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用发根农杆菌介导转化的方法探究木豆耐铝基因的特性

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用发根农杆菌介导转化的方法探究木豆耐铝基因的特性

作者：冼芸轩广西大学

学位级别：硕士

在亚洲国家中酸性土壤中,豆类作物的栽培非常普遍,豆类作物是这些国家人口粮食的主要蛋白源,而在酸性土壤中,过量的质子和过量的铝造成的根际铝毒是豆类作物低产的主要原因,也是酸性土壤最常见的问题。为了探究豆类作物中的耐铝基因的功... 详细信息

在亚洲国家中酸性土壤中,豆类作物的栽培非常普遍,豆类作物是这些国家人口粮食的主要蛋白源,而在酸性土壤中,过量的质子和过量的铝造成的根际铝毒是豆类作物低产的主要原因,也是酸性土壤最常见的问题。为了探究豆类作物中的耐铝基因的功能,通过转基因技术,提高豆类作物的耐铝特性,本研究开发了一个高效的发根转化系统,这个方法可用于表征基因功能,调节脉冲作物的耐铝性。1.建立高效的土壤农杆菌介导烟草叶片产生根状毛系统。利用发根土壤农杆菌侵染烟草叶片,将土壤农杆菌中的重要遗传信息转导到烟草的根状毛中,其高效转导的成功率是整个研究的关键。通过插入携带待研究的目的基因克隆到T-DNA上,通过电穿孔技术将携带目的基因的T-DNA插入土壤农杆菌中,随后通过介导转化,土壤农杆菌中的Ri质粒会与携带目的基因的T-DNA共同进入烟草叶片产生的根状毛中。本研究的结果表明,利用土壤农杆菌携带三种不同的目的基因介导野生型烟草和NtSTOP1突变体烟草叶片得到根毛的概率在80%以上,目的基因插入根毛的概率在90%以上。2.得到高效的根毛转化系统后,为了进一步验证使用土壤农杆菌介导烟草根状毛与烟草植株的根系是否在生理功能上一致,通过使用两种不同形状的烟草作为介导转化的宿主进行实验,测定通过土壤农杆菌介导转化后的烟草的根毛的耐铝基因的遗传信息和有机酸分泌的情况,研究结果表明,通过土壤农杆菌介导野生型烟草和NtSTOP1突变体烟草叶片形成的根状毛的有机酸分泌水平和NtSTOP1,NtMATE,NtALS3的表达量信息与前人使用这两种性状的烟草植株实验得到的结果一致,即NtSTOP1突变体烟草根毛没有分泌有机酸的功能,在无论是否有铝胁迫的情况下,NtSTOP1和关联基因NtMATE和NtALS3的表达量水平都很低。3.高效稳定的烟草根状毛系统的应用。在木豆(Cajanuscajan(L.)中克隆得到MATE(多药有毒化合物排出)基因并用绿色荧光蛋白进行细胞融合,标记CcMATEl::sGFP,在载体pBEAB中表达后通过电穿孔技术将其插入土壤农杆菌中的迷你Ti质粒中,随后通过土壤农杆菌介导NtSTOP1突变体烟草叶片得到根状毛,通过进行观察绿色荧光蛋白的烟草根状毛来筛选转导成功的烟草根状毛来进行后续的研究。通过绿色荧光显微镜观察得到CcMATE1在根尖细胞膜的细胞质膜上表达。原本没有耐铝功能的NtSTOP1突变体烟草根状毛,通过农杆菌介导转化后携带CcMATE1基因的NtST(OP1突变体烟草根状毛根尖有机酸分泌量是对照实验有机酸分泌量的4倍。综上所述,通过土壤农杆菌介导产生根状毛的根尖生理特性与植株本身根尖的生理特性一致,通过这个方法可以高效的检测到转基因作物中的特定目的基因的细胞定位表达和生理指标。通过这个方法利用土壤农杆菌携带目的基因转导到根状毛中也可以快速的测定目的基因的功能和生理特性,相对于常规的转基因方法,利用土壤农杆菌转导模式作物产生根状毛系统来检测目的基因的功能省去了插入标记筛选基因这个步骤,更加快捷方便的测定了目的基因的功能。

关键词： NtSTOP1突变体烟草发根土壤农杆菌毛状根系统 CcMATE1 柠檬酸分泌

大豆发根转化方法的建立及GmFRD3在大豆耐铝性中的作用

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大豆发根转化方法的建立及GmFRD3在大豆耐铝性中的作用

