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来航鸡FOXL2蛋白单克隆抗体的制备

中国免疫学杂志 2013年第7期29卷 750-754页

作者：鲁毅徐萍李任峰李超英李学斌王三虎陈明艳刘卫邓佳霖河南科技学院动物科学院新乡453003 河南科技学院新科学院.新乡453003 新乡医学院实验动物中心新乡453003

目的:制备来航鸡FOXL2蛋白的单克隆抗体。方法:利用生物信息学的方法分别预测来航鸡FOXL2蛋白最有可能的线性表位,并人工合成多肽,高效液相色谱分析其纯度,与KLH偶联后免疫小鼠制备其单克隆抗体,用间接ELISA方法和免疫印迹进行筛选,然... 详细信息

目的:制备来航鸡FOXL2蛋白的单克隆抗体。方法:利用生物信息学的方法分别预测来航鸡FOXL2蛋白最有可能的线性表位,并人工合成多肽,高效液相色谱分析其纯度,与KLH偶联后免疫小鼠制备其单克隆抗体,用间接ELISA方法和免疫印迹进行筛选,然后对筛选出来的细胞株进行一般性质测定、亲和常数测定、IC50测定。结果:合成多肽纯度>95%,细胞融合后,其平均融合率为75%,并用间接ELISA方法和Western blot筛选出1条可与FOXL2蛋白发生明显反应的细胞株C2;经测定,C2细胞株上清效价为1/128,腹水效价为1/256,其亚型属于IgG1,杂交瘤细胞染色体为102条,腹水单抗的蛋白含量为1.576 g/L,其亲和常数为2.12×106L/mol,IC50值为0.082 47μg/L。结论:成功制备了FOXL2蛋白单克隆抗体,为下一步深入研究FOXL2蛋白奠定基础。

关键词：来航鸡 FOXL2 单克隆抗体表位

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来航鸡FOXL2基因的克隆与原核表达

中国兽医学报 2013年第4期33卷 622-626页

作者：徐萍李任峰赵坤鲁毅王三虎河南科技学院动物科学学院河南新乡453003

根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体。将携带有重组原... 详细信息

根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过0.5mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为37 000,与预期表达蛋白大小一致。Western blot-ting检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：来航鸡 FOXL2基因克隆原核表达

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来航鸡FOXL2蛋白的生物信息学分析

生物技术 2012年第2期22卷 43-46页

作者：鲁毅李任峰徐萍李学斌王三虎河南科技学院动物科学院河南新乡453003

目的:预测来航鸡FOXL2蛋白的结构和功能。方法:生物信息学方法预测来航鸡FOXL2蛋白的组成,基本性质、同时构建其编码产物的系统进化树,并对其抗原表位进行预测。结果:该条氨基酸残基中脯氨酸含量最多,分子量为33 504.8,半衰期为30h,理... 详细信息

目的:预测来航鸡FOXL2蛋白的结构和功能。方法:生物信息学方法预测来航鸡FOXL2蛋白的组成,基本性质、同时构建其编码产物的系统进化树,并对其抗原表位进行预测。结果:该条氨基酸残基中脯氨酸含量最多,分子量为33 504.8,半衰期为30h,理论等电点为9.04,分子式为C1488H2269N425O432S15,在细胞核内发挥作用,可能具有转录和转录调控功能,与红原鸡的同源性最高,其最有可能的抗原表位位于37-49、82-91、133-147个氨基酸之间。结论:利用生物信息学方法预测其功能和结构,为对其下一步研究奠定基础。

关键词：来航鸡 FOXL2 生物信息学

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来航鸡FOXL2基因的克隆与序列分析

黑龙江畜牧兽医 2012年第5期 5-9页

作者：徐萍李任峰赵坤王三虎何宏轩鲁毅河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 中国科学院动物研究所北京100101

为了研究来航鸡FOXL2基因的结构及功能,根据GenBank上登录的红色原鸡FOXL2基因序列设计引物,对来航鸡FOXL2基因进行了克隆、测序,并对该序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆得到的来航鸡FOXL2基因全长为1 130 bp(GenBank登录号为JF70... 详细信息

为了研究来航鸡FOXL2基因的结构及功能,根据GenBank上登录的红色原鸡FOXL2基因序列设计引物,对来航鸡FOXL2基因进行了克隆、测序,并对该序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆得到的来航鸡FOXL2基因全长为1 130 bp(GenBank登录号为JF708868),包含1个918 bp的完整开放式阅读框,编码305个氨基酸,其CDS编码区的核苷酸序列与红色原鸡、人、牛、野猪、家鼠、欧洲兔、蟾蜍、斑马鱼及罗非鱼的FOXL2基因对应序列的同源性分别为99.8%、80.0%、80.4%、80.3%、80.5%、81.5%、77.7%、71.8%、75.5%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.7%、64.7%、64.7%、65.4%、63.5%、63.8%、79.7%、78.3%、79.9%;FOXL2编码蛋白主要存在于细胞核中,存在1个保守结构域,不含信号肽、跨膜结构域和剪切位点,并存在2个蛋白质激酶C磷酸化位点、1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、2个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个N-豆蔻酰化位点,预测最佳抗原表位候选区域为45～49位(SQKPP)、147～152位(RPPPTH)和169～173位(SPPKY)。

