的重要形态特征并对大豆共生固氮具有重要的意义。研究表明核内复制能够通过增加细胞DNA含量,增大细胞体积进而使植物器官变大。但在大豆中有关大豆根瘤大小与核内复制的关系却并不清楚。本文以496份大豆核心种质为材... 详细信息

根瘤大小是大豆根瘤的重要形态特征并对大豆共生固氮具有重要的意义。研究表明核内复制能够通过增加细胞DNA含量,增大细胞体积进而使植物器官变大。但在大豆中有关大豆根瘤大小与核内复制的关系却并不清楚。本文以496份大豆核心种质为材料,分别在接种快生型根瘤菌SMH12和慢生型根瘤菌USDA110条件下对大豆根瘤重量和细胞核倍性进行测量并分析其相关性,之后利用全基因组关联分析(GWAS)初步鉴定了可能调控根瘤重量及根瘤细胞核内复制的Lead SNP,并对大豆根瘤大小与其细胞的核内复制的关系进行探究。结果如下:1.在同株大豆形成的根瘤中,根瘤越大其内部细胞的核内复制程度越高;2.对于不同的大豆品系而言,根瘤重量与其内部细胞的核内复制呈显著正相关,其中在接种快生型根瘤菌条件下的根瘤重量与细胞的核内复制相关性更高;3.相同接菌条件下核内复制指数(EI)和根瘤重量(NW)存在相同的Lead SNP,而在接种快生型根瘤菌条件下核内复制指数和根瘤重量相同的Lead SNP更多。以上结果表明,大豆根瘤中核内复制程度与根瘤的大小具有显著相关性,并且这种相关性的程度受根瘤菌的影响。后续将通过全基因组关联分析的方法找到调控大豆根瘤大小与核内复制的基因,并对其进行功能鉴定,这将对揭示大豆根瘤大小与核内复制的关系具有重要的意义。

关键词：大豆根瘤大小瘤重核内复制全基因组关联分析

棉花核内复制调控基因GhSPO11-3响应非生物胁迫的功能分析

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棉花核内复制调控基因GhSPO11-3响应非生物胁迫的功能分析

作者：韦珍珍郑州大学

学位级别：硕士

SPO11-3蛋白是真核生物拓扑异构酶VIA同系物之一,具有调控如生长发育与胁迫响应等重要生物学功能。在本实验室已取得的研究结果即通过农杆菌介导的VIGS方法沉默GhSPO11-3,沉默植株系均表现出明显的矮化,细胞尺寸减小以及核内复制障碍等... 详细信息

SPO11-3蛋白是真核生物拓扑异构酶VIA同系物之一,具有调控如生长发育与胁迫响应等重要生物学功能。在本实验室已取得的研究结果即通过农杆菌介导的VIGS方法沉默GhSPO11-3,沉默植株系均表现出明显的矮化,细胞尺寸减小以及核内复制障碍等特征。进一步对沉默植株进行盐胁迫处理得知GhSPO11-3正向调控了植株抗盐耐性为基础。本实验继续通过VIGS方法将目的基因沉默探讨GhSPO11-3是否参与植物抗旱响应,以及利用floar-dip技术在拟南芥中异位超表达GhSPO11-3后,密切观察GhSPO11-3超表达植株与野生型拟南芥植株生长发育和抗逆性的差异,并且进一步揭示GhSPO11-3响应胁迫的可能性机理。本研究为增强棉花抗逆性研究提供了有效的线索,具体结果如下:1.实时荧光定量法(qRT-PCR)鉴定GhSPO11-3在NaCl、Mannitol以及HO和ABA等不同胁迫处理下的表达量。结果显示,GhSPO11-3受到这些胁迫的高度诱导,表明GhSPO11-3极有可能参与了这些胁迫响应。2.通过VIGS技术将GhSPO11-3沉默后发现,沉默植株系(TRV-01)的失水速率较TRV-GFP(TRV-00)以及野生型(WT)要慢,而相对含水量较低。在30天的干旱胁迫处理下,其存活率显著低于对照组植株,且进一步测定植株离体叶片响应胁迫时产生的的渗透保护剂(脯氨酸,可溶性糖)含量以及活性氧清除酶活性发现,TRV-01处于干旱胁迫条件时其渗透调节,活性氧清除能力较差,降低的叶绿素以及增加的丙二醛含量说明TRV-01植株有较强的光合合成能力以及叶片受损程度较深。以上结果进一步证明了GhSPO11-3正向参与了植株响应干旱胁迫过程。3.本实验通过农杆菌介导的floral-dip法在拟南芥中异位超表达GhSPO11-3后发现,超表达植株系表现出增加的DNA倍性,增大的细胞尺寸等。同时发现转基因植株促进叶与根的生长,其叶片面积较大,根长较长并且具有更发达的根毛系统。4.就种子在高盐与干旱胁迫下发芽率的统计,根长的测量以及成苗期存活率方面,超表达GhSPO11-3对非生物胁迫表现出更强的耐性。深入研究表明,超表达GhSPO11-3可以通过增强诱导活性氧清除相关基因的转录水平以及活性氧清除酶活性降低氧化损害,同时促进胁迫相关基因的高水平表达以及具有降低的植株叶片气孔密度,气孔开率等减缓胁迫对植株造成的损害。