作者：陈安乐吉林大学

学位级别：硕士

酸性土壤约占世界土壤总面积的30%，世界上约70%的潜在可耕地土壤属于酸性土壤（pH<5）。铝（Aluminium，Al）毒被认为是酸性土壤上作物产量的重要限制因子之一。酸性土壤中较高浓度的Al3+抑制了根的伸长并且限制了植物对水分和养分的... 详细信息

酸性土壤约占世界土壤总面积的30%，世界上约70%的潜在可耕地土壤属于酸性土壤（pH酸性土壤上作物产量的重要限制因子之一。酸性土壤中较高浓度的Al3+抑制了根的伸长并且限制了植物对水分和养分的吸收。许多植物通过根部分泌有机酸耐铝。跟这一特点相关的基因主要属于两个基因家族：铝诱导的苹果酸转运体(ALMT)家族和柠檬酸转运体(MATE)家族。大豆主要通过分泌柠檬酸来耐铝。大豆的GmFRD3基因属于MATE家族，但它在大豆耐Al中的作用尚未明确。为了研究大豆耐铝分子机制，本试验建立了高效的大豆发根转化方法并从大豆耐铝品种吉育70中克隆得到GmFRD3，并对它进行结构分析，并探讨了GmFRD3在大豆耐铝性中的作用。具体实验结果如下： 1.利用发根农杆菌K599建立了高效的转化方法，使用这种方法，几乎所有被侵染的大豆幼苗从开始侵染的一周后就形成发根。所形成的所有发根中转基因的发根占总数的30%-60%。 2.利用RT-PCR从大豆吉育70根尖扩增得到GmFRD3和它的启动子。GmFRD3的ORF全长1674bp，编码558个氨基酸，包含12个跨膜结构域，六个跨膜环。GmFRD3启动子ORF全长1543bp。将GmFRD3启动子在烟草叶片中进行瞬时表达，结果表明GmFRD3启动子具有启动活性。 3.构建了GmFRD3的绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体并转进拟南芥原生质体，证明GmFRD3蛋白定位于细胞膜上。 4.利用实时荧光定量PCR分析了GmFRD3的表达特性，结果表明GmFRD3在各组织中均有表达，但在根部表达量明显高于其它组织。不同时间点铝胁迫处理后，其表达量在4h开始迅速升高，在8h表达量达到最高值，然后逐渐减少，GmFRD3对铝胁迫有很强的响应。 5.将GmFRD3构建到植物过表达载体pCAMBIA3301上，将这个融合表达载体及空载转化进大豆发根。用苏木精染色并测定柠檬酸的分泌速率。和对照（野生型及空载）比较表明过表达GmFRD3基因不仅促进了转基因发根柠檬酸的分泌速率还提高了它的耐铝性。这些结果说明GmFRD3在大豆耐铝中起了重要的作用。

关键词：大豆发根转化 GmFRD3 柠檬酸分泌

铝胁迫下产生的过氧化氢影响铝敏感型黑大豆生长的生理基础与分子机制

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铝胁迫下产生的过氧化氢影响铝敏感型黑大豆生长的生理基础与分子...

作者：王琳昆明理工大学

学位级别：硕士

酸性土壤占世界可耕种土壤面积的30%,主要分布在南非、中亚和东南亚等对粮食需求量最大的发展中国家(Sasaki et al.2004).我国的酸性土壤主要分布在长江以南的热带、亚热带地区及云贵川等地,面积多达204万公顷。酸性土壤中的铝毒害是限... 详细信息