关键词：来航鸡 FOXL2基因克隆序列分析

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来航鸡淋巴器官的组织学观察

中国兽医杂志 1992年第8期18卷 16-18页

作者：张登荣王世英刘永爱王绥华河北农大邯郸分校牧医系永年057150

1975年Mueller.J.在低温恒冷切片上用显示酸性非特异性酯酶(简称ANAE)的方法发现酯酶阳性淋巴细胞与T淋巴细胞一致。

关键词：来航鸡鸡淋巴器官组织学

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来航鸡FOXL2基因的克隆与原核表达

来航鸡FOXL2基因的克隆与原核表达

作者：徐萍河南科技学院

学位级别：硕士

性别决定和性别分化对于家禽生产具有十分重要的意义。FOXL2是位于常染色体的单外显子转录因子,也是最早发现的哺乳动物的卵巢分化标记,对卵巢发育和维持具有十分重要的作用。利用基因工程技术获得有生物学活性的重组来航鸡FOXL2蛋白,... 详细信息

性别决定和性别分化对于家禽生产具有十分重要的意义。FOXL2是位于常染色体的单外显子转录因子,也是最早发现的哺乳动物的卵巢分化标记,对卵巢发育和维持具有十分重要的作用。利用基因工程技术获得有生物学活性的重组来航鸡FOXL2蛋白,对研究FOXL2基因在鸡胚胎性别分化和性腺发育中的作用具有重要的意义。本研究根据GenBank上登录的红原鸡FOXL2基因序列(登录号:NM01012612.1),设计合成了2对引物(P1-P2和eP1-eP2)。提取纯系SPF来航鸡全血DNA,通过PCR扩增、测序得到了来航鸡FOXL2全长基因片段,并将其与pMD18-T载体连接,获得重组克隆质粒pMD18-T-FOXL2。测序结果显示,克隆的目的序列中包含了来航鸡FOXL2全基因,表明已成功构建了 pMD18-T-FOXL2质粒。利用生物信息学软件对来航鸡FOXL2基因序列进行预测分析。结果表明来航鸡FOXL2基因全长1130 bp(登录号:JF708868),包含一个918 bp的完整开放式阅读框(ORF),编码305个氨基酸,其CDS编码区的核苷酸序列与红原鸡、人、牛、野猪、家鼠、欧洲兔、蟾蜍、斑马鱼及罗非鱼的FOXL2基因对应序列的一致性分别为99.8%、80.0%、80.4%、80.3%、80.5%、81.5%、77.7%、71.8%、75.5%,推导的氨基酸序列一致性分别为99.7%、64.7%、64.7%、65.4%、63.5%、63.8%、79.7%、78.3%和79.9%。该编码蛋白主要存在于细胞核,存在1个保守结构域,不含信号肽、跨膜结构域和剪切位点,存在2个蛋白质激酶C磷酸化位点,1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点,2个N-糖基化位点,4个N-豆蔻酰化位点和3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,预测最佳抗原表位候选区域为37-49位(KGPEKPDPSQKPP)、82-91 位(PFYEKNKKGW)和 133-147位(KGNYRRRRRMKRPFR)。以pMD18-T-FOXL2为模板,经PCR扩增带有酶切位点的FOXL2基因,定向克隆到原核表达载体pET28a中,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳和Western blot检测,显示诱导表达蛋白大小约为37 ku,与预期表达蛋白大小一致,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。FOXL2基因的克隆与表达为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：来航鸡 FOXL2基因克隆生物信息学分析原核表达

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来航鸡FOXL2基因的真核表达及蛋白纯化

来航鸡FOXL2基因的真核表达及蛋白纯化

作者：刘静河南科技学院

学位级别：硕士

FOXL2是第一个被认定在维持卵巢功能方面发挥重要作用的人类常染色体基因，也是在脊椎动物中最早被发现的卵巢分化的性别二态性标记。FOXL2基因不但在抗击卵泡凋亡、维持卵巢储备功能方面发挥着重要作用，而且其正常表达与否可能与鸡产... 详细信息