关键词：核内复制拓扑异构酶VI GhSPO11-3基因生长发育非生物胁迫

棉花调控细胞核内复制基因GaTOP6B在耐干旱胁迫中的功能研究

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棉花调控细胞核内复制基因GaTOP6B在耐干旱胁迫中的功能研究

作者：范竹萱郑州大学

学位级别：硕士

植物在生长过程中,基因组不断复制但不进行有丝分裂而导致细胞倍性水平升高的过程称为核内复制。核内复制通过细胞、代谢和遗传效应在生理及发育过程中起重要作用。干旱被认为是导致全球作物产量大幅减少的不利条件之一,因此鉴定出调节... 详细信息

植物在生长过程中,基因组不断复制但不进行有丝分裂而导致细胞倍性水平升高的过程称为核内复制。核内复制通过细胞、代谢和遗传效应在生理及发育过程中起重要作用。干旱被认为是导致全球作物产量大幅减少的不利条件之一,因此鉴定出调节抗旱性相关的新型遗传因子可能是提高作物生产力的先决条件。与其他常见作物相比(如小麦和玉米等),棉花被认为是一种适应干旱胁迫先驱作物,这在一定程度上为我们提供了一个极好的模式植物,来描述植物中调节耐旱性的潜在新基因。在本研究中,我们从亚洲棉中发现了编码DNA拓扑异构酶ⅥB亚基的GaTOP6B基因,其参与调控细胞的核内复制过程,同时还影响植物对干旱的响应。本实验中使用了病毒诱导基因沉默(ⅥGS)技术降低亚洲棉中GaTOP6B的表达,还通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动GaTOP6B在拟南芥中超表达,分析GaTOP6B对细胞核内复制和植物耐旱性的潜在影响。结果如下:1、从亚洲棉分离出AtTOP6B同源基因并命名为GaTOP6B。GaTOP6B的ORF长2010 bp,编码669个氨基酸。其蛋白序列含有GHKL、H2TH和Transducer三个高度保守的结构域,除棉属外,与可可、长果黄麻在进化上亲缘关系最近。2、在亚洲棉的根茎叶中均有GaTOP6B基因的表达,叶中的表达量最高。洋葱表皮的亚细胞定位显示GaTOP6B定位于细胞核上。3、将亚洲棉中GaTOP6B基因通过ⅥGS技术降低表达量后,植株表现出矮小的症状。流式细胞术检测显示其核内复制水平降低并伴随着核体积的减小。此外,断水20天后,GaTOP6B沉默的亚洲棉叶片表现出更加萎蔫的状态,其脯氨酸、叶绿素含量及抗氧化酶活性降低,丙二醛含量增加,气孔开度较大并伴随着较低的叶片相对含水量和较高的失水率。胁迫相关基因P5CS,RD22,DREB1A,NCED3的表达水平降低。4、超表达GaTOP6B的转基因拟南芥与野生型相比有着较高的生长活性。流式细胞术检测显示其核内复制水平较高并伴随着核体积的增大。断水14天后,转基因拟南芥萎蔫症状不明显,其脯氨酸含量较野生型拟南芥高。气孔先于野生型拟南芥闭合并伴随着较高的叶片相对含水量和较低的失水率。胁迫相关基因RD29,NCED3,COR15A,DREB1A的表达水平升高。5、超表达GaTOP6B的转基因拟南芥叶片的转录组数据显示,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥中的基因有着较高的转录活性。在200 mM的甘露醇处理后,转基因拟南芥中的差异基因主要与代谢相关,其编码蛋白质并在胁迫耐受中起作用,包括植物防御素、细胞壁生物合成、海藻糖生物合成和谷胱甘肽代谢等,通过诱导生理、生化如增强的防御、细胞壁增厚、渗透调节和清除ROS来提高转基因拟南芥的耐旱性。

关键词：拓扑异构酶ⅥB亚基核内复制干旱胁迫亚洲棉拟南芥