酸性土壤占世界可耕种土壤面积的30%,主要分布在南非、中亚和东南亚等对粮食需求量最大的发展中国家(Sasaki et al.2004).我国的酸性土壤主要分布在长江以南的热带、亚热带地区及云贵川等地,面积多达204万公顷。酸性土壤中的铝毒害是限制农作物生长和产量的主要因素。本研究以铝胁迫敏感型黑大豆(简称SB)为材料,探究了铝胁迫下产生的过氧化氢影响铝敏感型黑大豆生长的生理基础与分子机制。主要结果如下： 1、从SB根中提取总RNA,反转录PCR扩增获得目的基因片段14-3-3,通过TA克隆、酶切、并测序鉴定后,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-14-3-3,转化到大肠杆菌基因工程蛋白表达菌BL21中进行诱导表达,最终确定pGEX-4T-1-14-3-3重组蛋白表达的最佳诱导条件为1mM IPTG,28℃,诱导8h,且SDS-PAGE检测蛋白表达形式以可溶性表达为主,通过GST亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,获得相对较纯的目的重组蛋白,浓度1mg/mL,总含量为4mg,并且利用纯化的重组蛋白制备得到抗体。 2、通过用H2O2或铝单独处理、用H2O2的清除剂ASA、ABA合成抑制剂钨酸钠(sodium tungstate)、NADPH氧化酶抑制剂DPI分别与铝胁迫同时处理SB根,测定根RRG和H202的含量及分泌柠檬酸的水平,得出了SB对铝的敏感性和H202含量的相关性,H202含量的增加与需要增加ABA的合成及NADPH氧化酶活性,铝胁迫下SB根中H202的产生和积累与柠檬酸分泌的相关性。同时分析SB根质膜ATP酶和14-3-3蛋白表达水平、质膜ATP酶磷酸化水平及其与14-3-3蛋白互作水平、质膜ATP酶的活性,考察铝胁迫下SB根中H202含量和质膜H+-ATP酶磷酸化水平及其与14-3-3蛋白互作水平、质膜H+-ATP酶的活性相关性。 3、通过用质膜H+-ATP酶的激活剂FC和MgCl2与铝同时处理SB根,测定SB根RRG、H2O2的含量和柠檬酸分泌量,同时分析SB根质膜ATP酶和14-3-3蛋白表达水平、质膜ATP酶磷酸化水平及其与14-3-3蛋白互作水平、质膜ATP酶的活性,验证了铝胁迫SB根中H2O2的积累影响质膜ATP酶活性和柠檬酸分泌的分子机理。 4、通过预实验确定H202预处理的最佳浓度为1μmol·L-1,然后用最佳浓度的H202预处理SB诱导抗氧化酶的表达,然后再用铝胁迫处理SB根,测定SB根RRG、H2O2的含量和柠檬酸分泌量,同时分析SB根质膜ATP酶和14-3-3蛋白表达水平、质膜ATP酶磷酸化水平及其与14-3-3蛋白互作水平、质膜ATP酶的活性,进一步验证验证铝胁迫SB根中H2O2的积累影响质膜ATP酶活性和柠檬酸分泌的分子机理。

关键词：铝敏感黑大豆铝胁迫质膜H+-ATPase 柠檬酸分泌过氧化氢

铝胁迫下大豆GmAACT1和GmALF5基因的功能分析

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铝胁迫下大豆GmAACT1和GmALF5基因的功能分析

作者：李莎吉林大学

学位级别：硕士

酸性土壤(pH≤5.5)是全世界农业生产的重要限制因素之一，全球大约30%的陆地面积都为酸性土壤，而可用于耕作的土壤面积有40%都是酸性的。在酸性土壤中，当pH降到5或更低时，铝会以Al3+形式抑制植物的生长和发育(Kinraide等,1989)。所... 详细信息