FOXL2是第一个被认定在维持卵巢功能方面发挥重要作用的人类常染色体基因，也是在脊椎动物中最早被发现的卵巢分化的性别二态性标记。FOXL2基因不但在抗击卵泡凋亡、维持卵巢储备功能方面发挥着重要作用，而且其正常表达与否可能与鸡产蛋性能的高低有关。目前，随着人们对FOXL2功能研究的逐渐深入，FOXL2蛋白的需求量也不断增大，但是市场上现有的FOXL2产品存在少而贵的特点，不能很好的满足于应用。基于此不足，本实验室曾采用大肠杆菌表达体系对来航鸡FOXL2基因进行了表达，但蛋白量较少且活性低。故本研究利用酵母菌表达系统对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化，以期获得大量的高活性表达蛋白。本研究根据GenBank上收录的来航鸡FOXL2的全基因序列（登录号：JF＿708868.1），通过生物信息学比对分析其保守序列及真核表达载体的多克隆酶切位点，利用Primmer5.0来设计合成一对引物P1、P2。以纯系SPF来航鸡全血DNA为模板，经PCR扩增带有酶切位点的FOXL2基因，并将其与pMD18-T载体连接，获得重组克隆质粒pMD18-T-FOXL2。再以pMD18-T-FOXL2为模板，经PCR扩增带有酶切位点的FOXL2基因，定向克隆到真核表达载体pPICZaA中，构建pPICZaA-FOXL2重组真核表达载体。用SacI将重组pPICZaA-FOXL2线性化后，电转GS115毕赤酵母菌。28℃培养5d，PCR鉴定和测序正确后，进行高拷贝子筛选，将筛选到的高拷贝转化子加甲醇28℃诱导表达96h。应用SDS-PAGE和Western blot方法分析重组蛋白的表达情况，鉴定重组蛋白的抗原特异性，然后采用His镍柱亲和层析获得重组蛋白的纯化产物。研究结果表明，成功扩增出来航鸡FOXL2基因，经PCR、双酶切和测序结果比对分析未发生氨基酸突变现象，成功构建了重组克隆载体和表达载体。重组表达质粒转入毕赤酵母菌后经甲醇诱导，由于重组蛋白以胞外分泌的形式进行表达，取上清SDS-PAGE分析显示，表达出与预期大小相一致的目的蛋白条带，其分子量为37kD。Western-blot鉴定结果显示，重组蛋白能被His标签单抗所识别，具有良好的反应原性。重组蛋白经纯化后，分别得到浓度为1.2mg/mL重组目的蛋白。FOXL2基因的克隆、表达及纯化为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：来航鸡 FOXL2基因克隆真核表达纯化

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单冠白来航鸡育成阶段组织与器官的生长分析

中国家禽 1994年第6期16卷 23-26页

作者：刘雨龙山西省畜牧兽医研究所 030032

选星杂２８８蛋鸡地初生和２－２０周龄期间，每隔两周的分性别解剖３或４只鸡（重复测定４次），分析和测量了羽毛，皮，肌肉，骨骼，内脏（指心，肝，脾，肺，肾和胰脏合计），全消化道，脑，腔上囊和血重。结果，①蛋鸡育成阶段（０... 详细信息

选星杂２８８蛋鸡地初生和２－２０周龄期间，每隔两周的分性别解剖３或４只鸡（重复测定４次），分析和测量了羽毛，皮，肌肉，骨骼，内脏（指心，肝，脾，肺，肾和胰脏合计），全消化道，脑，腔上囊和血重。结果，①蛋鸡育成阶段（０－２０周龄）骨骼肌部重平均值约占每公斤净体重（鸡体重减少消化道内容物的个体得）的１半以上（其中公占５６２．５８克／千克净体重，母鸡占５５１．１９克／千克净体重），②羽毛，皮。

关键词：鸡来航鸡组织器宫生长率

NGF mRNA在来航鸡体内主要器官中的表达

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黑龙江畜牧兽医 2015年第7期 27-30页

作者：李四通陈玲丽安东阮涛孙相和孔令芸刘静宁红梅河南科技学院动物科学学院河南新乡453003

为了探讨神经生长因子对鸡的生长发育的影响,试验以2月龄来航鸡为试验对象,经RTPCR方法检测鸡体内主要器官中NGF mRNA的表达情况。结果表明:鸡体内主要器官中均有NGF mRNA的表达,并且在肺脏表达量最高,心脏、胰腺和胸腺次之。说明NGF在... 详细信息

为了探讨神经生长因子对鸡的生长发育的影响,试验以2月龄来航鸡为试验对象,经RTPCR方法检测鸡体内主要器官中NGF mRNA的表达情况。结果表明:鸡体内主要器官中均有NGF mRNA的表达,并且在肺脏表达量最高,心脏、胰腺和胸腺次之。说明NGF在鸡体内主要器官的广泛表达预示着NGF参与鸡体各系统的发育过程,但具体作用机制还有待深入研究。

关键词： NGF RT-PCR 表达发育来航鸡