酸性土壤(pH≤5.5)是全世界农业生产的重要限制因素之一，全球大约30%的陆地面积都为酸性土壤，而可用于耕作的土壤面积有40%都是酸性的。在酸性土壤中，当pH降到5或更低时，铝会以Al3+形式抑制植物的生长和发育(Kinraide等,1989)。所以，对于酸性土壤植物铝毒害是引起作物产量降低，质量下降的主要原因之一。大多数植物已经形成了不同的耐铝机制，其中最重要的是根系分泌有机酸螯合铝毒，研究比较多的有机酸转运体家族主要有ALMT（苹果酸转运体）家族和MATE（柠檬酸转运体）家族。本实验以大豆耐Al品种吉育70为研究材料，通过Infusion技术克隆获得MATE家族中的GmAACT1和GmALF5基因，并采用发根农杆菌注射大豆的方法研究其功能，以图进一步明确这两个基因在大豆耐铝中的作用机制。主要实验结果如下： 1.从吉育70品种中提取RNA和DNA，克隆得到GmALF5基因，GmAACT1基因及其启动子序列。GmALF5基因ORF长1476bp，GmAACT1基因ORF长1662bp。两基因分别编码491和553个氨基酸，并分别具有12和9个跨膜结构域。选取的GmAACT1启动子序列长度为1500bp，通过在大豆发根中瞬时表达分析，GmAACT1启动子具有启动活性。 2.30μM Al3+处理0h、2h、4h、6h、12h、24h后，利用荧光定量PCR对耐Al大豆品种（吉育70）和Al敏感品种（吉育62）根中的GmAACT1和GmALF5基因进行转录表达水平分析。在吉育70中，两个基因都在Al处理2h表达量达到最高，4h开始下降。GmAACT1基因2h表达量为无Al处理的3.3倍，而GmALF5基因2h表达量为无Al处理的8倍多。在吉育62中，GmAACT1基因0h表达量为吉育70的0.4倍，虽在4h表达量达到最高，但在整个Al处理过程中表达量都较耐Al品种吉育70低。而GmALF5基因0h的表达量与吉育70无明显差异，但在Al处理4h表达量快速上升，为无Al处理下的25倍，在整个Al处理过程中都要比耐Al品种吉育70的表达量要高。表明在Al胁迫下，GmAACT1和GmALF5基因在大豆耐Al品种和Al敏感品种中的表达存在差异，但对Al胁迫都存在一定的响应。 3.通过Gateway方法将GmAACT1和GmALF5基因成功构建到绿色荧光蛋白(GFP)载体上，提取拟南芥叶片中原生质体进行转化，亚细胞定位结果表明，GmAACT1和GmALF5蛋白都定位在细胞膜上。 4.采用发根农杆菌转化方法将GmAACT1和GmALF5基因与载体pCAMBIA3301形成的融合表达载体注射到大豆子叶节中，对转化后的发根进行柠檬酸分泌速率测定和苏木精染色分析。过表达GmAACT1基因可以提高Al诱导的大豆发根柠檬酸的分泌速率，其分泌速率为野生型的7.5倍，空载的3倍。据此推测GmAACT1基因属于MATE柠檬酸转运体家族成员。与野生型及空载相比，过表达GmALF5基因，大豆发根的柠檬酸分泌量没有明显变化。苏木精染色结果表明，过表达GmAACT1和GmALF5基因对大豆的Al毒害有一定的缓解作用。上述结果说明，这两个基因可能在大豆耐Al性中起着一定的作用，但作用机制仍需进一步探究。

关键词：大豆 GmAACT1 GmALF5 发根转化柠檬酸分泌

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两种苜蓿对低磷胁迫的响应和生理适应机制

两种苜蓿对低磷胁迫的响应和生理适应机制

作者：高艳内蒙古农业大学

学位级别：硕士

土壤有效磷低是限制植物生长的主要因素之一。植物在长期的进化过程中,形成了多种适应低磷胁迫的策略,主要包括根系形态改变,根系分泌有机酸、质子和酸性磷酸酶,以及磷转运蛋白活性的增加。苜蓿为喜磷植物,土壤有效磷缺乏是制约我国许... 详细信息

土壤有效磷低是限制植物生长的主要因素之一。植物在长期的进化过程中,形成了多种适应低磷胁迫的策略,主要包括根系形态改变,根系分泌有机酸、质子和酸性磷酸酶,以及磷转运蛋白活性的增加。苜蓿为喜磷植物,土壤有效磷缺乏是制约我国许多地区苜蓿生产的重要因素。黄花苜蓿作为我国重要的优良豆科牧草,具有耐低温、干旱和盐碱的特性,但黄花苜蓿对低磷胁迫响应和适应特征尚未见报道。本论文以我国北方的重要豆科牧草黄花苜蓿和豆科模式植物蒺藜苜蓿为实验材料,采用砂培和营养液培养方法,对比了两种苜蓿对低磷胁迫的适应策略。已有研究报道“胁迫激素”乙烯与低磷胁迫密切相关。因此,本研究进一步探讨了乙烯在低磷胁迫诱导根系有机酸分泌中的作用。主要研究结果如下: 1.黄花苜蓿和蒺藜苜蓿对低磷胁迫的适应策略不同。低磷胁迫下,黄花苜蓿主要通过根系大量分泌柠檬酸和增强根际酸化能力,活化根际难溶态磷来提高对磷的吸收。由于根系有机酸的大量分泌,使碳水化合物流失,所以用于根系生长的同化物减少,导致黄花苜蓿根系生长受抑制;由于蒺藜苜蓿根系分泌柠檬酸的能力相对较弱,分配到地下部的同化物主要用于根系生长,维持较大的磷吸收面积,从而有利于其适应低磷胁迫。 2.低磷处理诱导蒺藜苜蓿根系合成大量乙烯。乙烯合成前体ACC显著增加了蒺藜苜蓿根系柠檬酸分泌。但乙烯合成抑制剂（AVG和CoCl2）不能抑制低磷诱导的柠檬酸分泌增加。乙烯不敏感突变体sickle在低磷处理下根系分泌柠檬酸量显著增加,这与蒺藜苜蓿野生型的表现相同。这些结果表明,乙烯可能与蒺藜苜蓿对低磷胁迫的响应存在某种关系,但乙烯并未直接参与低磷诱导苜蓿根系分泌柠檬酸的过程。

关键词：低磷胁迫黄花苜蓿蒺藜苜蓿柠檬酸分泌乙烯

铝胁迫下过氧化氢对大豆耐铝性的调控及其与水杨酸信号互作关系的研究

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铝胁迫下过氧化氢对大豆耐铝性的调控及其与水杨酸信号互作关系的...

作者：孔令楠吉林大学

学位级别：硕士

世界上约50%的潜在可耕地土壤为酸性(pH<5.0)。铝(Al)毒是酸性土壤上影响作物产量的主要限制因子之一。根尖是植物感应Al并产生应激反应的主要部位。Al胁迫条件下根系有机酸的分泌被认为是植物最重要的耐Al机理之一，但其调控机制目前... 详细信息

世界上约50%的潜在可耕地土壤为酸性(pH酸性土壤上影响作物产量的主要限制因子之一。根尖是植物感应Al并产生应激反应的主要部位。Al胁迫条件下根系有机酸的分泌被认为是植物最重要的耐Al机理之一，但其调控机制目前仍未明确。过氧化氢(HO)参与植物体内多种生理生化过程，近年来关于HO增强植物对各种非生物和生物胁迫抗性方面的功能得到了广泛关注。水杨酸(SA)作为植物体内一种重要的信号分子，在植物抗生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要作用。本实验室前期试验研究证明，Al能诱导大豆根尖内源SA含量的增加，SA作为一种信号分子参与了大豆根系柠檬酸的代谢与运输，缓解Al诱导的大豆根尖氧化胁迫，在大豆耐Al过程中起着重要作用。本试验以大豆耐Al品种吉育70为试验材料，研究了Al胁迫下HO预处理对大豆耐Al性的调控，并进一步研究其与SA信号分子的互作关系。首先从Al胁迫下外源HO预处理对大豆根伸长、根尖Al含量、丙二醛(MDA)含量、根系柠檬酸分泌速率及相关转运体基因定量表达等方面的影响，探讨了HO对大豆耐Al性的调控;从抗氧化系统方面研究了Al胁迫下HO与SA信号分子的互作关系，为进一步揭示大豆耐Al机理以及耐Al性状的遗传改良提供了理论依据。取得的实验结果主要有： 1.过氧化氢对大豆耐铝性的调控外源HO能缓解Al对根伸长的抑制作用，且在低浓度(10μM)时效果最显著，同时降低了Al在根尖中的积累。此外，10μM HO预处理能通过降低内源HO和丙二醛(MDA)含量，来缓解Al毒引起的氧化胁迫。Al胁迫条件下HO预处理在前期能增加Al诱导大豆根系柠檬酸的分泌，并提高了大豆柠檬酸转运体Gm-MATE1基因的转录表达水平。上述结果表明，HO可能在Al胁迫诱导的柠檬酸运输过程中起着重要的调控作用。 2. Al胁迫下HO与SA信号互作关系的研究 Al胁迫下，外源SA可诱导大豆根尖内源HO的快速积累，且在6h处达到峰值，但随着处理时间的延长(9，12h)内源HO反而下降;Al胁迫条件下，利用外源HO进行预处理，内源自由态SA含量只在6h处稍有增加，其余时间点均没有明显变化，内源结合态SA(SAG)含量也没有发生显著变化， SA合成关键酶PAL的活性也没有显著性影响。上述结果说明，Al胁迫下HO可能参与并作为SA信号转导途径的下游信号分子对大豆耐Al性进行调控。 SA通过调控抗氧化系统相关酶活性，降低了Al诱导的氧化胁迫伤害，从而缓解了Al毒。而施加过氧化氢清除剂(DMTU)可逆转SA对抗氧化系统酶APX、SOD的调控作用，CAT除外。而Al胁迫下外源HO预处理也可提高APX与SOD的活性，但对CAT活性没有显著影响。这与DMTU逆转SA调控的APX、SOD活性相一致，进一步证明了Al胁迫条件下HO参与介导了SA对抗氧化系统的调控。综上结果表明，HO可能参与了SA调控大豆耐Al的信号转导途径，并作为该信号转导途径的下游信号分子对大豆耐Al性进行调控。

关键词：铝过氧化氢水杨酸信号转导柠檬酸分泌抗氧化系统大豆